Extracto
Antecedentes
Pacientes derivados xenoinjertos (PDXs) para cáncer de cabeza y cuello (CCC ) y otros cánceres representan plataformas de investigación de gran alcance. La mayoría de los grupos de implante de tejido del paciente en ratones inmunodeficientes inmediatamente aunque la importancia de este intervalo de tiempo es anecdótica. Pusimos a prueba la hipótesis de que el momento de la escisión del tumor de la implantación es crucial para PDX pases y establecimiento.
Métodos
Hemos examinado si el tiempo o medio de almacenamiento afectó la viabilidad de PDX pases dos establecida HNC PDXs ( UW-SCC34, UW-SCC52). Los tumores se cosecharon, almacenado en los medios de enfriado en hielo o una solución salina para 0-48 horas, y se implantaron en nuevos ratones. El crecimiento tumoral se comparó mediante ANOVA de dos vías con respecto al tiempo y condiciones de almacenamiento. Tres nuevos PDXs HNC (UW-SCC63-65) se generaron mediante el implante de tejido del paciente en ratones inmediatamente (tiempo 0) y 24 horas después de recibir el tejido de la sala de operaciones.
Resultados
cantidades similares de tumor se implantaron en cada ratón. Al final del experimento, no se observaron diferencias significativas en el peso medio del tumor entre los medios y las condiciones de almacenamiento de solución salina para UW-SCC34 o UW-SCC52 (p = 0,650 y p = 0,177, respectivamente). No hay diferencia en la prevalencia de la formación de tumores se observó sobre la base de tiempo de la cosecha de la implantación (≥13 de 16 tumores crecieron en cada punto de tiempo). El análisis histológico mostró una fuerte similitud con el tumor inicial en todos los grupos. Los tumores desarrollados, tanto en el tiempo 0 y 24 horas para la UW-SCC63 y UW-SCC64.
Conclusiones
demostrado que ni medio de almacenamiento ni el tiempo de la escisión del tumor a la implantación (hasta 48 horas) viabilidad afectado o diferenciación histológica en un pasaje posterior para dos HNC PDXs. Por otra parte, reveló que el tejido fresco paciente es viable hasta por 24 horas después de la resección. Esta información es importante ya que está relacionada con el desarrollo y la puesta en común de PDXs
Visto:. Stein AP, Saha S, Liu CZ, Hartig GK, Lambert PF, Kimple RJ (2014) Influencia de las condiciones de manipulación sobre el establecimiento y la propagación de cáncer de cabeza y cuello del paciente Derivado xenoinjertos. PLoS ONE 9 (6): e100995. doi: 10.1371 /journal.pone.0100995
Editor: Jay F. Dorsey, Universidad de Pennsylvania, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Marzo, 2014; Aceptado: June 2, 2014; Publicado: 26 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Stein et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por R00 CA160639 (RK), UWCCC y UWCCC /MIR /MED subvenciones institucionales (PL), y un ICTR- UW comunión Shapiro (AS). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Un modelo bien establecido, pero ahora re-emergente para el cáncer humano es el sistema de xenoinjertos derivados de los pacientes (PDX). PDXs se desarrollan mediante la obtención de muestras de tumores directamente de los pacientes y, posteriormente, la implantación y pases estos tumores en ratones inmunodeficientes [1]. El proceso se documentó por primera vez en 1969 cuando Rygaard y Povlsen inyectaron una suspensión de células tumorales de un paciente con cáncer de colon por vía subcutánea en ratones desnudos atímicos y ratones de control [2]. Ellos demostraron mayor crecimiento del tumor en los ratones atímicos comparado con el control, lo que lleva a la utilización de ratones inmunodeficientes convertirse en práctica común para el desarrollo PDX [3]. Recientemente, PDXs se han generado para un número de cánceres, incluyendo páncreas [4] - [6], de mama [7], pulmón [8], [9], renal [10] y de cabeza y cuello [1], [11] . Estos estudios demostraron que PDXs conservan características del tumor primario a través de pases en serie tanto en el histológico [7], [8] y [1], [7], [11] los niveles moleculares. Daniel et al. también demostró que su principal pequeña PDX cáncer de pulmón de células (sólo a pases en ratones) retuvo una mayor similitud con el tumor del paciente en comparación con una línea celular generada a partir de la misma PDX [9]. Por otra parte, nuestro grupo [1] y otros [12] tienen éxito PDXs criopreservados y reanimados en un momento posterior, el aumento de la utilidad de este modelo de sistema. Por lo tanto, PDXs representan un modelo validado y fiable para el estudio de una variedad de cánceres humanos.
Un uso potente para PDXs es la prueba de los tratamientos estándar y novedosos en un
in vivo
sistema con mayor heterogeneidad de modelos de ratones genéticamente manipulados y un microambiente tumoral más relevante que las líneas celulares [1], [4], [11]. Una vez establecidos, se amplifican PDXs
in vivo
, inyectadas en ratones numerosos, y los ratones son posteriormente estratificados en diferentes grupos de tratamiento. La capacidad de un régimen de tratamiento específico para retardar o detener el crecimiento del tumor puede ser evaluada por comparación del crecimiento medio del tumor en el tiempo para cada grupo comparado con el control (sin tratar) ratones. De esta manera, los investigadores pueden evaluar el efecto de muchas terapias alternativas en un tipo específico de tumor derivado de un único paciente. Además, las alteraciones moleculares inducidos por los diferentes tratamientos pueden ser analizados por la recolección de muestras de tumores después del tratamiento ya sea por trozos de tumor de congelación de flash en nitrógeno líquido para estudios genoma de ancho o la fijación de los tumores en formalina seguido de parafina para el análisis de biomarcadores. También se ha argumentado que este modelo de sistema se podría emplear en la terapia personalizada contra el cáncer mediante la generación de PDXs de cáncer de un paciente, poniendo a prueba una variedad de agentes quimioterapéuticos en ratones portadores de tumor y luego seleccionando un nuevo régimen de tratamiento para el paciente sobre la base de estos
en vivo
resultados [13].
Hay una serie de variaciones en los procedimientos utilizados para establecer PDXs. Por ejemplo, algunos grupos describen implantación quirúrgica de trozos pequeños (2-3 mm) de tumores en los flancos [14], mientras que otros pelos en los tumores para crear una suspensión de células y se inyecta por vía subcutánea la suspensión a través de una aguja de calibre grande [15]. Por otra parte, ciertos grupos sólo utilizan ratones desnudos atímicos [3], otros utilizan los no obesos diabéticos inmunodeficiencia combinada severa (NOD-SCID) [7] y algunos emplean ambas cepas [1]. De manera significativa, estas diferentes técnicas de todo han dado lugar al crecimiento del tumor éxito. Otro tema recurrente que surge en el desarrollo PDX es que los tumores se toman lo más rápidamente posible (como máximo dentro de 3 horas) desde el momento de la biopsia y luego inyectadas en los ratones inmunodeficientes [1], [2], [8], [10 ], [dieciséis]. Nuestro grupo y otros proceder de esta manera debido a la creencia de que el momento de la escisión del tumor de xenoinjerto implantación es importante. Sin embargo, no hay información en la literatura que sugiera que trozos tumorales deben inyectarse /implantarse tan pronto como sea posible en los ratones [17]. Además, mientras que el ratón-a-paso del ratón se realiza típicamente lo más rápidamente posible, no es nuevo, hay pocos datos que apoyan la necesidad de esta práctica.
Debido a la incertidumbre en cuanto a las técnicas de cosecha y de implantación óptimos, le realizó este estudio para determinar si había una relación en el potencial de crecimiento de la PDX basado en el tiempo de retardo de la escisión del tumor inicial hasta su última implantación en los ratones. Además, hemos tratado de determinar si el medio de almacenamiento utilizado durante el retardo de procesamiento afectada PDX viabilidad. Este trabajo es importante, ya que hay una serie de factores fuera del control del investigador que pueden influir en la capacidad de obtener biopsias de tumores de pacientes consentido de manera oportuna. Por otra parte, una vez que se establecen PDXs, reimplantación requiere la disponibilidad de los ratones receptores y su difusión a otros laboratorios pueden requerir el envío. Ambos de estos problemas pueden conducir a retrasos en la reimplantación. Nuestros resultados demuestran que el tumor es todavía viable y capaz de crecer en la próxima generación de ratones hasta al menos 48 horas después de la extirpación del tumor inicial y que la naturaleza de la solución de almacenamiento, ya sea el medio de cultivo de tejidos o una solución salina, no tiene efecto sobre el crecimiento tumoral. Además, se reveló que el tejido del paciente fresco de la sala de operaciones (OR) es viable y se puede utilizar para establecer una nueva PDX hasta al menos 24 horas después de la escisión inicial del paciente. La capacidad de retrasar la implantación del tumor tiene implicaciones importantes con respecto a la distribución de estos recursos, así como la logística de establecimiento inicial PDX y posterior mantenimiento.
Materiales y Métodos
Ratones
de seis a ocho semanas de edad de sexo masculino y gamma NOD-SCID hembra (NSG, NOD.Cg-
Prkdc
IL2Rg
tm1Wjl
/SZJ SCID) (adquirida de Jackson Laboratories) se utilizaron para PDX el desarrollo y la amplificación. Todos los ratones se mantuvieron en la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Instituto de Wisconsin aprobado por el Cuidado de Animales de Laboratorio para el Fondo para la Investigación Médica (WIMR) Cuidado de Animales. Los animales fueron alojados en habitaciones específicas libres de patógenos, y vivían en tratados en autoclave, y jaulas microisolator asépticas, con un máximo de cuatro animales por jaula. Los alimentos y el agua se proporcionaron ad libitum. Todos los estudios con los ratones se llevaron a cabo de acuerdo con un protocolo aprobado por animal de la Universidad de Wisconsin (Número de Protocolo: M02518). Durante los experimentos, el peso y la clínica de salud de cada ratón fueron evaluados sobre una base semanal.
previamente establecidos xenoinjertos derivados de los pacientes
Nuestros PDXs se derivaron de los pacientes con diagnóstico reciente o de cabeza y cuello recurrente ( HNC) que completaron un consentimiento por escrito de acuerdo con una aprobación del IRB de la Universidad de Wisconsin. Hemos descrito anteriormente en el establecimiento de nuestro modelo PDX en mayor detalle [1]. Como muestras de tumores de la O proporcionan a menudo el tejido sólo lo suficiente para la implantación en dos a cuatro ratones, los principales estudios descritos en este manuscrito utilizado PDXs establecidas a un paso temprano. Pases y la implantación de PDXs se realizó por tumores primeros cosecha de ratones GSN que llevan el tumor de interés, transfiriendo el tumor de una manera estéril a un tubo eppendorf 2,0 ml con una mezcla 01:01 de medio (medio Eagle modificado de Dulbecco con 10% fetal de suero bovino, 1% de penicilina /estreptomicina, y 2,5 mg /ml de anfotericina B) y matrigel (catálogo#354230, BD Biosciences, Inc) y picar el tumor en menos de 1 mm
3 piezas. Finalmente, la suspensión del tumor se vio envuelta en una jeringa de 1 ml a través de una aguja de calibre 18 y se inyecta por vía subcutánea en dos costados de ratones GSN.
Diseño Experimental
Dos PDXs que demostraron un crecimiento sostenido a principios de se seleccionaron pasajes (UW-SCC34 y UW-SCC52) para este experimento. El proceso se llevó a cabo por separado para los grupos de UW-SCC34 y UW-SCC52, pero un protocolo idéntico fue seguido en ambas ocasiones. En primer lugar, cuatro ratones GSN que llevan dos tumores cada uno de los PDX de interés fueron sacrificados, y un temporizador se inició cuando se confirmó la muerte. Todos los tumores fueron cosechadas a partir de los cuatro ratones al mismo tiempo. trozos tumorales agrupadas se pesan y se dividen por igual entre catorce 2,0 ml tubos Eppendorf de pre-acondicionado en el hielo: un medio que contiene siete y siete con solución salina. Además, un trozo tumor (referido como la muestra pre-implantación) se fijó en 10% de formalina tamponada neutra durante 48 horas y embebidos en parafina para el análisis histológico posterior. A continuación, un tubo de medios de comunicación + tumor y un tubo de solución salina + tumor se retiraron del hielo. Cada trozo de tumor se transfirió a su propia, nuevo tubo con una mezcla 01:01 de medio fresco y matrigel, picada en 1 mm
3 piezas, y se inyecta en cuatro flancos de dos ratones del GSN (n = 8). El tiempo se registró después de los cuatro ratones fueron inyectados (Tiempo 0, 40 minutos). De esta manera, terminamos con dos grupos en este punto en el tiempo: "Hora 0 Medios" y "Hora 0 Saline". Ambos grupos se componen de dos ratones GSN cada uno con cuatro sitios de inyección. Por lo tanto, cada grupo tenía el potencial para desarrollar ocho tumores (Figura 1). Este proceso se repitió a 1, 2, 4, se inició 8, 24, y 48 horas después de que el temporizador. En el ínterin, los tumores en los medios de comunicación o solución salina se mantuvieron a 4 ° C.
Diagrama
de flujo que representa la configuración experimental.
Los tumores se dejaron crecer durante 3 semanas para la UW SCC34 y 6 semanas para UW-SCC52. La duración del crecimiento del tumor fue dictada por la cinética de crecimiento de tumor y la salud de los ratones. Al final de cada experimento, se recogieron los tumores de todos los ratones, se pesaron, y se fotografiaron (tumores recogidos de 1 y 2 días más tarde para los grupos de 24 horas y 48 horas, respectivamente). Cada tumor se fijó en formol al 10% tamponado neutro durante 48 horas y luego embebidos en parafina. Un tumor fue seleccionado al azar de cada uno de los catorce grupos para su posterior análisis histológico
Histología
tumor bloques se seccionaron (5 micras) y hematoxilina y eosina (H & amp; E). Manchas se llevaron a cabo en cada quinta sección. Todas las diapositivas fueron imágenes en un microscopio Olympus BX51 (Olympus America, Inc). Se realizaron comparaciones entre la histología de la muestra antes de la implantación y los tumores que crecen en la próxima generación de ratones GSN. También se evaluó el similitud en la histología de los tumores a través de los catorce grupos diferentes dentro de los dos experimentos. Un patólogo certificado por la junta que se especializa en enfermedades de la cabeza y el cuello (CZL) llevó a cabo el análisis histológico para definir la diferenciación, la queratinización, la necrosis /cambio quística y al modelo de infiltración para cada tumor.
xenoinjertos Nuevos derivados de los pacientes
una vez que se determinó que ni el tiempo de la escisión de la reimplantación ni medio de almacenamiento afectados crecimiento PDX en un paso posterior, se realizó una variación de este experimento utilizando tejido fresco paciente desde el quirófano. Tres nuevos pacientes con HNC se dieron su consentimiento para donar tejidos para el establecimiento PDX (UW-SCC63, UW-SCC64, UW-SCC65). Debido a la pequeña cantidad de tumor que recibimos de la O, sólo puede haber dos grupos para estos experimentos. Por lo tanto, nos hemos centrado en el factor tiempo para el establecimiento inicial PDX. Cuando recibimos el tejido fresco paciente, se pesa y se distribuye uniformemente en dos tubos con los medios de comunicación. Para un tubo, se añadió inmediatamente matrigel y el tumor se picó y se inyecta en cuatro flancos de dos ratones del GSN (n = 8, Tiempo 0). El otro tubo (con tumor y medios de comunicación) se almacenó a 4 ° C durante 24 horas. A continuación, el tumor se transfirió a un nuevo tubo con medio fresco y matrigel, y el tumor se picó y se inyectó en cuatro sitios de dos ratones del GSN (n = 8, 24 horas). Este mismo proceso se repitió para las tres nuevas muestras de pacientes.
Después de nueve semanas, el crecimiento del tumor se evaluó y se comparó entre el tiempo 0 y grupos de 24 horas para cada nuevo PDX. Sólo UW-SCC64 tenía tumores en un tamaño apropiado para los pases. Por lo tanto, todos los ratones en el experimento UW-SCC64 fueron sacrificados, y se extirparon, se pesaron y se fotografiaron (tumores recogidos 1 día más tarde para el grupo de 24 horas) de los tumores. Para UW-SCC63 y UW-SCC65, los ratones fueron palpados para el crecimiento tumoral en cada lugar de la inyección.
Análisis estadístico
powered este estudio para detectar una diferencia en la viabilidad PDX entre la primera y la última puntos de tiempo (tiempo 0 y 48 horas, respectivamente). No existe ninguna información en la literatura sobre el efecto del tiempo sobre PDX viabilidad y crecimiento, por lo que no tenían ninguna información que guíe nuestra estimación de la diferencia que esperábamos ver entre estos grupos. Por lo tanto, una estimación conservadora que habría una disminución del 50% en la formación de tumores a las 48 horas, en comparación con el tiempo 0. Para detectar una disminución del 50% en la formación de tumores en un nivel de significación de 0,05 y una potencia de 0,80, se calculó un tamaño de muestra de 8 por grupo [18]. Con el fin de evaluar el efecto del medio de almacenamiento, así, que requiere un tamaño de muestra de 8 en cada punto de tiempo, tanto para los medios de comunicación y grupos de solución salina.
Para los experimentos de UW-SCC34 y UW-SCC52, todos los tumores se pesaron individualmente en el extremo. Los pesos de los tumores obtenidos para estos PDXs de los dos medios de crecimiento (medios de comunicación y solución salina) se resumieron mediante estadísticas descriptivas incluyendo la media y la desviación estándar. pesos de los tumores a través de los dos medios de crecimiento se compararon mediante la prueba F Snedecor de un análisis de dos vías de modelo de varianza (ANOVA) que incluye el tiempo como un factor. Por lo tanto este modelo ajustado para el tiempo cuando la muestra fue implantado en el ratón. La diferencia en los pesos de los tumores de medias entre los medios de comunicación y muestras de medio de crecimiento de solución salina se calculó con un intervalo de confianza del 95%. Estos análisis estadísticos se realizaron con SAS versión 9.2.
Para los experimentos de PDX de reciente creación, todos los tumores se cosecharon y pesaron de la Universidad de Wisconsin-SCC64 PDX. Los pesos tumorales para el Tiempo grupos 0 y 24 horas se compararon mediante una prueba t de dos muestras con desviaciones estándar iguales. Este análisis se realizó utilizando GraphPad Prism v6.0d. Para todos los análisis estadísticos un valor de p inferior a 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
Ratones
Al inicio del estudio, los ratones pesaron un promedio de 22,8 gramos (g) (rango de 19,0 g-26,8 g). Ellos estaban libres de cualquier microorganismo y que no habían sido sometidos a ningún tratamiento o ensayo previo.
pesos de los tumores pre-implantación
Para reducir al mínimo las diferencias en la cantidad de tumor implantado en todos los grupos, primero tumores distribuidos de tal manera que pesos iguales se inyectaron en los ratones en cada punto de tiempo y para cada condición de almacenamiento (Figura 1). A los catorce grupos UW-SCC34, el medio del tumor antes de la implantación pesaba 0,0906 g (rango de 0,0816 g-0,1027 g), y para UW-SCC52 la media fue de 0,1298 g (0,1116 g-gama 0,1487 g). Como se muestra por los diagramas de caja de las figuras 2A y 2B, no hubo valores atípicos entre los pesos de los tumores antes de la implantación de los catorce grupos en ninguno de los experimentos.
(A) Diagrama de caja para el tumor antes de la implantación catorce UW-SCC34 pesos demuestra la ausencia de cualquier valor atípico. (B) Diagrama de caja de los pesos de los tumores antes de la implantación de la UW-SCC52 también muestra que no hay valores atípicos.
Efecto del medio de almacenamiento y tiempo de mantenimiento
PDX
A final de ambos experimentos, se recogieron todos los tumores, fotografiado (Figuras 3A y 3C) y se pesa a partir de los 28 ratones. En primer lugar, se examinó si el medio de almacenamiento (medios) versus solución salina afectados potencial de crecimiento del tumor. Para UW-SCC34 el peso medio del tumor para todos los tumores en el grupo de medios de comunicación (n = 56) fue 0,132 g (desviación estándar (SD) 0,130 g), y para el grupo de solución salina (n = 56) la media fue de 0,142 g (SD 0.120 g). La diferencia entre los pesos de los tumores de medias para estos dos grupos fue -0.010 g (95% CI: -0.056 g, 0,035 g), que no fue estadísticamente significativa. Con el fin de dar cuenta de cualquier relación con el momento en que se implantó el tumor, se realizó un ANOVA de dos vías con el medio de almacenamiento y el tiempo como los factores. Esto también demostró que no había diferencias estadísticamente significativas entre el peso medio del tumor en los medios de comunicación y los grupos de solución salina (P = 0,650, Figura 3B). Se llevó a cabo el mismo análisis para el experimento de la Universidad de Wisconsin-SCC52. Para todos los tumores en el grupo de medios (n = 56) el peso medio era de 0,146 g (SD 0,113 g) y para el grupo de solución salina (n = 56) la media fue de 0,119 g (SD 0,111 g). Una vez más, con una diferencia entre las medias de 0,027 g (95% CI: -0.012 g, 0,067 g), no hubo diferencia significativa entre los pesos de los tumores de medias basado en medio de almacenamiento. Por último, utilizando un ANOVA de dos vías, no hubo diferencia significativa entre los pesos tumorales de los medios de comunicación frente a medios de almacenamiento de solución salina cuando se toma en cuenta el tiempo (p = 0,177, Figura 3D). Por lo tanto, sobre la base de nuestros experimentos replicados el medio de almacenamiento no tuvo ningún efecto sobre el potencial de crecimiento del tumor, incluso cuando la contabilidad de tiempo desde la extirpación del tumor a la reimplantación
.
(A) Fotografías de todos los tumores recogidos al final de el experimento de la Universidad de Wisconsin-SCC34. (B) Boxplots para el final de pesos de los tumores experimento para el experimento UW-SCC34 distinguido por medio de almacenamiento y el tiempo. (C) Las fotografías de todos los tumores cosechadas al final del experimento para UW-SCC52. (D) Fin de pesos de los tumores experimentales para UW-SCC52 también separado por medio de almacenamiento y el tiempo.
También evaluaron si el tiempo desde la extirpación del tumor a la implantación tuvo ningún efecto sobre la viabilidad del tumor. En cada momento había 16 tumores potenciales que podrían haber desarrollado (8 de los medios de comunicación y 8 del grupo de solución salina). Con base en la Tabla 1, para el experimento UW-SCC34 es evidente que el tiempo no tuvo impacto en la capacidad para que la PDX a crecer, porque al menos 13 de 16 tumores desarrollados en cada uno de los siete puntos de tiempo. Curiosamente, en los puntos de tiempo posteriores, 24 y 48 horas, 16 de 16 PDXs crecieron. Del mismo modo, para el experimento UW-SCC52, al menos 15 de 16 tumores desarrollados en cada tiempo (Tabla 1). Por lo tanto, el tiempo de retraso antes de volver a la implantación no afectó la viabilidad tumoral, ya sea para los experimentos de UW-SCC34 o UW-SCC52, dentro del marco de tiempo estudiado (es decir, hasta 48 horas de almacenamiento a 4 ° C). Por otra parte, no hubo una relación entre el peso del tumor antes de la implantación y el desarrollo del tumor final (es decir: los pocos ratones que no desarrolló uno o dos tumores no tenían los pesos más bajos tumorales antes de la implantación). Esto indicó, además, que la cantidad de tumor se inyecta en el inicio de los experimentos era apropiado para promover el crecimiento tumoral posterior.
Histología
Como se muestra en la Tabla 2, la pre-implantación UW -SCC34 tumoral moderadamente diferenciado con un 10% de la queratinización, 5% de necrosis /cambio quística y un patrón infiltrante en H & amp; e tinción. Es importante destacar que todos los tumores en el paso posterior de los siete puntos de tiempo diferentes y dos medios de almacenamiento demostraron las mismas características de diferenciación moderado con un patrón infiltrativo junto con algo de queratinización (rango de & lt; 5% -15%) y la necrosis /cambio de quística (rango & lt; 5% -15%). Imágenes representativas de los portaobjetos teñidos se muestran en la Figura 4. A continuación, se evaluó el tumor antes de la implantación UW-SCC52 y tenía diferenciación moderado, no queratinización, 20% de necrosis /cambio quística y un patrón infiltrante (Tabla 3). Una vez más, la histología de los tumores de la siguiente paso (todos los puntos de tiempo y ambos medios de almacenamiento) era bastante similar con cada diferenciación presentan moderado, no queratinización, algunos necrosis /cambio quística (rango de 5% -25%) y un fenotipo infiltrante . Por lo tanto, histológicamente hemos demostrado que el mismo tumor desarrollado independientemente del medio tiempo o de almacenamiento tanto para UW-SCC34 y UW-SCC52
Imágenes representativas de la H & amp;. E manchadas diapositivas para cada grupo dentro de la UW experimentos SCC34 y UW-SCC52.
efecto del tiempo sobre la nueva PDX Establecimiento
Hemos investigado si un retraso de 24 horas en el momento de la implantación (tumor almacena en los medios de comunicación a 4 ° C durante la demora) tuvo ningún efecto sobre la creación de tres nuevos PDX PDXs HNC (UW-SCC63, UW-SCC64, UW-SCC65). Aproximadamente volúmenes iguales de tumor se inyectaron en los dos ratones a tiempo 0 y 24 horas para cada uno de los tres PDXs. Para UW-SCC63 los pesos de los tumores antes de la implantación fueron 0,0694 gy 0,0723 g, mientras que los pesos de pre-implantación eran mucho más bajos de la UW-SCC64 (0,0115 gy 0,0117 g) y la Universidad de Wisconsin-SCC65 (0,0085 gy 0,0093 g).
Nueve semanas después de la implantación inicial, se evaluaron los ratones con cada nuevo PDX para el crecimiento tumoral. Sólo los ratones con la Universidad de Wisconsin-SCC64 PDX tenían el volumen del tumor suficiente para que pases. Por lo tanto, estos ratones fueron sacrificados, y todos los tumores fueron fotografiados y se pesan (figuras 5A y 5B) de forma individual. El peso medio de los tumores era el tiempo 0 0,104 g (DE 0,156 g) y a las 24 horas el promedio fue de 0,060 g (SD 0,137 g). No hubo diferencias estadísticamente significativas entre los pesos de los tumores de medias entre los dos grupos (p = 0,564). Además, no había un número similar de tumores que surgieron en cada uno de los dos grupos. Cuatro de los ocho tumores crecieron en el tiempo 0 y tres de ocho desarrollaron en el grupo de 24 horas. Para UW-SCC63, había tres tumores palpables en el grupo Tiempo 0 y dos en la cohorte de 24 horas. Por otra parte, la Universidad de Wisconsin-SCC65 no demostró ningún tumores palpables en ninguno de los grupos. En general, aparece en las PDXs que eran capaces de establecerse, el retardo de tiempo de 24 horas no afectó la viabilidad PDX. Curiosamente, el peso del tumor antes de la implantación no parecen tener un efecto importante en el crecimiento del tumor posterior ya que los tumores UW-SCC64 (que demostraron el mayor crecimiento) tenían aproximadamente seis veces menos tumor implantado inicialmente en comparación con UW-SCC63.
las fotografías (a) de todos los tumores recogidos al final del experimento de la Universidad de Wisconsin-SCC64. (B) Los gráficos de barras que representan los pesos medios del tumor para el tiempo 0 y 24 grupos de horas en el experimento de la Universidad de Wisconsin-SCC64.
Discusión
PDXs representan un importante modelo y validado para la investigación de numerosos diferentes subtipos de cáncer, especialmente en el ensayo de nuevos agentes quimioterapéuticos y estándar. Debido a que el tejido del paciente es precioso y, a menudo difícil de obtener, los investigadores deben tener mucho cuidado para optimizar este sistema modelo. Por esta razón hemos querido explorar aún más los límites potenciales de PDX pases probando la hipótesis de que 1) el tiempo de la escisión del tumor a la implantación definitiva en la nueva ratones NSG es importante y 2) medio de almacenamiento tiene un efecto sobre la viabilidad y el crecimiento PDX. Sorprendentemente, encontramos que ni el medio de almacenamiento (medios o solución salina) ni el tiempo de almacenamiento (hasta 48 horas a 4 ° C) afectado el crecimiento PDX y establecimiento en un paso posterior. Por otra parte, que reveló que el retraso de la implantación de tejido fresco paciente hasta 24 horas (tumor almacenada en los medios de comunicación helada durante el retardo) no afectó establecimiento inicial PDX.
Para apreciar plenamente la importancia y necesidad de PDXs en el campo de la investigación sobre el cáncer, es valioso para evaluar otros modelos disponibles junto con sus fortalezas y dificultades. En primer lugar, las líneas celulares han jugado un papel importante en la historia de la investigación oncológica y el descubrimiento de fármacos. Las células HeLa representan las primeras células cancerosas humanas cultivadas en el laboratorio, y los análisis de estas células y otras líneas celulares que siguieron han proporcionado la mayor parte de nuestro conocimiento molecular actual del cáncer [19]. Por otra parte, el proceso de pre-clínica estándar para la investigación de nuevos agentes quimioterapéuticos del cáncer por el Instituto Nacional del Cáncer (NCI) comienza con la evaluación de los
in vitro
actividad en 60 líneas celulares de cáncer establecidas (NCI-60), seguido de
en la evaluación in vivo
de estas líneas celulares en ratones a través de tanto el ensayo de fibra hueca y xenoinjertos [20], [21]. Recientemente, la validez de la utilización de líneas celulares como sustitutos para el tumor primario ha sido puesta en cuestión [22]. Gillet et al. demostrado a través de análisis genético que no existía una correlación entre los tumores de pacientes y líneas celulares de cáncer establecidas, y de hecho las líneas celulares dio una mayor semejanza entre sí que a las muestras clínicas [23]. Otros grupos también han revelado diferencias clave entre los tumores primarios y líneas celulares derivadas [24]. Sin embargo, los investigadores también señalan que todavía existen cambios importantes en la vía de estas células tumorales [25]. Por lo tanto, a pesar de las diferencias con respecto al tumor primario, los perfiles de expresión genética se pueden emplear para seleccionar líneas celulares para análisis específicos [26] - [28]
Debido a la creciente preocupación por la representatividad de las líneas celulares a. el cáncer primario, existe la necesidad de modelos adicionales para complementar este trabajo. Modelos de ratones transgénicos representan otro sistema distinto que se han utilizado en la investigación del cáncer. Estos modelos son los más utilizados para evaluar el impacto de las mutaciones oncogénicas pertinentes a la tumorigénesis y la respuesta terapéutica para una variedad de cánceres humanos, incluyendo el adenocarcinoma ductal pancreático [29], [30], el sarcoma de tejidos blandos [31], el adenocarcinoma de pulmón [32] , HNC [33] y muchos otros. El alcance de las preguntas que puede ser examinada por los ratones transgénicos es bastante amplio como se ejemplifica en los estudios previos en ratones transgénicos que expresan virus del papiloma humano oncogenes (VPH) en el que las interacciones entre estos oncogenes específicos con genes de Fanconi anemia por deficiencia [34], el estrógeno y la progresión del cáncer de cuello de útero [35], y la oncoproteína expresión en relación con el tráfico de linfocitos [36] se han dilucidado. Con todo, la investigación de ratón transgénico puede proporcionar una visión única de los mecanismos de mutaciones cancerígenas y posibles intervenciones terapéuticas. Sin embargo, estos modelos tienden a tener potente palanca para mutaciones de oncogenes y otros cambios genéticos muy específicos que pueden limitar el alcance de su aplicabilidad a la oncología clínica.
Para el modelo PDX, el cáncer de cada paciente es único y representa un sinnúmero de cambios genéticos que devenga en el momento en que el cáncer desarrollado. Estas células no se transforman o forzados para sobreexpresar proteínas específicas como líneas celulares y modelos de ratones transgénicos, respectivamente intencionalmente. Lo ideal sería que esto significa PDXs deben parecerse más el tumor primario. Como se describe en la introducción, muchos grupos han validado la utilidad de este sistema, incluyendo la capacidad de PDXs recapitular el potencial metastásico del tumor primario [7], [37]. Es importante destacar que, Tentler et al. recientemente revisado el expediente de traslación canción para PDXs en el desarrollo de fármacos oncológicos para una amplia gama de tipos de cáncer, y el futuro de PDXs en el desarrollo de biomarcadores predictivos para los ensayos clínicos parece prometedor [17].
PDXs se pueden inyectar en ratones, ya sea en forma ortotópico o heterotópico [17]. Los PDXs que hemos generado, utilizados y descritos a lo largo de este trabajo se implantaron de forma heterotópica desde HNCS se cultivaron subcutáneamente en los ratones. Otros grupos que estudian pancreática [4], [6], pulmonar [9], [10] y renal [10] también han utilizado los cánceres de la implantación del tumor subcutáneo para su trabajo. tumores subcutáneos permiten un acceso más fácil para las mediciones de tamaño de pinzas durante los estudios terapéuticos. Además, los tumores pueden ser cultivadas a una vía subcutánea volumen mucho mayor en comparación con los sitios ortotópico antes de causar daño a los ratones. De esta manera, los tumores subcutáneos permiten una mayor amplificación de este tejido valioso, que luego pueden ser cosechados para histológico, así como los análisis moleculares y para pases a nuevos ratones. implantación ortotópica, por el que se inyectan las células tumorales en el lugar de origen, representan otra forma viable para propagar y estudiar PDXs. Esta técnica se ha descrito para el de mama [7], el cerebro [38], y HNCS [37], [39]. Se cree que este modelo permite que los tumores se desarrollan en un microambiente representante más [39]. De hecho, este sistema es especialmente útil para el estudio de metástasis [7], [37]. Sin embargo, en particular para la región de cabeza y cuello, los volúmenes tumorales solamente pequeñas pueden ser generados antes de causar daño a los ratones. Qiu et al. documentado que las dietas después de dos semanas los ratones con PDXs orales requería modificada debido a la dificultad para comer [37]. Debido a estos pequeños tamaños de los tumores, es difícil para propagar PDXs HNC crecido ortotópicamente.