Extracto
El cáncer de pulmón sigue siendo la principal causa de muerte debido a su metástasis a órganos distantes. Hemos examinado el efecto de honokiol, un componente bioactivo de la
Magnolia
planta, el cáncer no microcítico de pulmón de células humanas (CPNM) la migración celular y los mecanismos moleculares que subyacen a este efecto. El uso de un
vitro
ensayo de migración celular en, encontramos que el tratamiento de A549, H1299, H460 y H226 de NSCLC células con honokiol resultó en la inhibición de la migración de estas células de una manera dependiente de la dosis, que se asoció con una reducción de los niveles de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) y la prostaglandina e
2 (PGE
2). Celecoxib, un inhibidor de COX-2, también inhibió la migración celular. Honokiol inhibe PGE
migración 2 mejorada de células de NSCLC, inhibe la activación de NF-kB /p65, un regulador aguas arriba de la COX-2, en las células A549 y H1299, y el tratamiento de las células con éster de fenetilo ácido cafeico, un inhibidor de NF-kB, también inhibió la migración de las células de NSCLC. PGE
2 se ha demostrado que activan la señalización de β-catenina, que contribuye a la migración de células de cáncer. Por lo tanto, se comprobó el efecto de honokiol en la señalización β-catenina. Se observó que el tratamiento de células de NSCLC con honokiol degrada citosólico β-catenina, la reducción de la acumulación nuclear de β-catenina y el regulado de metaloproteinasas de matriz (MMP) -2 y MMP-9, que son los objetivos de corriente abajo de β-catenina y juega un papel crucial en la metástasis de las células cancerosas. Honokiol mejorada: (i) los niveles de la caseína quinasa-1α, la glucógeno sintasa quinasa-3β, y (ii) la fosforilación de β-catenina en restos críticos Ser
45, Ser
33/37 y Thr
41. Estos eventos juegan un papel importante en la degradación o inactivación de β-catenina. El tratamiento de celecoxib también redujo la acumulación nuclear de β-catenina en las células NSCLC. FH535, un inhibidor de la vía /β-catenina Wnt, inhibe PGE
2-mejorado la migración celular de A549 y células H1299. Estos resultados indican que inhibe honokiol no microcítico de pulmón de células células de cáncer de la migración por la orientación de activación
2 mediada por la señalización de PGE β-catenina
Visto:. Singh T, Katiyar SK (2013) honokiol Inhibe de No La migración de células pequeñas cáncer pulmonar de células por orientación PGE
2 mediada por activación de β-catenina. PLoS ONE 8 (4): e60749. doi: 10.1371 /journal.pone.0060749
Editor: Xianglin Shi, Universidad de Kentucky, Estados Unidos de América
Recibido: 2 Enero, 2013; Aceptado: March 2, 2013; Publicado: 8 de Abril, 2013
Derechos de Autor © 2013 Singh, Katiyar. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación contó con el apoyo financiero de la concesión de mérito Administración de Veteranos de Revisión (1I01BX001410-01, SKK). Los organismos de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es responsable de más muertes en los EE.UU. cada año que los cánceres de mama, colon y próstata combinados, y por lo tanto tiene un tremendo impacto en los gastos de salud y cuidado de la salud humana [1]. Una de cada tres muertes relacionadas con el cáncer es atribuible al cáncer de pulmón, y no tiene ninguna mejora con respecto a los últimos 30 años [2], [3]. cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) representa aproximadamente el 80% de todos los tipos de cáncer de pulmón e incluye adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas y carcinoma de células grandes [4], [5]. La ciclooxigenasa-2 (COX-2) es con frecuencia constitutivamente hasta reguladas en diferentes tumores malignos humanos, incluyendo los cánceres de pulmón [6] - [10]. A pesar de múltiples cambios genéticos son necesarios para que el riesgo de cáncer de pulmón y de su desarrollo, la COX-2 se considera como un elemento central en la orquestación de la carcinogénesis pulmonar. COX-2 es una enzima inducible y genera prostaglandinas (PGs) a partir de su acción sobre el ácido araquidónico. Entre las PGs, PGE
2 se considera el metabolito más eficaz o mediador inflamatorio que se cree que desempeñan un papel central en el crecimiento del cáncer, la progresión, invasión y metástasis. Los estudios en cáncer de colon, donde la COX-2 se sobreexpresa de forma espontánea, han puesto de manifiesto un enlace entre la COX-2 /PGE señalización
2 y β-catenina, que contribuye al crecimiento del cáncer de colon [11]. Smith et al [12] han demostrado que la radiación ultravioleta inducida por la COX-2 de expresión y PGE
2 resultados de producción en una mayor activación de la señalización de β-catenina. Hay informes que sugieren que la COX-2 /PGE
2 ejes /β-catenina o enlace está asociada con la metástasis del cáncer de pulmón [13]. β-catenina es una proteína de 90 kD citosólica y actúa como un componente crucial de la vía Wnt. En ausencia de ligandos Wnt, β-catenina es reclutado a la /complejo de fosforilación destrucción, que contiene el gen supresor tumoral, la poliposis adenomatosa coli (APC) y Axin. El complejo destrucción facilita la fosforilación de β-catenina por la glucógeno sintasa quinasa 3β y la caseína quinasa (CK1) que conduce a la degradación proteasomal de β-catenina. Si β-catenina no es fosforilada luego N-terminal no-fosforilado β-catenina se acumula en el citosol, que entra en el núcleo e interacciona con factores de transcripción, tales como el factor de células T, para activar la transcripción de genes diana que están asociadas con la supervivencia celular , la proliferación y la metástasis [14] - [16]. Puesto que, el cáncer de pulmón es un cáncer muy maligno con una potente capacidad de producir metástasis distante y una causa importante de muertes relacionadas con el cáncer, un enfoque que reduce su capacidad metastásica puede facilitar el desarrollo de una estrategia eficaz para su tratamiento y /o prevención.
los fitoquímicos de los valores terapéuticos ofrecen opciones prometedoras para el desarrollo de estrategias efectivas para la prevención de la migración de células tumorales, invasión y metástasis. Honokiol (C
18H
18O
2, la figura 1A) es un componente bioactivo prometedor de la corteza de los
Magnolia
plantas que se ha utilizado en la medicina tradicional japonesa para el tratamiento de algunas dolencias debido a su antitrombótico, antidepresivos y propiedades anti-bacterianas [17]. Los efectos anti-cancerígenos de honokiol se han investigado en una variedad de líneas celulares de cáncer, así como en algunos modelos de tumores y exhibir ninguna toxicidad aparente
in vivo
[18] - [25]. Nuestros estudios también han demostrado que honokiol ejerce efectos quimiopreventivos en el cáncer de piel inducido por la radiación ultravioleta y que este efecto está asociado con sus mediadores inflamatorios de orientación, tales como COX-2 y PGE
2 [25]. Sin embargo, poco se sabe acerca de si la invasión objetivos honokiol o potencial metastásico de células de cáncer de pulmón. A medida que el cáncer de pulmón es altamente metastásico, hemos tratado de determinar el efecto quimioterapéutico del honokiol en la migración de células de cáncer de pulmón o la invasión utilizando diversas líneas de células de cáncer de pulmón como un
in vitro
modelo. En la presente comunicación, hemos explorado los efectos quimioterapéuticos de honokiol sobre la posible migración /invasión de células de NSCLC humanos y comprobado si efecto inhibidor de honokiol sobre la migración celular se asocia con la inactivación de la señalización de β-catenina y si PGE
2 tiene ningún papel en este proceso. Para este propósito, se seleccionaron cuatro líneas celulares de NSCLC diferentes: A549, H1299, H460 y H226. línea bronquial humano normal de células epiteliales (BEAS-2B) se utilizó como control. A continuación, presentamos evidencia de que honokiol inhibe el potencial invasivo de las líneas celulares de cáncer por la orientación de activación
2 mediada por la señalización de PGE β-catenina.
(A) Estructura molecular de honokiol, un fitoquímico bioactivo de la
Magnolia
planta. (B) El potencial de la migración de células de diversas líneas de células de NSCLC se determinó usando un ensayo de cámara de Boyden. Números iguales de las células de cáncer se cargaron en la cámara superior de las cámaras de Boyden, se incubaron durante 24 h, y se detectaron las células migratorias en la membrana después de la tinción con cristal violeta. (C) Se contaron las células migratorias y los resultados se expresan como la media del número de células migratorias ± SD /campo microscópico seleccionado, n = 3, la ampliación:. X 10
Materiales y Métodos
Reactivos y anticuerpos
honokiol purificada se adquirió de Calidad fitoquímicos, LLC (Edison, NJ). Boyden Chambers y membranas de policarbonato (8 micras de tamaño de poro) para los ensayos de migración celular se obtuvieron de Neuroprobe (Gaithersburg, MD). Los anticuerpos específicos para β-catenina se adquirieron de amplificador de I + D; D Biosystems (Minneapolis, MN), celecoxib, PGE
2 fueron de Sigma Chemical Company, un kit de inmunoensayo enzimático para la PGE
2 Se obtuvo el análisis de Cayman Chemicals ( Ann Arbor, MI), mientras que los anticuerpos para fosfo β-catenina, CK1α, GSK-3β, metaloproteinasa de matriz (MMP) -2, MMP-9, la COX-2, NF-kB, IKK, I? B? y β-actina se obtuvieron de Señalización celular Tecnología (Beverly, MA). Los anticuerpos secundarios (de conejo anti-cabra y de cabra anti-conejo) conjugado con peroxidasa de rábano picante se compraron desde Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, CA).
Líneas celulares y cultivo celular
líneas celulares de cáncer , A549, H460, H226 y H1299, y la línea celular BEAS-2B se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Estas líneas celulares se mantuvieron y se cultivaron como se detalla anteriormente [26]. Honokiol se disolvió en un pequeño volumen de alcohol etílico, que se añadió al medio de cultivo celular completa cuando las células fueron sub-confluentes (60-70% confluentes). La concentración máxima de alcohol etílico no era más de 0,02% (v /v) en el medio de cultivo. Las células tratadas con alcohol etílico (0,02%, v /v) sólo sirvieron como un control del vehículo, tal como se utiliza anteriormente [27].
Cell Invasion Ensayo
Se determinó el potencial de invasión de las células de NSCLC
in vitro usando
Boyden Chambers (Gaithersburg, MD), como se describe anteriormente [26], [27]. Las células que migran en la superficie de las membranas se examinaron microscópicamente y la invasión celular se determinó contando las células que migran /invasivos en al menos 4-5 campos seleccionados al azar utilizando un microscopio Olympus BX41 y fotomicrografías se obtuvieron usando un sistema de cámara digital montado en Qcolor5 este microscopio. Cada experimento se repitió dos o tres veces y los datos de la invasión de células resultantes se presentan en términos de la media del número de células invasoras o que migran ± SD campo /microscópica (magnificación, × 10).
Curación de heridas o arañazos Ensayo
ensayo de cicatrización de la herida se realizó para examinar la capacidad de migración de las células de NSCLC, como se detalla anteriormente [28]. Brevemente, las células de NSCLC se hicieron crecer hasta la confluencia completa en placas de seis pocillos y se incubaron durante la noche en medio de inanición. monocapa de células se raspó con una punta de pipeta fina estéril y se lavó con medio para eliminar las células desprendidas de las placas. Las células se mantuvieron en una incubadora con o sin tratamiento con honokiol en medio de cultivo completo para 36 h. Después de 36 h, el medio se reemplazó con tampón de PBS. La brecha de la herida se observó bajo microscopio Olympus BX41 y las células se fotografió usando una cámara digital Qcolor5.
viabilidad celular Ensayo
El efecto de honokiol en la capacidad de proliferación o viabilidad de las células de la bronquial humano normal células epiteliales y células de NSCLC se determinó utilizando 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) ensayo como se describe anteriormente [26].
prostaglandina e
2 Inmunoensayo
Cayman PGE
2 inmunoensayo enzimático Kit (Ann Arbor, MI) se utilizó para medir los niveles de PGE
2 en los homogeneizados de células siguiendo las instrucciones del fabricante, como también se describe anteriormente [27] .
NF-kB /p65 Ensayo de la actividad
se determinó la actividad /p65 NF-kB mediante el NF-kB Trans
AM actividad Kit de ensayo (Active Motif, Carlsbad, CA) siguiendo el protocolo del fabricante, y también se ha descrito previamente [27]. Los resultados sobre la actividad /p65 NF-kB en las células se expresan como el porcentaje de la densidad óptica del grupo de control no tratados con honokiol.
COX-2 pequeños ARN de interferencia (siRNA) Transfección de células de NSCLC
líneas A549 y células H1299 se transfectaron con humanos específicos de COX-2 siRNA usando el kit de reactivo de transfección siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Inc .; Santa Cruz, CA) siguiendo el protocolo del fabricante. En resumen, 2 × 10
5 células /pocillo fueron sembradas en una placa de 6 pocillos y se dejaron crecer hasta un 70% de confluencia. La mezcla de siRNA COX-2 con reactivos de transfección se superpone sobre las células durante aproximadamente 6 h en una cámara de incubación y se transfirió a 2 × medio de crecimiento durante aproximadamente 20 h. A las 24 h después de la transfección, se añadió medio fresco y se incubaron las células durante un período adicional de 48 h como se detalla anteriormente [29]. A partir de entonces, se recogieron las células y se sometieron al ensayo de migración celular. La caída de la COX-2 expresión en células A549 y H1299 después de la transfección se verificó como se describe anteriormente [29].
Análisis Western Blot
células de NSCLC fueron tratados con o sin honokiol u otros agentes de de interés para el período de tiempo deseado, a partir de entonces las células se recogieron y se lisaron con tampón de lisis enfriado en hielo suplementado con inhibidores de la proteasa, tal como se describe anteriormente [26], [30]. Las proteínas se resolvieron por electroforesis en 8-10% de geles de Tris-glicina y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Después de bloquear los sitios de unión no específicos, la membrana se incubó con el anticuerpo primario a 4 ° C durante la noche. Las membranas se lavaron y después se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa y las bandas de proteína específicas se detectaron utilizando los reactivos de quimioluminiscencia. Para verificar la carga igual de proteínas en los geles, la membrana se desnudó y se volvió a sondear con cualquiera de actina anti-β o anticuerpo anti-H3 histona.
Análisis estadístico
Para los ensayos de migración celular, los datos en el grupo de control fueron comparados con honokiol-, PGE
2 o grupos de tratamiento con celecoxib separado mediante análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) utilizando GraphPad Prism versión 4.00 para Windows (GraphPad software, San Diego, California. www. graphpad.com.). Todos los datos cuantitativos se muestran como media ± desviación estándar. En cada caso
P
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
Análisis comparativo del potencial invasor de las células de NSCLC humano
En primer lugar, determinado el potencial invasivo comparativo de las diferentes líneas celulares de cáncer, como el A549, H1299, H460 y H226, utilizando cámara de Boyden ensayo. La incubación de las células de NSCLC durante 24 h en la cámara de Boyden resultó en un mayor número de migración de las células que refleja su capacidad de invasión. fotomicrografías representativas de células violeta manchado de cristal se muestran en la Figura 1B. células migratorias o invasivos se contaron bajo el microscopio, y los datos resultantes se presentan en términos de la media del número de células invasoras ± SD campo /microscópico (ampliación, × 10) (Figura 1C). Como se muestra en la Figura 1C, la capacidad de invasión de las células era casi idénticos excepto que el potencial invasivo de las células H226 fue comparativamente más bajo que otras líneas celulares. En condiciones idénticas, el potencial de migración de las células epiteliales bronquiales humanas normales fue significativamente menor que las células NSCLS (datos no mostrados).
migración de células Honokiol inhibe de células de NSCLC humano
El efecto de honokiol era determinado sobre la migración celular o potencial invasivo de la A549, H1299, H460 y H226 líneas celulares de cáncer humano utilizando ensayos de migración celular de la cámara de Boyden. Inicialmente, se realizó un experimento de detección para determinar los efectos de concentraciones más bajas de honokiol (M). Como se muestra en la Figura 2A, en relación con células de control, el tratamiento de células con honokiol no honokiol tratados a concentraciones de 0, 5, 10 y 20 mM durante 24 h reducen el potencial invasivo de estas células de cáncer de una manera dependiente de la concentración. La densidad de las células que migran en la membrana después de la tinción con violeta cristal se muestra en la Figura 2A, y los números de células que migran de campo /microscópico se resumen en la Figura 2B. La migración celular se inhibió en un 38 a un 66% (
P
& lt; 0,01 a 0,001) en las células A549, por 37 a 62% (
P
& lt; 0,01 a 0,001) en células H1299 , 12-58% (
P Hotel & lt; 0.05-0.001) en células H460 y 32-69% (
P Hotel & lt; 0.05-0.001) en células H226 de una manera dependiente de la concentración después del tratamiento con honokiol (Figura 2B). se observó comparativamente mayor efecto inhibidor de honokiol sobre la migración celular en el punto de tiempo de 48 h (datos no mostrados).
(A) El tratamiento de células de NSCLC con honokiol (0, 5, 10 y 20 mM) para 24 h inhibe la migración de células de una manera dependiente de la dosis. (B) Las células que migran se contaron en cada grupo de tratamiento y los resultados se presentan como la media del número de células migratorias ± SD /campo, n = 3. inhibición significativa en la migración celular
frente
no honokiol-tratados grupo de control, *
P Hotel & lt; 0,001,
†
P & lt; 0,01
;
¶
P Hotel & lt; 0,05. (C) la curación de heridas o ensayo cero se realizó para evaluar el efecto de honokiol en la capacidad de migración de las células de NSCLC. Las células se incubaron con o sin honokiol para 36 h. Honokiol inhibe la migración de células de una manera dependiente de la dosis en comparación con las células control (no tratados con honokiol). Control (0 h) del panel indica el espacio original entre las capas de células inmediatos después de hacer un rasguño o una herida. El espacio entre las líneas blancas rotas indica el espacio en gran parte no ocupada por las células de cáncer de pulmón. Las fotomicrografías representativas se muestran a partir de tres experimentos independientes. (D) El espacio vacío no ocupada por las células entre las capas de células se midió utilizando la escala micro red bajo el microscopio, y los datos se presentan como un espacio vacío en términos de micras ± SD para cada línea celular. inhibición significativa en la migración celular frente a los controles tratados no honokiol, *
P
. & lt; 0,001
El efecto inhibidor de honokiol sobre la migración celular CPNM fue verificado usando una cicatrización de heridas ensayo, tal como se describe en el material y Métodos. Para el ensayo de curación de la herida, se determinó el efecto de honokiol sobre la migración celular a las 36 h después de su tratamiento, mientras que en el ensayo de cámara de Boyden se determinó el efecto de honokiol después de 24 h. Fue debido al hecho de que en la cicatrización de heridas células primer ensayo unidos a las placas, a continuación, iniciar la proliferación y después iniciar la migración o iniciar la curación de las heridas. Por lo tanto, se tarda más tiempo. Como se muestra en la Figura 2C, en relación con células de control no honokiol tratados, el tratamiento de las células con honokiol (0, 10 y 20 mM) durante 36 h reduce la capacidad de migración de todas las líneas celulares (A549, H1299, H460 y H226) utilizados en este estudio de una manera dependiente de la dosis. La mayor brecha o espacio hiriendo entre las capas de células después de hacer una herida estaba cubierta por las células que migran con CPNM que no fueron tratados con honokiol. Sin embargo, el espacio vacío entre las capas de células fue menos cubierta por las células que migran tratados con honokiol y este efecto era dependiente de la dosis. La herida o el espacio vacío entre las capas de células se destaca por líneas discontinuas (Figura 2C). Estos datos sugieren además que honokiol inhibió la eficiencia migratoria de células de NSCLC. El espacio entre las líneas blancas rotas se midió microscópicamente en cada grupo de tratamiento. Como se resume en la Figura 2D, el espacio vacío entre las capas de células fue significativamente mayor en las células tratadas con honokiol (
P
& lt; 0,001) en comparación con células de control tratadas no honokiol. Esto demuestra que honokiol inhibe el proceso de migración de células de cáncer. Para verificar que la inhibición de la migración de células de cáncer por honokiol era un efecto directo sobre la capacidad de migración, y que no era debido a una reducción de la viabilidad celular, un ensayo de MTT se realizó utilizando células que fueron tratados de forma idéntica a los utilizados en los ensayos de migración. El tratamiento de células epiteliales bronquiales humanas normales (células BEAS-2B) y de NSCLC con honokiol a las concentraciones de 0, 5, 10 y 20 M no tuvo ningún efecto inhibidor significativo sobre la viabilidad celular, como se muestra en la Figura 3A.
(a) Un efecto dependiente de la dosis comparativo de honokiol sobre el potencial de proliferación de las células BEAS-2B y líneas de células de NSCLC, como se analizó mediante el ensayo de MTT. (B) Las células se trataron con varias concentraciones de honokiol durante 24 h, y los lisados celulares se sometieron a análisis de transferencia de Western para medir los niveles de COX-2. (C) Tratamiento de células A549 y H1299 con celecoxib, un inhibidor de la COX-2, por 24 h inhibe el potencial de migración de las células de una manera dependiente de la dosis. (D) El número de células que migran se contó sobre la membrana y los resultados se expresan como la media del número de células migratorias ± SD /campo a partir de tres experimentos separados. inhibición significativa por honokiol frente a las células de control tratadas no honokiol, *
P Hotel & lt; 0,001,
†
P Hotel & lt; 0,01,
¶
P
& lt; 0,05. (E) Efecto de celecoxib en los niveles de expresión de COX-2 en células A549 y H1299. Las células se trataron con varias concentraciones de celecoxib durante 24 h, después se recogieron y los lisados celulares se sometieron a análisis de transferencia Western para la medición de la COX-2 niveles. La densidad relativa de las bandas de proteína en transferencias se midió usando un programa ImageJ desarrollado en los Institutos Nacionales de Salud (http://rsb.info.nih.gov/ij) y normalizado con las bandas de beta-actina. En cada caso, grupo de control se le asigna una unidad arbitraria 1.0. (F) Transfección de células A549 y H1299 con COX-2 siRNA disminuye significativamente la migración celular. reducción significativa de la migración celular frente a las células tratadas con siRNA de control, *
P
. & lt; 0,001
El efecto inhibidor de honokiol en la migración de células de células de NSCLC se asocia con la reducción endógeno de la COX-2 expresión
Para examinar si honokiol inhibe la migración de células NSCLC apuntando a la expresión endógena de la COX-2, a fin de determinar los niveles de COX-2 en lisados de células tratadas con y sin honokiol mediante Western blot análisis. Como se muestra en la Figura 3B, el tratamiento de A549, H1299, H460 y H226 células con honokiol reducen los niveles de COX-2 expresión de una manera dependiente de la concentración en comparación con la expresión de COX-2 en los controles no tratados. Estos resultados sugieren que la inhibición de la migración de células de cáncer por honokiol puede estar asociada con la inhibición de la COX-2 expresión en células de cáncer.
Celecoxib, un selectivo de la COX-2 inhibidor, inhibe la migración de células NSCLC
para determinar si el efecto inhibidor de honokiol en la migración de células NSCLC es mediada a través de su efecto inhibidor de la COX-2 expresión, el mismo número de A549 y células H1299 se sometieron al ensayo de migración de células después del tratamiento con diversas concentraciones de celecoxib (0, 5 , 10, 20 M) durante 24 h. Como se muestra en la Figura 3C, el tratamiento de las células con celecoxib resultó en una reducción dependiente de la dosis en la capacidad de la migración celular de estas células en comparación con los controles no tratados con celecoxib. Los datos sobre la migración de células se resumen en la Figura 3D, lo que sugiere que el tratamiento de células con celecoxib inhibió significativamente (
P
& lt; 0,01 hasta 0,001) la migración de A549 y H1299 células de una manera dependiente de la dosis. Estos datos sugirieron que la inhibición de niveles constitutivos endógenos de COX-2 expresión se asocia con la inhibición de la migración de células NSCLC. Además, los niveles de COX-2 se comprobaron en los lisados de células tratadas o no tratadas con celecoxib utilizando el análisis de western blot. Western blot datos revelaron que el tratamiento de células A549 y H1299 con celecoxib durante 24 h dio como resultado la reducción de la expresión COX-2 en estas células, como se muestra en la Figura 3E.
selectivos de la COX-2 Desmontables Uso de siRNA conduce a la reducción el cáncer de la migración de células
la función de la COX-2 en la migración celular se verifica por medio de más de siRNA knock-down de la COX-2 en las células de NSCLC y se examina si conducirá a la inhibición de la migración celular en el cáncer Células. La transfección de las células A549 y H1299 con COX-2 siRNA resultó en una reducción significativa de la migración celular en A549 (79%,
P
& lt; 0,001) y H1299 (75%,
P & lt
;. 0.001) de las células después de 24 h en comparación con la migración de control de siRNA-transfectadas A549 y H1299 células (Figura 3F) guía
honokiol inhibe la producción de PGE
2 y PGE
2-Enhanced la migración celular en las células NSCLC
a medida que el efecto quimiopreventivo de honokiol en la capacidad de migración de células de 4 líneas celulares NSCLC diferentes era casi idéntica, hemos seleccionado 2 líneas celulares (A549 y H1299) para los estudios de aplicación suplementarias y mecanicistas. Como PGE
2 es un metabolito principal de la COX-2 y se ha implicado en la COX-2 mediada por efectos adversos, incluyendo la invasión y la metástasis de las células cancerosas; a fin de determinar los niveles de PGE
2 en las células tratadas con honokiol utilizando PGE kit de inmunoensayo
2. Nuestros resultados revelaron que el tratamiento de células con honokiol durante 24 h dio como resultado una reducción significativa en la producción de PGE
2 tanto en A549 (20 a 64%,
P
& lt; 0,01 a 0,001) y H1299 ( 13 a 65%,
P
& lt; 0,01-0,001) las células de una manera (Figura 4A dependiente de la dosis), lo que sugiere que la reducción de honokiol inducida por PGE
2 de producción puede estar asociada con un efecto inhibidor de la honokiol en la migración celular en estas células.
(a) Tratamiento de la A549 y células H1299 con honokiol reducen los niveles de PGE
2 de una manera dependiente de la dosis. Los niveles de PGE
2 se midieron en los lisados celulares utilizando PGE
2 kit de inmunoensayo y los resultados se expresan en términos de proteína pg /mg ± SD, n = 3. Reducción significativa frente a las células de control, *
P Hotel & lt; 0,001,
†
P Hotel & lt; 0,01. (B) Tratamiento de A549 y las células H1299 con honokiol inhibe PGE capacidad de migración de células
2-mejorada. Los datos sobre la capacidad de migración celular de las células se resumen como una media del número de células migratorias ± SD /campo microscópico, n = 2. inhibición significativa frente a PGE
2 tratamiento solo; *
P Hotel & lt; 0,001,
†
P
. & Lt; 0,01
A continuación, se examinó si PGE
2 aumentó la migración de células de NSCLC y si honokiol inhibe PGE
2 inducida por la migración celular en las células NSCLC humanos. Para este propósito, A549 y células H1299 fueron tratados con PGE
2 (10 mM) con y sin honokiol durante 24 h y la migración de células determinadas. El
in vitro dosis de tratamiento en la Red de PGE
2 fue seleccionado sobre la base de estudios anteriores [29], [31]. Se encontró que el tratamiento de células de NSCLC con PGE
2 resultó en un aumento significativo en la migración celular (
P
& lt; 0,05) en comparación con las células que no fueron tratados con PGE
2 ( Figura 4B). El tratamiento de células A549 y H1299 con honokiol (10 y 20 mM) resultó en una inhibición significativa (
P
& lt; 0,01 a 0,001) de PGE
2 (10 mM) la migración celular inducida (Figura 4B) .
honokiol inhibe la actividad de NF-kB /p65 en las células NSCLC: NF-kappa B es un importante regulador de Cancer Cell Invasion /migración
NF-kB es un regulador aguas arriba de la COX 2; por lo tanto, se determinó si honokiol afecta a la actividad, así como los niveles de proteínas de la familia NF-kB en las células de NSCLC. Para este propósito, de nuevo A549 y H1299 células fueron tratadas con honokiol (0, 5, 10 y 20 mM) durante 24 h, y después se recogieron las células y los lisados nucleares y lisados de células enteras se prepararon para el análisis de transferencia Western. El análisis de transferencia Western reveló que el tratamiento de células con honokiol reduce la acumulación nuclear de NF-kB /p65 de una manera (Figura 5A) dependiente de la dosis. La actividad de NF-kB /p65 también se redujo significativamente (
P
& lt; 0,05 y
P
& lt; 0,001) después del tratamiento de las células con honokiol (Figura 5B). Nuestros datos también revelaron que el tratamiento de honokiol resultó en la supresión de IKK, una enzima responsable de la activación de NF-kB, evitando la degradación de I? B? (Figura 5A). A fin de verificar si NF-kappa B tiene un papel en la migración de células NSCLC, A549 y células H1299 se trataron con un potente inhibidor de NF-kappa B, se determinó éster de ácido cafeico fenetilo (CAPE), y la migración celular. Como se muestra en la Figura 5C y 5D, el tratamiento de las células con el cabo durante 24 h como resultado una reducción dependiente de la dosis de la migración celular de A549 (42 a 78%,
P
& lt; 0,05 a 0,001) y H1299 ( 41 a 76%,
P
& lt; 0.05-0.001) las células con respecto al control de las células tratadas no honokiol, y este efecto de CAPE fue similar a la observada en el tratamiento de las células con honokiol (Figuras 2A, 2B). Además, también comprobamos el efecto de CAPE en las proteínas de la familia NF-kB en las células A549 y H1299 utilizando análisis de Western blot. Como se muestra en la Figura 5E, el tratamiento de las células con el cabo resultó en la supresión de los niveles de NF-kB /p65 y IKK en ambas líneas celulares en una manera dependiente de la dosis.
células (A) A549 y H1299 se trataron con concentraciones variables de honokiol durante 24 h, se recogieron las células y citosólicas y nucleares fracciones se sometieron a análisis de transferencia Western. actividad /p65 3. NF-kappa B (B) La actividad de NF-kB /p65 en las fracciones nucleares de células se midieron usando kit de ensayo de la actividad de NF-kB /p65-específico, n = se expresa en términos de porcentaje de no control de las células tratadas con honokiol. inhibición significativa
frente
control, *
P Hotel & lt; 0,001,
¶
P Hotel & lt; 0,05. (C) El tratamiento de células con el cabo, un inhibidor de NF-kappa B, por 24 h inhibe la migración de las células de una manera dependiente de la dosis. (D) Los datos sobre la migración celular se resumen como la media del número de células que migran ± SD por microscopio de campo /grupo. inhibición significativa
frente
grupo de control, *
P Hotel & lt; 0,001,
¶
P Hotel & lt; 0,05. (E) El tratamiento de las células con el cabo de 24 h inhibe los niveles de NF-kB y IKK como se determina mediante análisis de transferencia Western.
honokiol inhibe la acumulación nuclear de β-catenina
PGE
2 se ha demostrado que activan la vía de señalización de β-catenina que ha sido implicado en el crecimiento celular del cáncer, invasión y metástasis [12], [13]. Como hemos encontrado que el tratamiento de células de NSCLC con honokiol inhibe los niveles de PGE
2 e inhibe PGE
migración de las células de cáncer de pulmón 2 mejorada, tenemos determinó además si la inhibición de la migración de células NSCLC por honokiol también se asocia con la supresión de la señalización de β-catenina. Para este propósito, A549 y células H1299 se trataron con honokiol durante 24 h, y las fracciones nucleares y citosólicas de lisados de células se sometieron al análisis de proteínas de señalización de β-catenina. El análisis de transferencia Western reveló que el tratamiento de células A549 y H1299 con honokiol resultó en una reducción de los niveles de β-catenina nuclear (Figuras 6A y 6B) de una manera dependiente de la dosis. Dado que, la acumulación nuclear de β-catenina se correlaciona inversamente con la fosforilación en determinados residuos clave de β-catenina (Ser
45, Ser
33, Ser
37 y Thr
41), se verificaron las efecto de honokiol en los niveles de fosforilación de β-catenina en estos sitios.