Extracto
Antecedentes
vía de señalización PI3K /AKT es aberrante activo y desempeña un papel fundamental para la progresión del ciclo celular de las células humanas mesotelioma pleural maligno (MME).
AKT es una de las dianas celulares importantes de perifosine, una novela alquilfosfolıpido bio-disponible que ha mostrado actividad anti-proliferativa significativa in vitro e in vivo en varios sistemas de modelos de tumores humanos y en la actualidad se está probando en ensayos clínicos.
Métodos
Hemos probado la actividad Perifosina en las células mesoteliales humanos y las diferentes líneas celulares de mesotelioma, a fin de proporcionar evidencia de su eficacia como agente único y la terapia combinada.
resultados
se demuestra aquí que perifosine, que está siendo evaluado como un agente anti-cáncer en fase 1 y 2 de ensayos clínicos, causó una reducción dependiente de la dosis de la activación de AKT, en concentraciones que causan la detención del crecimiento celular MMe. En este estudio, en primer lugar describimos que las células expresan MME aparte de AKT1 también Akt3 y que, o bien las formas de las dos proteínas, abrogadas inhibición del crecimiento celular myristoylated, constitutivamente activa, perifosine mediada. Además, se describe aquí un nuevo mecanismo de perifosine que interfiere, aguas arriba de AKT, que afecta a EGFR y MET fosforilación. Por último, se demuestra un aumento significativo de la toxicidad celular cuando las células fueron tratadas con Mme perifosine en combinación con cisplatino.
Conclusiones
Este estudio proporciona un nuevo mecanismo de acción de perifosine, inhibiendo directamente EGFR /MET-AKT1 /3 ejes, proporcionando una base para un enfoque traslacional novedoso para el tratamiento de Mme
Visto:. Pinton G, Manente AG, Angeli G, Mutti L, L Moro (2012) Perifosina como un potencial novedoso contra el cáncer agente inhibe el EGFR /MET-AKT Eje en el mesotelioma pleural maligno. PLoS ONE 7 (5): e36856. doi: 10.1371 /journal.pone.0036856
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América
Recibido: 21 Noviembre 2011; Aceptado: April 15, 2012; Publicado: 10 de mayo de 2012
Derechos de Autor © 2012 Pinton et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo era con el apoyo de la Fundación de Investigación Aplicada mesotelioma (MARF conceder 2009), la Fundación Buzzi Unicem y régimen (italiana Mesotelioma interés Group). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
mesotelioma pleural maligno (MME) es un cáncer de rápido letal asociado con la exposición al amianto que está aumentando en incidencia mundial [1], [2]. Desde MMe es resistente a las terapias convencionales, el pronóstico de estos pacientes es pobre, con una supervivencia media de 11-12 meses después del diagnóstico [3], [4], por lo tanto, hay una urgente necesidad de una terapia eficaz.
activación de múltiples receptores tirosina quinasas (RTK) es crítica para la proliferación celular y /o supervivencia de las células MME. Entre las RTK, se pensaba que el trato de economía y EGFR ser dos de los involucrados lo más importante en la proliferación y /o supervivencia MMe vía PI3-K /AKT señalización de activación de la cascada. Sin embargo, un estudio clínico de fase II del tratamiento erlotinib no mostró un efecto sobre MMe, aunque 96% de los especímenes mostró pEGFR positivo [5].
La falta de EGFR mutación en MMe puede ser una de las razones para la falta de respuesta [6]. MET es otra RTK que media en la activación de varias vías de señalización, incluyendo phosphoinositide 3-quinasa (PI3-K) /Akt y Ras cascadas de proteína quinasa activadas por mitógeno /[7]. Estudios anteriores demostraron que MET se expresó y se activa en la mayoría de líneas celulares y muestras clínicas MME [8], [9]. Sin embargo, la inhibición MET provocó la detención del crecimiento en sólo un pequeño subconjunto de líneas celulares MME, independientemente de la activación frecuente MET [10]. En un artículo publicado recientemente Kawaguchi et al. sugiere que la inhibición de múltiples RTK puede servir para desarrollar una terapia objetivo más eficaz para los pacientes con la señora [11].
Al igual que en otros tipos de cáncer entre las señales RTK activados, la fosfoinosítido 3-quinasa (PI3K) /AKT , desempeña un papel fundamental para la progresión del ciclo celular en las células MME humanos [12], [13]. Se ha informado de que la inhibición de la actividad de PI3K condujo a la detención del ciclo celular significativa y la supresión de la proliferación de células de diferentes líneas celulares MME [14]. resultados de activación de PI3K en la acumulación del fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato y fosfatidilinositol 3,4-bifosfato [15]. proteínas Entonces pleckstrin homología (PH) que contiene el dominio incluyendo PDK1 y AKT [16], [17] se unen al extremo 3 'OH fosfatidilinositoles fosforilados a través de este dominio. Esta unión provoca la focalización de AKT a la membrana plasmática y proporciona una conformación favorable para AKT Thr308 y Ser473 fosforilación [18].
La primera generación de inhibidores de PI3K LY294002 y wortmanina incluye, tanto la orientación del sitio catalítico de P110, que se han utilizado como herramientas de investigación para elucidar el valor de PI3K como diana terapéutica [19]. Para las propiedades farmacéuticas no-favorables, la toxicidad y cruzado la inhibición de otras quinasas de proteínas y lípidos, no fueron ampliamente utilizados en los ensayos clínicos [20].
Perifosina [octadecil- (1,1-dimetil -piperidinio-4-il) fosfato] es una novela alquilfosfolıpido sintético (ALP), una nueva clase de agentes antitumorales que se dirige a las membranas celulares de las células en proliferación activas e inhibe dominio PH AKT mediada por el reclutamiento y la activación de la membrana. Es importante destacar que, perifosine no afecta directamente ya sea la actividad de PI3K o quinasa dependiente de fosfoinosítido 1 (PDK1) [21]. Perifosine ha mostrado actividad anti-proliferativa significativa
in vitro
y
in vivo
en varios sistemas de modelos de tumores humanos y en la actualidad se está probando en diferentes ensayos clínicos [22], [23].
El presente estudio investiga una actividad antitumoral potencial de perifosine utilizando
in vitro
modelos celulares MME, utilizando perifosine ya sea por sí solo o en combinación con fármacos quimioterapéuticos establecidos. Demostramos que perifosine inhibiendo tanto la economía de mercado y la activación del EGFR, incluso en presencia de HGF y EGF disminuye la proliferación de fosforilación de AKT y bloques celular sin inducir la apoptosis de líneas celulares de Mme. En este estudio, en primer lugar describimos que las células expresan MME aparte de AKT1 también Akt3 y que la inhibición del crecimiento celular inducida perifosine fueron restaurados por transfección de ambos-akts miristoiladas, constitutivamente localizado en la membrana plasmática. Por otra parte, el co-tratamiento con perifosine aumenta sustancialmente efecto citotóxico de cisplatino en células MME.
Resultados
Perifosina objetivos fosforilación de AKT y afecta a la proliferación celular MMe inducir
detienen a un G2 /M fases
Perifosine tiene una estructura similar a la de origen natural fosfolípidos que se ha descrito para interferir principalmente con las membranas de la proliferación de células como las células tumorales, Aquí se demuestra que 50% de inhibición del crecimiento MMe inducida por Perifosine (IC50) en 24 horas fue de 23 M, 14 M y 7,5 M durante REN, MSTO211H, y MMP respectivamente, mientras que la mínima toxicidad fue representada en HMC células mesoteliales normales (Figura 1A). Estas dosis estaban en línea con las concentraciones plasmáticas alcanzadas
in vivo gratis (descrito a ser alrededor de 16 mM). La ruta AKT es un objetivo para el efecto antiproliferativo de perifosine, por lo que investigó el efecto de este fármaco sobre el estado de fosforilación de AKT. La Figura 1B muestra que la exposición de las células MME a perifosine durante 1 hora causó una pérdida dependiente de la dosis de la fosforilación de Ser473 AKT, sin afectar a la cantidad total de la proteína. Esta pérdida de la fosforilación de AKT se observó en todas las líneas celulares ensayadas a las concentraciones IC50 de perifosine. Nos elegido células REN, representante de los tumores epitelioides más comunes, para caracterizar mejor los eventos de señalización primeros afectados por perifosine. En las células REN hemos demostrado que el tratamiento con diferentes dosis de perifosine durante 24 horas provocó una detención del ciclo celular con una acumulación significativa progresivo en la G2 /M fases (Figura 2A). Tanto sub-G1 de selección y la escisión de poli (ADP-ribosa) polimerasa no fueron evidentes tras la incubación con dosis crecientes de perifosine durante 24 h, lo que indica que no dependen de la muerte celular apoptótica caspasa ocurrió (Figura 2B). Por otra parte, los efectos de perifosine aumentaron con el tratamiento con el tiempo que lleva todas las células expuestas a 23 mM a morir a las 72 horas (Figura 2C). Resultados similares se obtuvieron en las células MSTO211-H (Figura S1).
A, efecto de perifosine sobre la viabilidad de HMC y tres líneas celulares diferentes MME (REN, MSTO211-H y MMP) después del tratamiento de 24 horas a las concentraciones indicadas.
Puntos
, media ± desviación estándar de tres mediciones individuales. células B, REN, MSTO211-H y MMP fueron tratados con las dosis indicadas de perifosine durante 1 hora. Las células se lisaron, y cantidades iguales de proteína se separaron mediante SDS-PAGE, se transfirieron a membrana de nitrocelulosa, se sondearon con AKT y volvieron a sondar con anticuerpos panAKT como se describe en fosfo-específico "Materiales y Métodos". Representativos de tres experimentos independientes.
a, las células fueron tratadas con REN diferentes dosis de perifosine durante 24 horas. Después de los tratamientos, las células se tiñeron con yoduro de propidio como se describe en "Materiales y Métodos" y se analizaron para el contenido de ADN celular por citometría de flujo. Los datos reportados en la tabla representan la media ± SD (n = 3) del porcentaje de células en cada fase del ciclo celular, * p≤0.005, ** p≤0.001. B, REN, las células se trataron con las dosis indicadas de perifosine durante 24 horas. Las células se lisaron, y cantidades iguales de proteína se separaron mediante SDS-PAGE, se transfirieron a membrana de nitrocelulosa, se sondearon con un anticuerpo anti-PARP1 específica y la tubulina para la igualdad de la carga. Representativos de tres experimentos independientes. C, Efecto de perifosine sobre la viabilidad de las células REN se ensayó a 24, 48 y 72 horas de tratamiento a las concentraciones indicadas.
Puntos
, media ± desviación estándar de tres mediciones individuales
Una forma activa constitutiva de AKT sobre-viene inhibición perifosine
AKT comprende tres isoformas estrechamente relacionados:. AKT 1, AKT 2 y AKT 3, codificado por tres genes diferentes [24]. A medida que la fosfo-anticuerpo no discrimina entre las tres isoformas, en este estudio, AKT 1, 2 y AKT AKT 3 de expresión se investigó en células REN. Los datos reportados en la Figura 3A y 3B muestran que las células expresan REN AKT1 y Akt3, mientras AKT2 ARNm no se evidenció (resultados similares en células MSTO211-H se muestra en la Figura S1).
A, AKT1, 2, 3 y la actina como control de la expresión de ARNm en células A549 y REN se evaluó mediante RT-PCR como se informa en en "materiales y Métodos" sección. B, AKT1 y 3 expresión de la proteína se evaluó mediante análisis de transferencia Western en las células REN con anticuerpos específicos de isoformas, tubulina blot confirmó la igualdad de carga. Representativos de tres experimentos independientes. C, las células fueron transfectadas con REN 1 g /placa de plásmido que codifica para la forma activada constitutiva de AKT, Myr-AKT1 o 3. 24 horas después de la transfección las células REN se trataron con 23 mM perifosine durante 1 hora, a continuación, se lisaron y cantidades iguales de las proteínas se sometieron a SDS-PAGE seguido de inmunotransferencia con anticuerpos específicos frente a Akt fosforilada, HA para confirmar la transfección y la tubulina para la igualdad de la carga. D, el efecto de perifosine en las células transfectadas con Myr- AKT1 o 3 también se evaluó sobre la proliferación celular. REN células fueron transfectadas con 1 mg /placa de plásmido que codifica Myr-AKT1 o 3 y 24 horas después de la transfección se trataron con 23 mM perifosine durante 24 horas. Al final del recuento de células viables se determinó tratamiento.
Puntos
, media ± desviación estándar de tres mediciones individuales. Perifosine altera notablemente la translocación de membrana AKT, por lo que la próxima pregunta si la expresión forzada de una exógeno Myr-AKT1 o Myr-Akt3 podría derogar el efecto de perifosine en la activación de AKT fosforilaciones y el crecimiento celular. están disponibles en la literatura datos contradictorios sobre la capacidad de una AKT constitutivamente activa para superar la acción perifosine. Mientras que en la próstata inhibición células cancerosas de la fosforilación de AKT se alivia sustancialmente por introducción de un Myr-AKT1, que omite el requisito para el reclutamiento membrana dominio mediada PH, en células de mieloma se ha descrito que perifosine superar AKT1 constitutiva de gran actividad [25], [26]. Estamos transfectadas transitoriamente células REN ya sea con una marcada con HA-Myr AKT1 o Myr-Akt3 y les trataron durante 24 horas con la dosis IC50 de perifosine. análisis Western-blot reportado en la Figura 3C muestra que la transfección de ambos Myr-AKT1 y Myr-Akt3 supera la inhibición de la fosforilación de AKT perifosine en células REN; , Sólo se observó una ligera reducción de la fosforilación, probablemente debido al bloque de las proteínas endógenas. el análisis del crecimiento celular reportado en la figura 3D demuestra que ambos transfectadas Myr-akts rescatados perifosine inducida por el bloque de la proliferación celular.
Perifosina afecta EGFR y MET señalización
Perifosina es similar a los fosfolípidos, la principales constituyentes de las membranas celulares y puede modificar relacionados membrana de transducción de señales. Consistentemente en las células de cáncer de próstata perifosine era capaz de determinar una reducción de la actividad de AKT, la proliferación celular, y para inducir la apoptosis después de la estimulación con 50 ng /ml EGF, aunque no se mostraron los datos relativos a la activación de EGFR hasta la fecha [27]. Por lo tanto, si analizamos perifosine podría interferir con el ligando mediada por la activación de EGFR y MET por inmunoprecipitación y Western-blot experimentos. Como se muestra en la figura 4A y 4C en las células REN hambre, se trató 1 hora con perifosine (23 M) y después se estimularon 10 minutos con 5 ng /ml de EGF o HGF tanto EGFR y MET no se fosforilaron incluso en la presencia de sus ligandos. También EGFR y MET señalización fueron significativamente comprometida; de hecho, también el factor de crecimiento inducido por la fosforilación de AKT se inhibió. Como se ha descrito en otros modelos de células [26], las concentraciones de análogos de perifosine realmente causó un ligero aumento de la basal ERK1 /2 fosforilación, mientras que contrarrestado inducida por factores de crecimiento. El efecto de perifosine también se evaluó sobre la proliferación celular mediada por factor de crecimiento. Como se muestra en la Figura 4B y 4D, perifosine 23 mM administrado 24 horas a REN células en presencia de EGF o HGF abrogada la proliferación celular inducida por factor de crecimiento. Es de destacar que se observaron datos similares en la línea celular MSTO-211H (Figura S1). Por otra parte, perifosine fue más eficaz que el uso único o en combinación de inhibidores específicos de EGFR y MET, ya sea en términos de viabilidad celular de activación de AKT (datos no mostrados).
Perifosine mejora la respuesta de las células MME a agentes quimioterapéuticos
Para determinar la naturaleza de las interacciones entre perifosine y agentes quimioterapéuticos que se utilizan actualmente en la terapia Mme, se examinaron los datos de las curvas de dosis-respuesta mediante análisis de isobolograma. Se optó por evaluar los efectos antiproliferativos usando el IC50 para los efectos de los medicamentos individuales que fueron determinados experimentalmente, utilizando los datos de los experimentos de dosis-respuesta como punto de partida. Perifosine (de 5 a 20 M) y cisplatino (IC50: 100 M) o pemetrexed (IC50: 22 M) o gemcitabina (IC50: 2 nM) se administraron simultáneamente durante 24 horas a REN células en colture. Al final de la incubación las células se tripsinizaron y se contaron. isobologramas representativos de la Figura 5 indican que la combinación de cisplatino y perifosine muestra fuerte citotoxicidad sinérgica en las células REN en una amplia gama de dosis. Por otra parte, perifosine mostró aditividad en combinación con gemcitabina mientras que parecía antagonizar el efecto de pemetrexed. Sinergy con cisplatino también se informó en la línea celular MSTO-211H (Figura S1), aunque se observó una sensibilidad diferente a las drogas.
Discusión
PI3-K /señalización AKT se ha demostrado que tiene un impacto biológico crucial en la regulación del ciclo celular Mme, anti-apoptosis y la quimio-resistencia. La activación de AKT, según lo informado por Altomare et al., Se observó en 65% de los especímenes MMe incluso si las alteraciones genéticas parecían ser poco frecuentes de PI3-K Activación /AKT en las células MME [12].
Además, el análisis conjunto de fosfo-RTK mostró que en las células MME la familia EGFR, EGFR, ErbB2 o ErbB3, era con frecuencia co-activa con MET, lo que sugiere que la activación de la familia MET y el EGFR puede compensar entre sí por la persistente activación de señalización corriente abajo [28]. De hecho, como se informó en varios estudios, incluso si el EGFR y MET fueron altamente expresado en Mme, inhibidores individuales RTK aplicadas en la fase II de los ensayos no fueron suficientes para inhibir la proliferación celular Mme, lo que sugiere que la inhibición de múltiples RTK puede servir para desarrollar una más eficaz orientar la terapia para los pacientes con la señora en el futuro [28].
el examen de PI3K /PDK1 /AKT vía de señalización, como un punto de convergencia de crecimiento efectos relacionados con el factor de sobre la proliferación celular, como un nuevo objetivo potencial para la terapia Mme, condujo a los experimentos aquí.
Perifosina [octadecil- (1,1-dimetil-piperidinio-4-il) fosfato] es una novela alquilfosfolıpido sintética, una nueva clase de agentes antitumorales que se dirige membranas celulares, inhibe la activación de AKT, e induce la apoptosis en diferentes células de carcinoma
.
a, B, células de crecimiento exponencial REN se trataron previamente con 23 mM perifosine durante 1 hora y después se incubó 10 minutos con EGF (5 ng /ml) o HGF (5 ng /ml). Al final del experimento, se prepararon o inmunoprecipitaron lisados de células y se analizaron mediante inmunotransferencia con anticuerpos indicados. Los resultados son representativos de tres experimentos diferentes. B, D, El efecto de perifosine también se evaluó sobre la proliferación celular mediada por factor de crecimiento. las células se trataron con REN perifosine 23 M 24 horas en ausencia o en presencia de 5 ng /ml de EGF o HGF. Al final del recuento de células viables se determinó tratamiento.
Puntos
, media ± desviación estándar de tres mediciones individuales.
A, parcelas B, C, isobolograma de las interacciones entre perifosine y cisplatino o gemcitabina o compuestos de pemetrexed en las células REN. Las células (5 × 10
4) se sembraron en medio completo y se dejaron adherir a la superficie durante la noche. El medio de recubrimiento se retiró y se reemplazó con medio que contienen varias concentraciones de perifosine y las dosis de CI50 de los otros fármacos. Para determinar la naturaleza de la interacción entre perifosine y cis-platino o gemcitabina o pemetrexed, contamos células supervivientes siguientes 24 horas de incubación de drogas. La línea diagonal representa la línea isoefecto de aditividad. Cada punto es la media determinada a partir de experimentos realizados por triplicado.
Los experimentos presentados en este documento demuestran que perifosine, causó la inhibición del crecimiento celular MMe (IC
50 por 7,5 M a 23 M en 24 horas) y la detención del ciclo celular en la fase G2-M, asociados con el rápido disminución de la activación de AKT, según la evaluación de Ser473 cuantificación de la fosforilación. Como preferentemente actúa sobre la estructura de la membrana de las células en proliferación activa, perifosine resultado sólo ligeramente tóxico en las células mesoteliales normales
La familia AKT tiene tres isoformas altamente homólogas:. AKT 1, 2 y AKT AKT 3, codificadas por tres diferentes genes. Las tres proteínas AKT contienen un dominio N-terminal de pleckstrin homología (PH), un dominio quinasa catalítico y un dominio regulador C-terminal.
A medida que la de los anticuerpos anti-AKT que utilizamos no discriminan fosfo-específico y entre las tres isoformas, que investigó más profundamente su expresión en nuestras células. En primer lugar nos describen que las células expresan MME AKT1 y Akt3 y que perifosine interfiere con ambos. Teniendo en cuenta el potencial de la tumorigénesis de isoformas de Akt, se necesitan más estudios sobre la función de ellos en Mme. La inhibición de la fosforilación de AKT y la proliferación celular se alivia sustancialmente por introducción de un AKT1 constitutiva activo myristoylated o 3, que pasa por alto el requisito para el reclutamiento membrana dominio mediada PH, apoyando la hipótesis de que perifosine no afecta directamente a la actividad de PI3-K o phosphoinositide- quinasa dependiente de 1 (PDK1). Se ha informado de que perifosine aumenta la actividad antitumoral de cetuximab en células de cáncer de PTEN deficiente y que el tratamiento de combinación mejorada de la inhibición de la fosforilación de AKT, p44 /42MAPK y p38MAPK, pero compensar la fosforilación de SAPK /JNK que fue activado por perifosine tratamiento solo [29]. Por otra parte, se ha descrito que perifosine mostró efectos sinérgicos con erlotinib restablecimiento de la eficacia frente a los inhibidores de EGFR en el CaP [28].
Es importante destacar que, cuando analizamos más profundamente la respuesta de las células MME a EGF y observamos que el HGF perifosine, probablemente actuando sobre la estructura de la membrana celular o que afectan a la interacción del receptor o reclutamiento de coactivadores, abrogadas aguas arriba de las moléculas de señalización EGFR y MET ligando inducida por fosforilación.
Finalmente hemos probado los efectos de la terapia combinada con cisplatino y perifosine o pemetrexed o gemcitabina mediante el análisis de isobolograma. Como se desprende de los resultados de nuestra perifosine claramente sinérgica con el tratamiento con cisplatino y ejerce un efecto aditivo con gemcitabina.
AKT
En resumen, hemos puesto de manifiesto, una quinasa multifuncional, cuya activación se asocia con la resistencia a la muerte celular y la tumorigénesis, como un objetivo importante de perifosine. Hemos demostrado aquí que perifosine inhibe ya sea AKT1 que la fosforilación y la activación de Akt3 en células en crecimiento exponencial en medio que contiene suero y después de la estimulación del factor de crecimiento. Este último mecanismos proporcionan una nueva razón para considerar perifosine también como un inhibidor de la multi-objetivo, mientras que la interferencia con la localización de la membrana adecuada de proteínas diana para su fosforilación y la activación (en lugar de la inhibición directa de la actividad fosfotransferasa de las quinasas conocidas para regular AKT) , que parece ser un nuevo mecanismo adicional de acción del fármaco revelamos aquí. A pesar de la eficacia del tratamiento combinado entre cisplatino y perifosine debe ser validado por más
in vivo
estudios, nuestros resultados ponen de relieve perifosine como una terapia multi-objetivo para Mme. Más interesante aún, perifosine ya se demostró para dar respuesta parcial y enfermedad estable en pacientes en terapia de segunda línea (datos no publicados amablemente proporcionados por Keryx biofarmacéutica).
Materiales y Métodos
Los cultivos de células y transfección tratamientos
la MME epitelioide línea celular derivada de REN que se utilizó como modelo experimental principal de esta investigación fue proporcionado amablemente por el Dr. SM Albelda (Universidad de Pennsylvania, Philadelphia, PA), MMP se estabilizaron a partir de derrames pleurales de pacientes mesotelioma maligno [30] y cultivos primarios HMC-terc obtenidas de pacientes con insuficiencia cardíaca congestiva y inmortalizado por la expresión de una subunidad de la telomerasa humana [31]. La línea celular MSTO-211H derivada bifásica se obtuvo del Istituto Scientifico de Tumores (IST) Cell-banco, Génova, Italia. Las células se cultivaron en condiciones estándar
.
Las células cultivadas a 80% de confluencia en placas de cultivo de tejidos fueron transfectadas transitoriamente con pcDNA3 Myr-HA-AKT1 o pBABE Purol Myr-HA-Akt3 plásmido que codifica para myristilated forma constitutivamente activa de akts de Addgene por el reactivo LipofectAMINE como se describe por el fabricante.
Reactivos y anticuerpos
los anticuerpos monoclonales específicos de tirosina fosfato, fosfato ERK1 (pThr202 y pTyr204) y ERK2 (pThr185 y pTyr187) MAP quinasas Akt, y fosfo-AKT1 (pSer473) y Akt3, eran de Señalización celular Tecnología (Beverly, MA). Los anticuerpos específicos para α-tubulina, PARP1, ERK1 /2, panAKT, MET, EGFR y HA eran de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). ratón anti conejo y anti IgG peroxidasa anticuerpos conjugados, factores de crecimiento y reactivos químicos fueron de Sigma-Aldrich (St Louis, MO). ECL era de Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Suecia). Las membranas de nitrocelulosa y los kits de ensayo de proteína eran de Bio-Rad (Hercules, CA). Los medios de cultivo, suero, antibióticos y Lipofectamine eran de Invitrogen (Carlsbad, CA). Perifosine se comercializa y proporcionado amablemente por Keryx biofarmacéutica (Nueva York, NY).
La lisis celular, inmunoprecipitación e inmunotransferencia
Las proteínas se extrajeron y se inmunoprecipitaron y SDS-PAGE separados como se describe anteriormente [32] . Después de SDS-PAGE, las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa, se hacen reaccionar con los anticuerpos específicos indicados y luego detectaron con anticuerpos secundarios de rábano picante y conjugado con peroxidasa y el reactivo ECL chemioluminescent. El análisis densitométrico se realizó utilizando el GS 250 Molecular Imager (Bio-Rad).
La proliferación celular según lo determinado por conteo directo
y se trataron en medio completo que el anterior indica
células MME, a continuación, eran se trataron con tripsina y se tiñeron con azul de tripano. El número de células viables se contaron en una cámara Burker.
Análisis de Ciclo Celular
ciclo celular /apoptosis análisis se realizaron mediante tinción con yoduro de propidio posterior análisis FACS. 5 × 10
5 células /pocillo se cultivaron en placas de cultivo de tejido con o sin tratamiento durante 24 horas. Después de la incubación, las células adherentes se separaron con tripsina (0,5% de EDTA de tripsina /0,1% en PBS). Se recogieron las células desprendidas y se suspendieron en medio completo DMEM y se centrifugaron a 500 g durante 10 minutos. Los sedimentos se lavaron con PBS y se fijaron con hielo frío durante la noche etanol 75% a 4 ° C, se trató con 100 mg /ml de RNAsa A, y posteriormente se tiñeron con 25 mg /ml de yoduro de propidio. Luego se analizaron utilizando un citómetro de flujo FACS (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) y software Modfit (Verity Software House, Inc., Topsham, Maine).
El aislamiento de ARN y RT-PCR
ARN total fue extraído de REN, MSTO-211H y de células A549 líneas posteriores al reactivo Trizol (Life Technologies, Inc.) de protocolo. La calidad y cantidad del ARN se determinó midiendo la absorbancia de la ARN total a 260 y 280 nm. Para obtener cDNA se utilizó el kit de síntesis de ADNc a partir RevertAid Fermentas. Los cebadores para la expresión de la isoforma de Akt fueron descritos por Okano et al. [33] y fueron sintetizados por MWG. Los cebadores fueron: 5'-GCTGGACGATAGCTTGGA-3 '(Akt1 sentido); 5'-GATGACAGATAGCTGGTG-3 '(antisentido Akt1); 5'-GGCCCCTGATCAGACTCTA-3 '(sentido Akt2); 5'-TCCTCAGTCGTGGAGGAGT-3 '(antisentido Akt2); 5'-GCAAGTGGACGAGAATAAGTCTC-3 '(sentido Akt3); y 5'-ACAATGGTGGGCTCATGACTTCC-3 '(antisentido Akt3). cebadores ß-actina fueron 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3 '(sentido) y 5'-CTCCTTAAGTCACGCACGATTTC-3' (antisentido). reacciones de RT-PCR se realizó usando 2xPCR Mix Master de Fermentas según procedimientos estándar. Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1% y se visualizaron con bromuro de etidio. Los cebadores Akt fueron diseñados para generar 383- (Akt1), 276- (Akt2) y 329- (Akt3) los productos pb, respectivamente.
Análisis estadístico y isobolograma
Los datos se expresan como la media ± SEM. Las diferencias entre los valores obtenidos en una población de células tratadas con diferentes condiciones experimentales se determinaron utilizando el desapareado
t-test
. Un
P-valor de & lt
; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. La base teórica del método de isobolograma se ha descrito en estudios previos [34], [35].
Sobre la base de las curvas de dosis-respuesta de cisplatino, pemetrexed y gemcitabina, tres isobologramas se construyeron mediante el trazado de los valores de IC50 de los fármacos individuales en el
y
y de perifosine en el
x
ejes, respectivamente, y se calculó la combinación teórica dosis de aditivo.
Apoyo a la Información
Figura S1 . Análisis FODA de los efectos sobre las células perifosine MSTO-211H. A, efecto de perifosine sobre la viabilidad de las células MSTO-211H a las 24, 48 y 72 horas de tratamiento a las concentraciones indicadas.
Puntos
, media ± desviación estándar de tres mediciones individuales. B, las células de crecimiento exponencial MSTO-211H fueron pre-tratados con 20 mM perifosine durante 1 hora y después se incubaron 10 minutos con EGF (5 ng /ml) o HGF (5 ng /ml). Al final del experimento, los lisados celulares se prepararon y analizaron por inmunotransferencia con anticuerpos indicados. Los resultados son representativos de tres experimentos diferentes. C, AKT1, 2 y 3 y la actina, como control, la expresión de ARNm en las células MSTO-211H se evaluó mediante RT-PCR como se indica en la sección de "Materiales y Métodos". D, la trama isobolograma de las interacciones entre perifosine y cisplatino en las células MSTO-211H
doi:. 10.1371 /journal.pone.0036856.s001 gratis (TIF)
Reconocimientos
agradecemos a Dott. Peter Sportelli de Keryx biofarmacéutica para proporcionar datos clínicos de los pacientes tratados perifosine.