Extracto
La identificación de agentes orales que inhiben STAT-3, un factor de transcripción implicado en citosólica la activación de diferentes genes implicados en la progresión del tumor es una estrategia prometedora para la quimioprevención del cáncer. En el presente estudio, se investigó el efecto de la dieta sobre la astaxantina JAK-2 /STAT-3 de señalización en el 7,12-dimetilbenz [a] antraceno (DMBA) inducida por la bolsa de hámster bucal (HTA) modelo de carcinogénesis mediante el examen del ARNm y expresión de la proteína de JAK /STAT-3 y sus genes diana. RT-PCR cuantitativa, inmunotransferencia y análisis inmunohistoquímicos revelaron que los suplementos de astaxantina inhibe los eventos clave en la señalización de JAK /STAT especialmente STAT-3 de fosforilación y la posterior translocación nuclear de STAT-3. Además, la astaxantina downregulated la expresión de genes STAT-3 diana implicados en la proliferación celular, la invasión y la angiogénesis, y reducción de la densidad microvascular, evitando de este modo la progresión tumoral. análisis acoplamiento molecular confirmó efectos inhibidores de la astaxantina en la señalización STAT y la angiogénesis. experimentos de cultivo celular con la línea de células endoteliales ECV304 sustanciadas el papel de astaxantina en la supresión de la angiogénesis. En conjunto, nuestros datos proporcionan pruebas sustanciales de que la astaxantina de la dieta impide el desarrollo y la progresión de los carcinomas de HBP a través de la inhibición de JAK-2 /STAT-3 de señalización y sus eventos aguas abajo. Por lo tanto, la astaxantina que funciona como un potente inhibidor del desarrollo y progresión tumoral por la orientación de señalización JAK /STAT puede ser un candidato ideal para la quimioprevención del cáncer
Visto:. Kowshik J, Baba AB, Giri H, Deepak Reddy G, Dixit M, Nagini S (2014) Inhibe la astaxantina JAK /STAT-3 Señalización de abrogar la proliferación celular, la invasión y la angiogénesis en un modelo de hámster de cáncer oral. PLoS ONE 9 (10): e109114. doi: 10.1371 /journal.pone.0109114
Editor: Shree Ram Singh, Instituto Nacional del Cáncer, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Junio, 2014; Aceptado: September 8, 2014; Publicado: 8 Octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Kowshik et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una subvención del Departamento de Biotecnología, Nueva Delhi, India, bajo el 7º Programa Marco del Proyecto de Colaboración Conjunta Indo-UE sobre "FUNCFOOD '. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
transductor de señal y activador de la proteína de la transcripción 3 (STAT3) es un factor de transcripción citoplasmática latente que transmite señales desde la superficie celular al núcleo cuando se activa por citoquinas y factores de crecimiento [1]. En particular, la interleucina-6 (IL-6) o factor de crecimiento epidérmico (EGF) estimula la fosforilación de la proteína STAT3 por Janus quinasa y STAT3 activada forma un homodímero que se transloca al núcleo donde se regula la expresión de genes críticos para los procesos celulares normales tales como el desarrollo celular, la diferenciación, proliferación, supervivencia, angiogénesis, y la función inmune [2] - [6].
activación aberrante de la señalización /STAT3 JAK se ha documentado en una amplia variedad de tumores humanos, incluyendo hematopoyético neoplasias y tumores sólidos tales como cabeza y cuello, mama y de próstata [7], [8]. la activación de STAT3 Constitutiva contribuye a la proliferación y la oncogénesis por la modulación de la expresión de una variedad de genes necesarios para la supervivencia celular tumoral, la proliferación y la angiogénesis, así como la invasión y metástasis y comúnmente sugiere mal pronóstico [9] - [11]. Por lo tanto, la señalización de JAK /STAT3 desempeña un papel central en la tumorigénesis y se considera una importante diana terapéutica para el desarrollo de fármacos novedoso.
Identificación de agentes que se dirigen molécula STAT3 es probable que sea de importancia en la quimioprevención del cáncer. Varios antioxidantes de la dieta se reconocen para bloquear el desarrollo de tumores por la orientación de la red de señalización STAT3 [12] - [15]. La astaxantina, un no provitamina A carotenoide que se encuentra predominantemente en microalgas, hongos, plantas, productos del mar y algunas aves como el flamenco y la codorniz es un potente antioxidante [16]. La astaxantina se encontró que exhiben la mayor actividad antioxidante entre los carotenoides y es ampliamente utilizado en la prevención y tratamiento de diversas enfermedades [17]. AXT también se ha demostrado que exhiben propiedades anti-inflamatorias y contra el cáncer [18], [19].
Recientemente, hemos demostrado que la suplementación dietética de AXT induce apoptosis intrínseca mediante la inhibición de PI3 /Akt, MAPK, NF-kB y Wnt /β-catenina circuitos en el 7,12-dimetilbenz [a] antraceno (DMBA) inducida por la cavidad bucal del hámster (HTA) modelo de carcinogénesis [20] señalización. Estos resultados nos tentados a la hipótesis de que AXT que induce la apoptosis puede bloquear el proceso opuesto de la proliferación celular impidiendo de este modo la acumulación secuencial de mutaciones que finalmente conducen a la invasión tumoral y la angiogénesis. inactivación Por otra parte, inducida por AXT de los factores de transcripción NF-kB y β-catenina, cubos centrales en la señalización oncogénica también podría afectar la vía /STAT3 JAK. En el presente estudio hemos demostrado que la dieta AXT inhibe la progresión del tumor en base a la derogación de la vía JAK /STAT3 y su D1 abajo objetivos de ciclina, MMP-2, -9, y VEGF en el modelo de carcinogénesis de la HTA. Además AXT disminución de la densidad microvascular, que desempeña un papel esencial en el desarrollo y progresión del tumor. También se realizaron experimentos de cultivo celular con la línea de células endoteliales ECV304 para corroborar el papel de astaxantina en la supresión de la angiogénesis inducida por hipoxia.
Materiales y Métodos
Productos químicos
La acrilamida, bovino albúmina de suero (BSA), azul de bromofenol, 7,12-dimetilbenz [a] antraceno (DMBA), hidroxiurea, 2-mercaptoetanol, dodecil sulfato de sodio (SDS) N, N, N ', N' - diamina tetrametileno (TEMED) y Trizol se adquirieron de Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, EE.UU.. La astaxantina se adquirió de Bio-real, Suecia. medio DMEM-F12, que consiste en una solución antibiótica penicilina y estreptomicina y azul Alamar eran de HiMedia Labs, Mumbai, India. de suero fetal bovino de origen sudamericano era de Gibco, Invitrogen, Nueva York, EE.UU.. Poder SYBR Green PCR Master Mix se obtuvo de Applied Biosystems, California, EE.UU.. Los anticuerpos para IL-6, GAPDH, ciclina D1, PCNA, p21, MMP-2, MMP-9, TIMP-2, RECK, VEGF, VEGFR2, HIF1α, se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology, EE.UU.. PJAK-2
tyr1007 /1008, JAK-2, PSTAT-3
tyr705,-3 STAT y histonas (H2B) anticuerpos y BrdU, STAT-3
tyr705, el total de ciclina D1 y pVEGFR2
kits ELISA tyr1175 eran de Señalización celular Tecnología, EE.UU.. anticuerpo CD-34 se adquirió de Novocastra, Alemania. Matrigel fue de BD Biosciences, EE.UU.. Todos los demás reactivos utilizados fueron de grado analítico.
Animales y ética comunicado
De ocho a diez semanas de edad hámsters sirios macho con un peso entre 100-110 g se utilizaron en este estudio. Los animales se obtuvieron de Central Animal House, Universidad Annamalai, India. Los animales fueron alojados cuatro a una jaula y siempre con la dieta estándar de pellets y agua ad libitum. La salud de los animales se controló diariamente durante el estudio. Los protocolos de los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Institucional Animal, Universidad Annamalai y llevado a cabo de acuerdo con las directrices establecidas por el Comité para los fines de control y supervisión en los experimentos con animales (CPCSEA).
Tratamiento horario
Los animales fueron distribuidos aleatoriamente en grupos experimentales y de control y se dividieron en 4 grupos de 5 animales cada uno. En el grupo 1, las bolsas bucales derecha de hámsters se pintaron con 0,5% de DMBA en el líquido de parafina tres veces a la semana durante 14 semanas [21]. Grupo 2 animales recibieron además de DMBA, una dieta basal que contiene 15 mg /kg de peso corporal de astaxantina [20], [22]. Grupo 3 animales recibieron astaxantina (15 mg /kg de peso corporal) por sí sola durante 14 semanas. Grupo 4 animales recibieron la dieta basal sola y sirvió como un control no tratado. El experimento se terminó a las 14 semanas y todos los animales fueron sacrificados por dislocación cervical después de un ayuno durante la noche. Los tejidos cavidad bucal se subdividieron y se procesan para su distribución a cada experimento inmediatamente.
se utilizó cultivo celular
VCE 304 línea celular y se cultivaron en medio basal DMEM con 10% de suero fetal bovino con antibióticos. ECV304 es una línea celular endotelial derivado de las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) a través de transformación espontánea [23]. En comparación con los cultivos primarios de células HUVEC, el uso de células ECV304 tiene una ventaja práctica ya que estas células presentan una mayor capacidad y reproducible para la angiogénesis in vitro son, pues, una opción ideal para ensayos de angiogénesis basados cultivo celular [24]. Los cultivos confluentes de células ECV304 se subcultivaron y se mantuvieron en CO
2 incubadora a 37 ° C. Para el ensayo de matrigel, las células se mantuvieron en medio basal DMEM con suero bovino fetal al 4%. Para la condición de hipoxia, las células fueron incubadas en cámara de hipoxia con O2.
extracción de RNA y cuantitativa en tiempo real RT-PCR
El ARN total de los tejidos bucales se extrajo de la bolsa 1%
usando el reactivo Trizol, como se describe anteriormente [25]. La concentración de ARN se determinó a partir de la densidad óptica a una longitud de onda de 260 nm (utilizando un OD260 unidad equivalente a 40 g /ml de ARN). 5 g de ARN total aislado se transcrito de forma inversa a ADNc en una mezcla de reacción que contiene 4 l de 5 x tampón de reacción, 2 l de mezcla de dNTP (10 mM), 20 unidades de inhibidor de RNasa, 200 unidades de virus aviar-mieloblastosis (AMV ) de la transcriptasa inversa y 0,5 g de oligo (dT cebador) (Promega, WI, EE.UU.) en un volumen total de 20 l. La mezcla de reacción se incubó a 42 ° C durante 60 min y la reacción se termina calentando a 70 ° C durante 10 min. El ADNc se almacenó a -80 ° C hasta su uso posterior.
Quantitative RT-PCR se realizó usando la mezcla maestra de alimentación SYBR Green acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizando un termociclador StepOne Plus (Applied Biosystems). Para el 1 × PCR Master Mix, se añadieron 2,5 l de cada ADNc en un volumen final de 20 l. Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 95 ° C durante 5 min, 40 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 sa 52 a 60 ° C (basado en el objetivo), y 60 s a 72 ° C. cambio veces cuantitativa relativa en comparación con el control se calculó utilizando el método comparativo Ct, donde Ct es el ciclo en el cual la fluorescencia primera supera el umbral. Los valores de Ct de cada muestra se obtuvieron restando los valores de GAPDH Ct del valor Ct del gen diana. La especificidad de los productos resultantes de la PCR se confirmó mediante curvas de fusión.
Western blotting
Las proteínas se extrajeron de la muestra de tejido usando tampón de lisis que contenía Tris 62,5 mM (pH 6,8), 10% de SDS, 5% 2-mercaptoetanol, 10% de glicerol y azul de bromofenol. Nucleares y citoplasmáticas fracciones fueron separados como se describe por Legrand-Poels et al. [26]. La misma cantidad de los extractos de proteína se cargaron en SDS-PAGE y las proteínas resueltas se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno. Las transferencias se incubaron a continuación durante 2 h en 1X PBS que contenía 5% de leche seca no grasa. Las membranas fueron sondadas con anticuerpos primarios y secundarios según las instrucciones del fabricante. Las proteínas se visualizaron utilizando reactivos de detección de quimioluminiscencia (Sigma). La densitometría se realizó en IISP escáner de cama plana y se cuantificó con el software total Lab 1.11.
ELISA
Los niveles de PSTAT
tyr705, ciclina D1 total y pVEGFR2
tyr1175 se determinaron utilizando ELISA sándwich kit (Señalización Cell Technology, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante.
la inmunohistoquímica
secciones de tejidos embebidos en parafina se deparaffinised, rehidratan y se someten a la recuperación de antígenos y el bloqueo de la peroxidasa endógena. A continuación, las secciones se incubaron con PSTAT-3 monoclonal de conejo, PCNA, MMP-2 y VEGF de conejo anticuerpos policlonales a temperatura ambiente durante 3 h. Los portaobjetos se lavaron con TBS y después se incubaron con anticuerpo secundario marcado con biotina seguido de estreptavidina-biotina-peroxidasa (Dako, Carprinteria, CA, EE.UU.) durante 30 min cada uno a temperatura ambiente. El inmunoprecipitado se visualizó por tratamiento con 3,3 'diaminobencidina y contratinción con hematoxilina. Los tejidos fueron fotografiados utilizando un microscopio de fluorescencia invertido (Leica Microsystems Vertrieb GmbH, Wetzler, Alemania) unida con la cámara digital de DFC295.
densidad microvascular (MVD)
densidad microvascular se evaluó mediante tinción inmunohistoquímica con anticuerpo anti-CD34. Las áreas de mayor neovascularización fueron localizados y las imágenes capturadas en un mínimo de cinco campos diferentes. Microvasos fueron contados por dos investigadores independientes y los datos representados como número de vasos /campo de visión.
acoplamiento molecular
acoplamiento molecular se realizó mediante Schrodinger suite de 2013. La astaxantina fue recuperado de PubChem (www .ncbi.nlm.nih.gov /pccompound) y las proteínas STAT-3 y VEGF se recuperan de la base de datos de proteínas con AP ID: 3CWG y 3V2A respectivamente. generación rejilla receptor y ligando de acoplamiento se llevaron a cabo mediante el empleo de algoritmo de acoplamiento Glide Xp.
Alamar azul ensayo
La viabilidad celular se midió por ensayo de Alamar Blue [27]. Brevemente, Alamar azul (sal de sodio de resazurina Himedia) se disolvió en solución salina tamponada con fosfato pH 7,4 para hacer un stock de 5 mg /ml y una concentración de trabajo final de 0,1 mg /ml en medio de cultivo celular. La resazurina es un indicador redox, que mide el ambiente reductor de la célula mediante la reducción a un resorufina altamente fluorescente. La astaxantina en diferentes concentraciones (5, 10, 20, 50, 100, 200 y 400 mM) se añadió a las células y después de 24 h, se añadió colorante azul Alamar y las placas se incubaron a 37 ° C durante 4 h. El cambio de color se controló colorimétricamente a 595 nm y 570 nm para evaluar oxidado frente a formas reducidas respectivamente del reactivo mediante el uso de lector de placas multi-modo.
ensayo BrdU
La proliferación celular se analizó midiendo la síntesis de ADN con el kit de bromodesoxiuridina (BrdU) ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) (Cell Signaling Technology, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, 1 × 10
4 células fueron sembradas en una microplaca de 96 pocillos y se cultivaron con o sin la astaxantina (50 M) durante 24 h. Después las células se marcaron con BrdU durante 6 h. Después de la fijación, las células se incubaron con 100 l de anticuerpo anti-BrdU de 60 min. Después del lavado, se añadieron 100 l de anticuerpo secundario y se incubaron durante 30 min, a continuación se añadieron 100 l de sustrato (tetrametilbencidina) a cada pocillo, y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min. La absorbancia a 450 nm se midió con un lector de ELISA.
Migración de ensayo
monocapas confluentes de células ECV 304 en placas de 24 pocillos se rayen con una punta de pipeta de 200 l y se incubaron en normoxia e hipóxica condiciones con y sin 50 mM de astaxantina. También se añadió hidroxiurea 5 mM para inhibir la proliferación celular. Las células se fotografiaron con un microscopio con un aumento de 4x a las 0 y 24 horas [28].
Matrigel la formación de tubos de ensayo
-Pre enfriado placas de 96 pocillos se recubrieron con 80 l de matrigel ( BD) y se incubó a 37 ° C durante media hora. se añadieron Igual número de células (20,000 /pocillo) en cada pocillo con y sin condición hipóxica y en presencia y ausencia de la astaxantina (50 mM) y se incubó en CO
2 incubadora a 37 ° C durante 14 horas. Las imágenes fueron capturadas en mínimos de cinco campos diferentes y los datos representados por último, como número de tubos /campo de visión [29].
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó mediante una prueba no paramétrica de Mann-Whitney (Estadísticas directa, Reino Unido) para
in vivo
y prueba de Tukey post-hoc para
in vitro
experimentos. Un valor de probabilidad menor de 0,05 fue considerado significativo.
Resultados
incidencia de tumores
La incidencia de tumores se ha informado en un estudio anterior [20]. Al final del período experimental de la incidencia del tumor fue de 100% con una carga tumoral media de 82.25 mm
3 en hámsters pintadas con DMBA (grupo 1). La suplementación dietética de astaxantina (15 mg /kg de peso corporal) para hámsters DMBA pintadas no indujo ningún tumor brutos en la cavidad bucal y el examen histológico revela sólo hiperplasia leve. En hámsteres alimentados astaxantina solos y en grupos de control, el epitelio normal, intacta, y continua.
astaxantina inhibe la señalización JAK /STAT mediante la restricción de la fosforilación de STAT-3
Como es STAT 3 constitutivamente activado en una amplia gama de tumores malignos, se analizaron primero la expresión de mRNA de JAK-2 y STAT-3 por análisis de RT-PCR cuantitativa. Nuestros resultados revelaron que la suplementación dietética de astaxantina redujo significativamente la expresión del ARNm de moléculas clave implicadas en la señalización JAK /STAT en comparación con los animales pintados por DMBA (Figura 1A). No se observaron diferencias significativas en los animales tratados con astaxantina solo comparado con el control. Además de explorar el mecanismo por el cual la astaxantina regula la señalización de JAK /STAT, determinamos siguiente la expresión proteica de IL-6, JAK-2, PJAK-2, STAT-3 y PSTAT-3 por el Western Blot. Hemos encontrado que la aplicación tópica de DMBA aumentó significativamente la expresión de estos genes en comparación con el control. administración dietética simultánea de la astaxantina inhibe la señalización JAK /STAT por la disminución de los niveles de IL-6, JAK /STAT formas fosforiladas y la subsiguiente translocación al núcleo (Figura 1B & amp; 1C). Esto fue confirmado por disminución del nivel de PSTAT
tyr705 (ELISA) en el grupo tratado AXT (Figura 1D). La tinción inmunohistoquímica confirmó que los suplementos de astaxantina resultó en disminución significativa en la expresión de PSTAT-3 en comparación con los animales DMBA pintado (Figura 1E)
(media ± SD, n = 3).. nivel de expresión A. Transcripción de JAK-2 y STAT-3 en varios grupos experimentales según lo determinado por PCR cinética. Los datos son la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes
♣ p. & Lt; 0,05 frente al control. * P & lt; 0,05 en comparación con DMBA. análisis de inmunotransferencia Representante B.. Las muestras de proteína (100 g /carril) se resolvieron en SDS-PAGE se probaron con anticuerpos correspondientes. GAPDH se utilizó como control de carga para citosol y todo el tejido homogeneizados. Histona H2B se utilizó como control de carga para las proteínas nucleares. proteínas fosforiladas se normalizan por su forma no fosforilada. C. El análisis densitométrico. La expresión de la proteína a partir de lisados de control para tres determinaciones fue designado como 100% en el gráfico. Cada barra representa la expresión de la proteína de tres determinaciones
♣ p & lt;. 0.05 versus control. * P & lt; 0,05 en comparación con DMBA. D. Los niveles de PSTAT
tyr705 (ELISA). E. fotomicrografías representativas de tinción inmunohistoquímica de PSTAT-3 en los animales de control y experimentales (20X).
astaxantina impide la proliferación celular, la invasión y la angiogénesis a través de la inhibición de la vía JAK /STAT
Como la activación de STAT-3 regula la transcripción de genes implicados en la proliferación celular, la invasión y la angiogénesis, el próximo investigó el efecto de la astaxantina sobre los marcadores de proliferación celular. Los suplementos dietéticos de astaxantina redujo significativamente la expresión de ARNm y de la proteína de la ciclina D1 y PCNA. Además, AXT aumentó p21 nuclear expresión relativa a la fracción citosólica. Además, la suplementación AXT disminución del nivel total de ciclina D1 (ELISA) en comparación con el grupo de DMBA (figura 2). Sin embargo, no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los hámsters astaxantina sola y el grupo de control alimentados
(media ± SD, n = 3).. A. Transcripción nivel de expresión de p21, ciclina D1 y PCNA en varios grupos experimentales según lo determinado por PCR cinética. Los datos son la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes
♣ p. & Lt; 0,05 frente al control. * P & lt; 0,05 en comparación con DMBA. análisis de inmunotransferencia Representante B.. Las muestras de proteína (100 g /carril) se resolvieron en SDS-PAGE se probaron con anticuerpos correspondientes. GAPDH se utilizó como control de carga para citosol y todo el tejido homogeneizados. Histona H2B se utilizó como control de carga para las proteínas nucleares. C. El análisis densitométrico. La expresión de la proteína a partir de lisados de control para tres determinaciones fue designado como 100% en el gráfico. Cada barra representa la expresión de la proteína de tres determinaciones
♣ p & lt;. 0.05 versus control. p & lt; 0,05 en comparación con DMBA. D. Los niveles de ciclina D1 totales (ELISA). E. fotomicrografías representativas de tinción inmunohistoquímica de PCNA en animales experimentales y de control (20X).
Para determinar si la inhibición de JAK vía /STAT por la astaxantina impide la invasión, el próximo analizado la expresión de MMP-2 , MMP-9 y sus inhibidores. La administración dietética de astaxantina modula significativamente la expresión de ARNm y de la proteína de estas moléculas en comparación con los animales del Grupo 1. A fin de validar que la astaxantina regula metaloproteinasas de la matriz, que también examinó la expresión de la proteína de MMP-2 mediante análisis inmunohistoquímico. Nuestros resultados revelaron que la administración de astaxantina disminuyó notablemente la expresión de MMP-2 en comparación con el grupo 1 los animales. . Por otra parte, no se observaron diferencias significativas en los animales alimentados astaxantina solo en comparación con el control (figura 3)
(media ± SD, n = 3). nivel de expresión A. Transcripción de MMP-2, MMP-9 y TIMP-2 en varios grupos experimentales según lo determinado por PCR cinética. Los datos son la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes
♣ p. & Lt; 0,05 frente al control. * P & lt; 0,05 en comparación con DMBA. B & amp; C. Representante inmunotransferencias y gráfico de barras que representa la expresión de la proteína de MMP-2, MMP-9, TIMP-2 y RECK por un mínimo de tres experimentos independientes
♣ p. & Lt; 0,05 frente al control. * P & lt; 0,05 en comparación con DMBA. D. fotomicrografías representativas de tinción inmunohistoquímica de MMP-2 en el control y los animales de experimentación (20X).
A medida que la neovascularización desempeña un papel importante en el crecimiento del tumor y es uno de los principales acontecimientos posteriores desencadenados por la vía JAK /STAT, se investigó el efecto de la astaxantina en la angiogénesis. Como se muestra en la figura 4, la suplementación dietética de astaxantina modula significativamente la expresión de VEGF, VEGFR2 y la disminución de la translocación nuclear HIF-1α comparación con los animales DMBA pintado. Por otra parte, la suplementación AXT disminuyó el nivel de pVEGFR2 (ELISA). La tinción inmunohistoquímica confirmó también disminuyó la expresión de VEGF en hámsteres alimentados astaxantina en comparación con los animales DMBA pintado. No se observaron diferencias significativas en los animales tratados con astaxantina solo comparado con el control
(media ± SD, n = 3).. A. Transcripción nivel de expresión de HIF-1α, VEGF y VEGFR2 en varios grupos experimentales según lo determinado por PCR cinética. Los datos son la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes
♣ p. & Lt; 0,05 frente al control. * P & lt; 0,05 en comparación con DMBA. análisis de inmunotransferencia Representante B.. Las muestras de proteína (100 g /carril) se resolvieron en SDS-PAGE se probaron con anticuerpos correspondientes. GAPDH se utilizó como control de carga para citosol y todo el tejido homogeneizados. Histona H2B se utilizó como control de carga para las proteínas nucleares. C. El análisis densitométrico. La expresión de la proteína a partir de lisados de control para tres determinaciones fue designado como 100% en el gráfico. Cada barra representa la expresión de la proteína de tres determinaciones
♣ p & lt;. 0.05 versus control. * P & lt; 0,05 en comparación con DMBA. D. Los niveles de pVEGFR2
tyr1175 (ELISA). E. fotomicrografías representativas de tinción inmunohistoquímica de VEGF en el control y los animales de experimentación (20X).
Como AXT disminución de la expresión de HIF-1α y VEGF, los principales actores implicados en la neovascularización, A continuación trató de determinar si inhibición de estas moléculas por AXT tiene algún efecto en la vasculatura mediante la medición de la densidad microvascular. animales DMBA pintado mostraron una alta vascularización con una media de 185 MVD en comparación con los animales control. La suplementación dietética de AXT redujo significativamente el número de buques en comparación con los animales pintados por DMBA, indicando el potencial antiangiogénico de astaxantina (figura 5).
A. fotomicrografías representativas de la densidad microvascular en el control y animales de experimentación (40X). B. gráfico de barras que representa el número de buques por un mínimo de tres experimentos independientes
♣ p. & lt; 0,05 frente al control. * P & lt; 0,05 en comparación con DMBA. C. gráfico de barras que representa la eslora del buque por un mínimo de tres experimentos independientes
♣ p. & lt; 0,05 frente al control. p & lt;. 0,05 frente DMBA
Para confirmar aún más la inhibición de STAT-3 de señalización y la angiogénesis por la astaxantina, se realizó el estudio de acoplamiento molecular de astaxantina con STAT-3 y VEGF. AXT se encontró que se unen con STAT-3 y VEGF con una puntuación de acoplamiento de -5.081 y -2,94, respectivamente. AXT interactúa con el sitio de la dimerización de STAT-3 para formar enlaces de hidrógeno con Met 1482, Glu 1523, Arg 1593 y Asn 539 e interactúa con VEGF a través de enlace de hidrógeno con Asp 41 residuo (Figura 6).
A. Representa forma enlaces de hidrógeno con Met AXT 1428, Glu 1523, 1593 y Arg Asn 538 de STAT-3. B. Representa forma enlaces de hidrógeno con ASP AXT 41 de VEGF.
Para probar el potencial antiangiogénico de astaxantina
in vitro
utilizamos células ECV 304. La angiogénesis es un proceso complejo que implica la proliferación celular, la migración y la formación de tubos. En primer lugar, se determinó la concentración de astaxantina en la que se inhibe la viabilidad de las células ECV por 50% (IC
50). Se utilizaron diferentes concentraciones de astaxantina a partir de 5 a 400 mM. Hemos encontrado que la astaxantina no reduce la viabilidad de las células ECV 304 a 50% a las concentraciones ensayadas. La viabilidad de las células fue de 100% hasta 50 M de astaxantina tal como se muestra en la figura 7; por lo tanto se utilizó la astaxantina en una concentración de 50 mM para experimentos adicionales. Para probar si la astaxantina inhibe la proliferación de las células endoteliales, se realizaron análisis con azul Alamar y ensayo de BrdU. la proliferación celular inducida por la hipoxia no se vio afectada por la astaxantina como se confirma por tanto ensayo BrdU, así como Alamar ensayo de azul (figura 7).
A. IC
50 valor de astaxantina en las células ECV304 (ensayo Alamar azul). B. Efecto de la astaxantina (50 M) sobre la proliferación celular inducida por la hipoxia (Alamar ensayo de azul). * P & lt; 0,05 frente a normoxia. C. Efecto de la astaxantina (50 M) sobre la proliferación celular inducida por la hipoxia (ensayo BrdU). * P & lt;. 0,05 frente a normoxia
La migración de células endoteliales es uno de los pasos clave en la angiogénesis y la metástasis; Por lo tanto, se determinó el efecto al lado de la astaxantina en la migración. Nuestros resultados revelaron que 50 M astaxantina inhibió significativamente la migración de las células endoteliales. Como se muestra en la figura 8, las células ECV hipóxicas emigraron sobre 437 micras después de 24 h; mientras que las células hipóxicas AXT tratado migraron sólo alrededor de 192 micras, lo que indica el potencial anti-migración de astaxantina
A & amp.; B. microfotografías representativas de ensayo de migración en las células control y ECV hipóxico a 0 hy 24 h (4X). C. Gráfico de barras que representa la distancia emigró por un mínimo de tres experimentos independientes
♣ p. & Lt; 0,05 frente a normoxia. p & lt;. 0,05 frente a la hipoxia
El paso principal durante la angiogénesis es la formación y fusión de tubos producidos por las células endoteliales que forman una red compleja de vasos, por lo tanto determinamos el efecto de la siguiente AXT en la formación de tubos por la realización de ensayo de formación de tubo de matrigel. Bajo condiciones hipóxicas, hubo aumento significativo en el número de tubos formado, así como la longitud del tubo en comparación con condiciones de normoxia. tratamiento astaxantina redujo significativamente el número de tubos y la longitud del tubo en la condición hipóxica. No se observaron diferencias significativas en las células tratadas con astaxantina en condiciones de normoxia (figura 9).
A. fotomicrografías representativas de ensayo de formación de tubo de matrigel en las células control y hipóxico ECV (4X). B. Gráfico de barras que representa no. de tubos por un mínimo de tres experimentos independientes
♣ p. & lt; 0,05 frente a normoxia. * P & lt; 0,05 frente a la hipoxia. C. gráfico de barras que representa la longitud del tubo por un mínimo de tres experimentos independientes
♣ p. & lt; 0,05 frente a normoxia. * P & lt;. 0,05 frente a la hipoxia
Para conocer el mecanismo por el cual inhibe la formación de AXT la migración y el tubo de las células endoteliales, se analizó la expresión de moléculas pro-angiogénicos en normoxia y 4 h, 8 h, y 16 h las células hipóxicas ECV. El análisis por inmunotransferencia reveló un aumento en la expresión HIF1α de 4 h que se mantuvo hasta 8 h hipoxia. VEGF y MMP-2 expresión aumentaron de 8 h en adelante y persistieron hasta 16 h. El tratamiento con hipoxia inducida por aumento AXT reducida en la expresión de estas moléculas (Figura 10) guía
A & amp.; B. inmunotransferencias representativas y gráfico de barras que representa la expresión de la proteína HIF-1α de, VEGF y MMP-2 por un mínimo de tres experimentos independientes. * P & lt;. 0,05 frente a la hipoxia
Discusión
Varios estudios han documentado que la activación aberrante de la vía de señalización de STAT-3 contribuye a la transformación neoplásica en diversos tumores malignos, y se han validado STAT- 3 como un objetivo prometedor para la terapia del cáncer [11], [30], [31]. El desarrollo de agentes que se dirigen a STAT-3 con la potencia adecuada y la selectividad tumor ha demostrado ser una tarea difícil. Los estudios realizados por otros y nosotros hemos indicado que los fitoquímicos están involucrados en la quimioprevención del cáncer mediante la modulación de los circuitos de señalización aberrante en el cáncer [32] - [35]. En el presente estudio, hemos demostrado que la astaxantina inhibe la ruta de señalización JAK /STAT-3, así como sus genes diana en el modelo de carcinoma de la HTA.
Las funciones de las proteínas STAT-3 dependen principalmente de su fosforilación y subcelular localización. En las células no estimuladas, las STAT-3 proteínas están presentes en la forma inactiva en el citosol. La activación de STAT-3 se produce a través de la fosforilación de su residuo de tirosina por la señalización de receptor de citoquina o factor de crecimiento. Fosforilada STAT-3 entonces se dimeriza y se transloca al núcleo donde se une a IFN-gamma activado por sitio (GAS) en el ADN y activa la transcripción de genes diana [12]. se encuentra STAT-3 para ser constitutivamente activa en diferentes carcinomas y la inhibición de la activación de STAT-3 se correlaciona con la supresión de las células malignas, tanto
in vitro
y
in vivo
[36], [37] . Los resultados del presente estudio proporcionan pruebas de que los suplementos de astaxantina abroga la activación constitutiva de STAT-3 mediante la prevención de su fosforilación y translocación nuclear subsiguiente. Además, la interacción de AXT con el sitio de la dimerización de STAT-3 por estudios de acoplamiento molecular también valida la inhibición de STAT-3 por AXT. La astaxantina ha demostrado inhibir carcinoma hepatocelular de rata células CBRH-7919 mediante la modulación de la vía JAK /STAT-3 de señalización [38].