Extracto
Galiellalactone es un inhibidor potente y específico de la señalización de STAT3 que se ha demostrado que poseen efectos inhibidores del crecimiento de células de cáncer de próstata que expresan activa STAT3. En este estudio tuvo como objetivo investigar el efecto de galiellalactone en células similares a las células madre del cáncer de próstata. Exploramos la expresión de aldehído deshidrogenasa (ALDH) como un marcador para las células similares a células madre de cáncer en diferentes líneas celulares de cáncer de próstata humano y los efectos de galiellalactone en ALDH que expresan las células de cáncer de próstata (+ ALDH). Se detectaron ALDH + subpoblaciones y aisladas de las líneas celulares de cáncer de próstata humano DU145 y largo plazo de IL-6 estimula las células LNCaP usando el ensayo ALDEFLUOR® y citometría de flujo. En contraste con ALDH- células, las células del cáncer de próstata ALDH + mostraron características similares a las células madre del cáncer, tales como aumento de la capacidad de auto-renovación y formación de colonias y tumorigenicidad. Además, las células ALDH + mostraron un incremento en la expresión de marcadores de células madre putativas de cáncer de próstata (CD44 y la integrina α2β1). Además, las células ALDH + expresan STAT3 fosforilado. tratamiento Galiellalactone disminuyó la proporción de células de cáncer de ALDH + de próstata y la apoptosis inducida de células ALDH +. La expresión génica de
ALDH1A1
se downregulated in vivo en xenoinjertos tratados galiellalactone DU145. Estos resultados hacen hincapié en que la orientación de la vía STAT3 en células de cáncer de próstata, incluyendo las células similares a células madre de cáncer de próstata, es un enfoque terapéutico prometedor y que galiellalactone es un compuesto interesante para el desarrollo de futuros fármacos para el cáncer de próstata.
Visto : Hellsten R, M Johansson, Dahlman A, O Sterner, Bjartell A (2011) Galiellalactone inhibe las células madre ALDH positivos de cáncer de próstata como una celda. PLoS ONE 6 (7): e22118. doi: 10.1371 /journal.pone.0022118
Editor: Donald Gullberg, Universidad de Bergen, Noruega
Recibido: Diciembre 22, 2010; Aceptado: 17 Junio 2011; Publicado: 11 Julio 2011
Derechos de Autor © 2011 Hellsten et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El sueco Cancer Society, el Consejo Sueco de Investigación, Fundación MAS cáncer, Holger Knud Christensen donación, Fundación Percy Falck y Fundación Gunnar Nilsson. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es el tumor más comúnmente diagnosticado entre los hombres y hay una gran necesidad de nuevas terapias contra el cáncer de próstata resistente a la castración [1]. De acuerdo con la teoría de la célula madre de cáncer, sólo un pequeño subconjunto de las células cancerosas son capaces de crecimiento del tumor y la recurrencia [2], [3]. células madre de cáncer de próstata parecen ser resistentes a la terapia convencional del cáncer y, por tanto, pueden estar implicados en los tumores de próstata avanzados y provocan la recaída y la metástasis [4], [5]. Los tumores de próstata comprenden de células madre sólo el 0,1%, pero fracaso en la erradicación esta célula sub-población puede causar la regeneración de la resistencia del tumor y de drogas y con el fin de prevenir la recurrencia es importante dirigirse a todos los tipos de células en el tumor [5], [6 ], [7], [8]. Terapias novedosas que se dirigen a las células similares a las células madre del cáncer de próstata son muy justificadas.
Promesa
En la búsqueda de marcadores específicos de células madre del cáncer, aldehído deshidrogenasa (ALDH) ha mostrado como un marcador de este tipo en diferentes tipos de cáncer, incluyendo la vejiga cáncer [9], cáncer de pulmón [10], cabeza y cuello carcinoma de células escamosas [11], cáncer de mama [12] y el cáncer de próstata [13], [14]. Una alta expresión de ALDH en las células madre de cáncer de próstata se ha demostrado que se correlaciona positivamente con la puntuación de Gleason e inversamente correlacionada con la supervivencia del paciente en pacientes con cáncer de próstata [13]. La alta actividad de ALDH se ha utilizado con éxito para identificar tumores células iniciadoras del cáncer de próstata y metástasis [14].
transductor de señal y activador de la transcripción 3 (STAT3) es un importante factor de transcripción en muchos tipos de cáncer y se ha demostrado estar involucrados en la resistencia a las drogas y que tienen efectos anti-apoptóticos en las células del cáncer de próstata. Constitutivamente activa STAT3 contribuye a la oncogénesis a través de la regulación positiva de genes que codifican para las proteínas anti-apoptóticas, reguladores del ciclo celular y estimuladores de la angiogénesis, lo que lleva a un aumento de la supervivencia y el crecimiento descontrolado de las células del cáncer [15]. expresión STAT3 se sugiere que se correlaciona con el comportamiento maligno metastásico potencial y en el cáncer de próstata [16], [17]. Además, el análisis de expresión génica de células madre de cáncer de próstata se ha puesto de manifiesto un fenotipo pro-inflamatoria y que la vía de JAK /STAT3 de señalización está activo en esta población de células [18]. Varios estudios destacan STAT3 como una diana válida para el desarrollo de nuevos fármacos para el cáncer de próstata y otros tumores malignos [19], [20], [21]. Hemos demostrado, tanto
in vivo
y
in vitro
, que el inhibidor galiellalactone STAT3 posee efectos inhibidores del crecimiento de células de cáncer de próstata que expresan activo, STAT3 fosforilados [22]. Galiellalactone es un metabolito producido por el hongo
Galiella rufa
y se ha producido sintéticamente como se describe anteriormente [23]. Galiellalactone es un inhibidor altamente potente y selectivo de la IL-6 de señalización a través de STAT3, y se cree que inhibe la señalización STAT3 mediante el bloqueo de la unión de STAT3 activado al ADN [24].
En este estudio tuvo como objetivo explorar la expresión de ALDH como marcador de células madre de cáncer de células como en diferentes líneas celulares de cáncer de próstata humano y los efectos de la galiellalactone inhibidor de ALDH de STAT3 en células que expresan el cáncer de próstata.
Materiales y Métodos
cultivo de células
las líneas celulares de cáncer de próstata humano DU145, LNCaP (a partir de la American Type Culture Collection, [ATCC]) y las células LNCaP a largo plazo interleucina-6 (IL-6) estimuló (células LNCaP-IL6) [25] se utilizaron. Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina. células LNCaP-IL6 se mantuvieron en el medio anterior suplementado con IL-6 (5 ng /ml; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Todas las células se incubaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 95% O
2 y 5% de CO
2. Las células se utilizaron en pasajes bajos y no cultivadas por más de dos a tres meses. Las células fueron probados rutinariamente para micoplasmas y encontrados libres de micoplasma. identidad de la célula no fue autenticado por los autores. Galiellalactone fue preparado por síntesis como se describe anteriormente [23].
ALDEFLUOR ensayo y clasificación de células
células de cáncer de próstata (DU145, LNCaP y LNCaP-IL6) fueron sometidos a ensayo ALDEFLUOR® (StemCell Tecnologías , Aldagen, Inc., Durham, NC) seguido por citometría de flujo para detectar células con alta actividad de ALDH (ALDH +). El reactivo activo BODIPY®-aminoacetaldehído se añadió a las células que fue convertido por ALDH al fluorescente BODIPY®-aminoacetato. El diethylaminobenzaldehyde inhibidor de ALDH (DEAB) se utilizó como control negativo. células DU145 y LNCaP-IL6 fueron tratados con 0-50 galiellalactone mu M durante 24 h y la proporción de ALDH + se analizaron con el ensayo ALDEFLUOR®. células DU145 y LNCaP-IL6 se sometieron a clasificación celular basada en la actividad ALDH usando el ensayo de ALDEFLUOR®. ALDH + y células ALDH- se clasificaron utilizando el clasificador celular BD FACSAria (BD Biosciences, San Jose, CA). Se excluyeron células no viables usando 7-amino-actinomicina D tinción. ALDH + y ALDH- subpoblaciones de células DU145 y LNCaP-IL6 fueron re-chapada después de la clasificación y se analizaron con el ensayo ALDEFLUOR® después de una semana en cultivo con el fin de investigar su capacidad de auto-renovación.
Cytospin e inmunohistoquímica
ALDH + y células ALDH- ordenan del DU145 y células LNCaP-IL6 fueron sometidos directamente a Cytospin o volvieron a sembrar y se trató con galiellalactone, tripsina y se lavaron en PBS antes de someterse a citospina. La suspensión celular se colocó en un embudo de cytospin fijada a un portaobjetos de vidrio y se centrifugaron a 800 rpm durante 2 minutos. Los portaobjetos se secaron al aire, se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 10 minutos y se permeabilizaron con 1% de Triton-X en tampón Tris, pH 7,6 durante 1 h. Las diapositivas fueron sometidas a inmunohistoquímica utilizando Dako Autostainer Plus y Envision ™ + kit (Dako). Los anticuerpos utilizados fueron CD44 (BD Pharmingen), α2β1 integrina (Abcam), CD133, (c-PARP), p-STAT3 y p-NF-kB p65 (Cell Signaling Technology).
Ordenada ALDH + y ALDH- de DU145 y células LNCaP-IL6 se trataron con 25 galiellalactone mu M durante 24 h, se sometió a Cytospin y se tiñeron para el marcador de apoptosis c-PARP. Un mínimo de 500 células fueron contadas a partir de dos experimentos separados y el número de células c-PARP marcadas se calculó en relación al número total de células. El número de células apoptóticas se expresó como una fracción del número total de células.
WST-1 la proliferación de células de ensayo
WST-1 ensayo de proliferación se realizó para estudiar el efecto de galiellalactone sobre la proliferación y la viabilidad de ALDH + y células ALDH- según de DU145 y células LNCaP-IL6. ALDH + y células ALDH- se cultivaron en placas de 96 pocillos a la densidad de 2 000 células /pocillo en 200 l de medio. Las células se les permitió establecer para 24 h. Las células fueron tratadas con 0-50 galiellalactone mu M durante 24 h. Las muestras se realizaron por triplicado. se añadieron 20 l solución de WST-1 (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania) por pocillo y se incubó a 37 ° C durante 4 h. La absorbancia de cada pocillo se midió utilizando un espectrofotómetro de barrido multipocillo, lector de ELISA a una longitud de onda de 450 nm y longitud de onda de referencia de 690 nm. Los resultados se presentan como porcentaje de las células de control no tratadas.
eficiencia de la clonación análisis
p>
modelo de xenoinjerto de tumor de próstata
De seis a ocho semanas de edad ratones se mantuvieron RMN1 desnudos masculinos en un ciclo de luz-oscuridad de 12 h con acceso a alimentos y agua
ad libitum
. Los procedimientos experimentales fueron aprobados y llevados a cabo de acuerdo con las directrices establecidas por el Comité Ético de Malmö-Lund para el uso y cuidado de los animales de laboratorio. Los ratones desnudos con xenoinjertos de células de cáncer de próstata DU145 subcutánea (1 × 10
6 DU145 células) se sometieron a i.p. inyecciones de galiellalactone (1 mg /kg) o vehículo durante tres semanas [22]. Después de 21 días se sacrificaron los ratones por inyección ketamina (50 mg /kg), seguido por dislocación cervical y los xenoinjertos se diseccionaron e inmediatamente se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C hasta su posterior procesamiento. ARN total fue aislado de los xenoinjertos DU145 congeladas de los ratones no tratados (n = 6) y los ratones tratados con 1 mg /kg galiellalactone por día durante tres semanas (n = 3).
tumorigenicidad ensayo
recién ordenados ALDH + y poblaciones ALDH- de DU145 y se suspendieron las células LNCaP-IL6 en la mezcla de medio libre de suero /Matrigel (BD Biosciences) (01:01 en volumen). De seis a ratones nude RMN1 macho de ocho semanas de edad (n = 5) fueron inyectados con células ALDH- ALDH + o por vía subcutánea en el derecho y el flanco izquierdo del ratón, respectivamente, en concentraciones de 10 000 o 100 000 células por sitio de inyección. El crecimiento tumoral se monitorizó durante todo el experimento. El tamaño del tumor se midió después de seis semanas utilizando un calibre y el volumen del tumor (l) se calculó por la longitud fórmula (mm) x anchura x altura x 0,5632. Se sacrificaron los ratones con isoflurano y dislocación cervical después de 6 semanas.
Cuantitativo PCR en tiempo real
La expresión del gen de CD44, CD133, α2 integrina y ALDH1A1 se investigó con cuantitativa en tiempo real PCR (q-PCR). Se recogieron las células por centrifugación breve directamente después de la clasificación de células o después del tratamiento con galiellalactone, y los pellets se almacenaron a -80 ° C hasta que el aislamiento de ARN. El ARN total se aisló utilizando columnas de centrifugación QIAshredder, y un mayor enriquecimiento de ARNm y de lavado adicional se realizó usando el kit RNeasy (Qiagen Sciences). Para excluir la contaminación de ADN, las muestras se trataron con ADNasa durante 30 min usando RQ1 RNasa libre de DNasa (Promega). ADN complementario (ADNc) se sintetizó usando hexámeros aleatorios y transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen). ARN total fue aislado de los xenoinjertos DU145 utilizando Trizol (Invitrogen). Cinco microgramos de RNA total se obtuvo para la síntesis de ADNc usando un HPLC purificado Oligo dTprimer con una secuencia de T7.
Quantitative PCR en tiempo real se realizó utilizando 6-20 ng de ADNc, 250 nM de avance y retroceso de imprimación en 2 × SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) en una reacción de 25 microlitros. Las condiciones de ciclación fueron: 10 min a 95 ° C para activar la enzima, a continuación, 40 ciclos de 95 ° C durante 15 seg y 60 ° C durante 60 seg. niveles relativos de expresión se cuantificaron por el método comparativo Ct [26] y se normalizó a la expresión de los tres genes de control interno más estables (
HPRT
,
UBC
, y
YWHAZ
), seleccionado por el software de análisis geNorm como los genes más estable de referencia. secuencias de los cebadores eran como se informó anteriormente:
HPRT
,
UBC
y
YWHAZ
[26],
ALDH1A1
[27], CD133 [28], CD44 [29], y la integrina α2 [30]. Todos los cebadores fueron sintetizados por Invitrogen y se comprobó la especificidad antes de su uso.
Estadísticas
Los resultados se expresan como la media ± error estándar de la media (SEM). El análisis estadístico de los datos se realizó mediante la prueba de Dunnett o la prueba t de Student utilizando el software JMP (SAS Institute Inc, Cary, NC). Los resultados fueron considerados estadísticamente significativos valores de p. & Lt; 0,05
Resultados
expresión de ALDH en líneas celulares de cáncer de próstata
DU145, se investigaron las células LNCaP y LNCaP-IL6 para su actividad ALDH usando el ensayo de ALDEFLUOR® y citometría de flujo. En las células DU145 2,62 ± 0,23% de las células estaban expresando alta actividad de ALDH (ALDH +), 2,84 ± 0,5% de las células LNCaP-IL6 eran ALDH + y en las células LNCaP 0,57 ± 0,34% de células mostraron actividad ALDH (n = 3-4) (Figura 1).
DU145, LNCaP y células LNCaP-IL6 se sometieron a ensayo ALDEFLUOR® con el fin de identificar las células con la expresión de ALDH alta (ALDH +). El DEAB inhibidor de ALDH se utilizó como control negativo (panel izquierdo). Las células sin inhibidor desplazan a la derecha fueron consideradas células ALDH + (panel derecho).
Caracterización de aislados células ALDH +
Las características de ALDH + y poblaciones de células aisladas de ALDH- DU145 y células LNCaP-IL6 se investigaron con respecto a la auto-renovación y la capacidad y la tumorigenicidad formadoras de colonias.
La ALDH + ordenados y subpoblaciones ALDH- de DU145 y células LNCaP-IL6 fueron re-chapada después de la clasificación y se analizaron con ALDEFLUOR ® ensayo después de una semana en cultivo con el fin de investigar su capacidad de auto-renovación. Después se detectaron con una semana de cultivo de pequeñas poblaciones de células ALDH + entre las células DU145 y ALDH- ALDH- LNCaP-IL6 (0,26 ± 0,24% y 0,36 ± 0,05%, respectivamente, n = 2). Sin embargo, después de una semana en cultivo después de la clasificación, los cultivos ALDH + células LNCaP-IL6 y ALDH + DU145 restablecieron su fenotipo de los padres y constituían una población parecida a la de la línea celular parental original con 2,24 ± 1,23% y 1,24 ± 0,14% ALDH + células , respectivamente (n = 2).
La eficiencia de formación de colonias fue significativamente mayor en las células ALDH + en comparación con células ALDH- tanto de LNCaP-IL6 y las células DU145 (Figura 2A). La ALDH + clones formados estaban visiblemente más grandes que los clones ALDH-. La tumorigenicidad de ALDH + y células ALDH- recién ordenadas de DU145 y células LNCaP-IL6 se investigó mediante la inyección de 10 000 o 100 000 células por vía subcutánea en el flanco de ratones desnudos (n = 5) y el crecimiento tumoral se controló semanalmente. células ALDH + mostraron una mayor capacidad de formación de tumores en comparación con las células ALDH- tanto de células DU145 y LNCaP-IL6 y el descubrimiento de tumores palpables se retrasó en las células ALDH- (Figura 2B). Los tumores ALDH + fueron significativamente más grandes que los tumores ALDH- después de seis semanas (Figura 2C).
ALDH + células muestran características similares a células madre en términos de aumento de la capacidad y la colonia tumorigenicidad forman. A. ensayo clonogénico. 200 células /así se sembró y se contaron las colonias después de 1 semana. Clonogenicidad se calculó como colonias formadas por ciento en relación con las células sembradas (n = 2; p & lt; 0,05). B. La tumorigenicidad ensayo. Tumor tomar después de las inyecciones subcutáneas de 10 000 100 000 o células de células ALDH + y ALDH- recién ordenados desde DU145 y LNCaP-IL-6 (n = 5). C. tamaño del tumor de ALDH + y de células ALDH- xenoinjertos después de 6 semanas (n = 5). tumores ALDH + de células de 100 000 células inyectadas por vía subcutánea fueron significativamente más grandes que los tumores de células ALDH- tanto para células DU145 (p = 0,0002) y las células LNCaP-IL6 (p = 0,0077).
expresión de diversos biomarcadores relacionados con las células
La expresión de diversos biomarcadores supuestamente relacionados con las células madre de cáncer, fueron investigados en recién ordenados ALDH + y fracciones ALDH- de DU145 y células LNCaP-IL6 (Figura 3) del vástago. CD44 se detectó mediante inmunohistoquímica en tanto ALDH + y células ALDH- según partir de células DU145 y la expresión fue más intensa en ALDH + células en comparación con células ALDH- (Figura 3A). se observó inmunotinción CD44 en la mayoría de las células ALDH + LNCaP-IL6 en contraste con ALDH- células LNCaP-IL6 donde se tiñeron menos células para CD44. α2β1 integrina se expresó en tanto ALDH + y células ALDH- según partir de células DU145 y la expresión fue más intensa en las células ALDH + en comparación con células ALDH-. α2β1 integrina se expresó en células ALDH + de LNCaP-IL pero sólo unas pocas células expresó α2β1 integrina en las células ALDH-. CD133 no era detectable en las células ALDH + y ALDH- tanto de células LNCaP-IL6 DU145 y. La expresión de STAT3 activo y NF-kB se investigó en ALDH + y fracciones ALDH- de DU145 y células LNCaP-IL6 (Figura 3A). se observó aumento de la expresión de p-STAT3 en células ALDH + en comparación con células ALDH- de ambas líneas celulares. p65 P-NF-kB se detectó en las células ALDH + DU145, pero no en ALDH- DU145, LNCaP + ALDH-IL6 o células LNCaP ALDH--IL6.
A. Recién ordenados ALDH + y células DU145 y ALDH- de células LNCaP-IL6 se sometieron a Cytospin y se tiñeron para CD44, la integrina α2β1, p-STAT3 y p65 p-NF-kB. B. La expresión de mRNA relativa de CD44 y α2 de integrina en las células ALDH + y ALDH- recién ordenados a partir de células LNCaP y DU1145-IL6.
La expresión de los genes de CD44, integrina α2 y CD133, se investigó con -PCR cuantitativo. (Figura 3B). los niveles de expresión de ARNm de CD44 y la integrina α2 se incrementó en ALDH + células en comparación con las células ALDH- de células LNCaP-IL6. No hubo diferencia en el nivel de ARNm de CD44 y α2 integrina en ALDH + y células ALDH- de DU145. los niveles de ARNm de CD133 no fue detectable en las células ALDH + y ALDH- de ambas células DU145 y LNCaP-IL6.
Galiellalactone disminuye la proporción de ALDH + células
células
DU145 y LNCaP-IL6 fueron tratados con galiellalactone (5, 10, 25 o 50 mM) durante 24 h y se sometieron a ensayo ALDEFLUOR® con el fin de investigar el efecto de galiellalactone en la proporción de células ALDH + en comparación con vehículo. Galiellalactone disminuyó la proporción de células ALDH + tanto de DU145 y células LNCaP-IL6 en una forma dependiente de dosis (Figura 4A). La incubación con galiellalactone a 25 mM durante 24 h disminuyó significativamente la proporción de células ALDH + DU145 por 51% (p = 0,0013) y las células proporción ALDH + LNCaP-IL6 en un 75% (p = 0,0441).
A. células DU145 y LNCaP-IL6 se trataron con galiellalactone (5-50 mM) durante 24 h y se sometieron a ensayo ALDEFLUOR®. La proporción de células ALDH + disminuyó significativamente debido a galiellalactone tratamiento de una manera dependiente de la dosis. La proporción de células ALDH + se expresan como media ± SEM (n = 2-4). La proporción de células ALDH + DU145 se redujo significativamente por galiellalactone a las concentraciones de 10 mM (p = 0,0060), 25 mM (p = 0,0013) y 50 mM galiellalactone (p & lt; 0,0001). La proporción de células LNCaP-IL6 ALDH + se redujo significativamente por galiellalactone a las concentraciones de 25 mM (p = 0,0441) y 50 m (p = 0,0445). B. Expresión relativa del mRNA de ALDH1A1 en xenoinjertos de DU145 en ratones tratados con 1 mg /kg /día galiellalactone durante tres semanas. Los ratones control recibieron vehículo. La expresión de mRNA relativa de ALDH1A1 se redujo en los ratones tratados galiellalactone comparación con el control (0,139 ± 0,107 y 0,644 ± 0,161, respectivamente, p = 0,07; n = 3-6).
Galiellalactone disminuye la ALDH1A1 la expresión de ARNm en xenoinjertos de DU145
los ratones con xenoinjertos de DU145 se trataron con vehículo o 1 mg /kg galiellalactone al día durante tres semanas, los tumores se recogieron y se analizó la expresión de genes. La expresión de mRNA
ALDH1A1
era 4,6 veces menor en los xenoinjertos tratados galiellalactone comparación con los controles (Figura 4B).
Galiellalactone inhibe la proliferación e induce la apoptosis de las células ALDH +
Ordenada ALDH + y células ALDH- de DU145 y células LNCaP-IL6 se trataron con 25 galiellalactone mu M durante 24 h y se inmunotiñeron para el marcador de apoptosis c-PARP (Figura 5A). Se ha detectado un aumento del número de células c-PARP positivos en tratados galiellalactone ALDH + y células ALDH- en comparación con las células no tratadas (Figura 5A). La respuesta apoptótica en ALDH + y células ALDH- ordenados de DU145 y células LNCaP-IL6 trató con 25 galiellalactone mu M durante 24 h se cuantificó contando c-PARP células (Figura 5B) que expresan. El tratamiento con galiellalactone aumentó significativamente la cantidad de c-PARP en células ALDH + DU145, LNCaP ALDH +-IL6 y las células LNCaP ALDH--IL6 en comparación con los controles no tratados expresar. Las células ALDH + mostraron una mayor respuesta apoptótica a galiellalactone comparación con las células ALDH- según lo medido por la expresión de c-PARP. Sin embargo, esta diferencia no fue significativa (p = 0,059 para las células DU145 y P = 0,119 para las células LNCaP-IL6, n = 2). El efecto de galiellalactone sobre la viabilidad y proliferación de ALDH + y células ALDH- se investigó (Figura 5C). Galiellalactone disminuyó la proliferación tanto de ALDH + y las células aisladas a partir de ALDH- DU145 y células LNCaP-IL6 en una forma dependiente de la dosis (Figura 5C). Las células ALDH + fueron significativamente más sensibles a galiellalactone tratamiento que las células ALDH- según partir de células DU145. Sin embargo, no hubo diferencia significativa en la sensibilidad a la galiellalactone entre ALDH + y las células LNCaP ALDH--IL6.
A. ALDH + y células ALDH- ordenados de DU145 y células LNCaP-IL6 se trataron con galiellalactone 25 M durante 24 h. Las células apoptóticas se detectaron mediante tinción con c-PARP. B. Cuantificación de c-PARP tiñeron células apoptóticas en ALDH + y células ALDH- según de DU145 y células LNCaP-IL6 y tratados con galiellalactone 25 M durante 24 h. El tratamiento con galiellalactone aumentó significativamente la cantidad de c-PARP en células que expresan ALDH + DU145, LNCaP ALDH +-IL6 y las células LNCaP ALDH--IL6 comparación con los controles no tratados (p = 0,019, 0,035 y 0,009, respectivamente; n = 2). La diferencia en la respuesta apoptótica entre tratada galiellalactone ALDH + y células ALDH- de DU145 y células LNCaP-IL6 no fue significativa (p = 0,059 y p = 0,119, respectivamente; n = 2). C. Galiellalactone disminuyó la viabilidad de ALDH + y células ALDH- ordenados de DU145 y células LNCaP-IL6. Los + DU145 células ALDH fueron significativamente más sensibles a galiellalactone comparación con las células ALDH- correspondientes a los 5 M (p = 0,0017), 10 mM (p = 0,0010), 25 m (p = 0,0019) y 50 m (p = 0,0025). Los resultados se presentan como media por ciento de control sin tratar (n = 2).
Discusión
se muestran las células madre El cáncer de próstata que ser independientes de andrógenos y carecen de la expresión de un receptor de andrógenos funcional [6], [18] que los hace inmunes a la terapia de privación de andrógenos (ADT). En un modelo de ratón de cáncer de próstata, el aumento se observó expresión de marcadores de células madre después de ADT [31]. Además, las células madre de cáncer son resistentes a la quimioterapia actual y células madre cancerosas que expresan ALDH han mostrado resistencia a y enriquecimiento por tratamiento con paclitaxel [32]. características de la célula madre de cáncer, como el crecimiento lento, la resistencia a múltiples fármacos, el aumento de reparación del ADN, la alta expresión de proteínas anti-apoptóticas [33], y en el cáncer de próstata la falta de respuesta a ADT, hacer que estas células muy difícil apuntar con la próstata convencional terapia del cáncer. Por lo tanto, las nuevas modalidades terapéuticas se deben desarrollar, con el fin de orientar tanto la masa del tumor y las células madre del cáncer.
En el presente estudio hemos identificado subpoblaciones de células madre similares a las del cáncer en líneas celulares de cáncer de próstata cultivadas que respondieron al tratamiento con la galiellalactone inhibidor de STAT3. Una pequeña fracción (2-4%) de las poblaciones de líneas celulares mostró alta actividad de ALDH. Estas células ALDH + revelaron características similares a las células madre como el aumento de formación de colonias y la capacidad de auto-renovación y alta tumorigenicidad así como la expresión de marcadores de células madre de cáncer de próstata putativo. Estas células respondieron al tratamiento con galiellalactone.
La capacidad de reconstituir una masa heterogénea es una definición de las células madre del cáncer, y hemos encontrado que las células aisladas de cáncer de próstata ALDH + fueron capaces de auto-renovación y re-establecimiento de la la línea celular de sus padres y poseía alta tumorigenicidad
in vivo
y
in vitro
. La ALDH + población de células LNCaP-IL6 tenían una alta expresión de la CD44 células madre del cáncer de próstata putativo marcadores y la integrina α2β1 [34] en comparación con la población ALDH-. Sin embargo, no se detectó expresión de CD133 en las células de cáncer de próstata ALDH- ALDH + o. Esto está de acuerdo con el reciente estudio de Pfeiffer y Schalken [35] lo que sugiere que CD133 no es un marcador de células madre en líneas celulares de cáncer de próstata. Aumento de la actividad de JAK /STAT3 y NF-kappa B se expresa en las células madre y células madre similares a iniciadoras de tumores en el cáncer de próstata [18], [36] y nuestros resultados de STAT3 activo y NF-kB en las células ALDH + es de acuerdo con esta sugerencia . Tomados en conjunto, nuestros resultados, y otros [14], indican que la expresión de ALDH puede ser un medio de identificación de células similares a las células madre del cáncer en el cáncer de próstata.
La madre del cáncer de células similares a ALDH + población era mayor en largo término IL-6 estimula las células LNCaP en comparación con las células LNCaP que apoyan la opinión de que las células madre del cáncer de próstata muestran un fenotipo proinflamatorio [18], [37]. Perfiles de expresión génica de las células madre de cáncer de próstata muestran que la vía de señalización STAT3 se sobreexpresa en estas células [18] y varios estudios apuntan a STAT3 como un objetivo para la intervención terapéutica en las células madre tumorales [38], [39]. Esto está en línea con nuestra conclusión de que la ALDH + células similares a las células de las líneas celulares de cáncer de próstata madre expresó STAT3 activa y que estas células ALDH + respondieron a la galiellalactone inhibidor de STAT3, que previamente se ha demostrado que induce la apoptosis de las células del cáncer de próstata con la expresión constitutiva STAT3 de activo [22]. La disminución relacionada con la dosis-respuesta de la proporción de células ALDH + de la DU145 y poblaciones de células LNCaP-IL6 y la inducción de apoptosis de estas células por tratamiento galiellalactone sugieren que estas células similares a células madre de cáncer son sensibles a la inhibición STAT3. Noteably, xenoinjertos DU145 de los ratones tratados mostraron una reducción galiellalactone expresión génica de
ALDH1A1
comparación con xenoinjertos DU145 no tratados que indican que galiellalactone pueden dirigirse a las células similares a las células madre del cáncer de próstata también
in vivo
. Hemos demostrado previamente que la expresión de los genes relacionados con STAT3
Bcl2l1
y
MCL 1
se redujeron regulado por galiellalactone además de confirmar el efecto inhibidor de la droga STAT3
in vivo
[22].
Otros productos naturales además de galiellalactone han demostrado inhibir las células madre de cáncer. Sesquiterpeno lactona y parthenolide curcumina son citotóxicos para las células madre cancerosas y se dirigen a las células mediante la inhibición de la actividad de NF-kB y STAT3 [40], [41]. Orientación de la vía STAT3 en células similares a las células madre del cáncer de próstata con compuestos derivados de productos naturales puede ser un enfoque terapéutico prometedor para los medicamentos contra el cáncer de próstata desarrollo
En conclusión., Líneas celulares de cáncer de próstata contenían subpoblaciones ALDH + con por células madre como características que expresan STAT3 fosforilado. Estas subpoblaciones fueron claramente inhibida por el inhibidor galiellalactone STAT3. Estos resultados hacen hincapié en que la orientación de la vía STAT3 en células de cáncer de próstata, incluyendo las células similares a células madre de cáncer de próstata, puede ser una nueva estrategia de tratamiento potente en pacientes con cáncer de próstata avanzado resistente a ADT y la terapia citotóxica y que galiellalactone es un compuesto importante para el estudio la señalización de STAT3 en el cáncer de próstata y un posible punto de partida para el desarrollo de futuros fármacos contra el cáncer de próstata.
Reconocimientos
en el Departamento de Ciencias clínicas, Malmö, Universidad de Lund, hospital Universitario de Skåne, Malmö, Suecia queremos dar las gracias a Susan Evans Axelsson para una excelente ayuda con los estudios en animales, Elise Nilsson para la realización de técnicas de inmunohistoquímica y Per-Anders Bertilsson para una excelente ayuda para la clasificación de células. También deseamos agradecer al profesor Zoran Culig en el Departamento de Urología de la Universidad Médica de Innsbruck, Innsbruck, Austria por el generoso regalo de las células LNCaP-IL6.