Extracto
El cisplatino, un agente quimioterapéutico de uso general, se asocia con la ototoxicidad, nefrotoxicidad y neurotoxicidad, identificando así la manera de aumentar el índice terapéutico de cisplatino puede permitir la mejora de los resultados. Un impulso SNP (rs4343077) dentro de
EPS8
, descubierto a través de un estudio de asociación del genoma completo de la citotoxicidad y la apoptosis inducida por cisplatino en líneas celulares linfoblásticas (LCLs), siempre que estudiar más a fondo este gen. El propósito de este trabajo fue evaluar el papel de los
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en la susceptibilidad celular a cisplatino en las células cancerosas y no cancerosas. Utilizamos
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interferencia de ARN para determinar el efecto de la disminución de
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expresión de LCL y sensibilidad de las células de cáncer de pulmón A549 al cisplatino.
EPS8
caída en LCL resultó en un incremento del 7,9% en la supervivencia inducida por cisplatino (
P
= 1.98 × 10
-7) y una disminución del 8,7% en la apoptosis (
P
= 0,004) en comparación con el control. Por el contrario, la reducción de
EPS8
expresión en células de cáncer de pulmón resultó en una disminución del 20,6% en la supervivencia inducida por cisplatino (
P = 5,08
× 10
-5). Luego investigó un
inhibidor EPS8
, mitramicina A, como un agente potencial para aumentar el índice terapéutico de cisplatino. Mitramicina Una disminución de
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expresión en LCL produzcan una disminución en la sensibilidad celular a cisplatino como se evidencia por una menor activación de la caspasa 3/7 después del tratamiento con cisplatino (42,7% ± 6,8% en relación con el control de
P = 0,0002
). En 5 líneas celulares de células no pequeñas de carcinoma de pulmón (NSCLC), mitramicina A también dio lugar a la disminución de
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expresión. Adición de mitramicina 4 líneas celulares de NSCLC y una línea celular de cáncer de vejiga, dio lugar a aumento de la sensibilidad a cisplatino que fue significativamente más pronunciado en líneas celulares de tumor que en las líneas de LCL (p & lt; 0,0001). Una línea de células de NSCLC mutante EGFR (H1975) no mostró ningún cambio significativo en la sensibilidad a cisplatino con la adición de tratamiento mitramicina. Por lo tanto, un inhibidor de
EPS8
, como mitramicina A, podría mejorar el tratamiento de cisplatino mediante el aumento de la sensibilidad de tumor con respecto a las células normales
Visto:. Gorsic LK, Stark AL, Wheeler HE, Wong SS, Im HK, Dolan ME (2013)
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inhibición Aumenta la sensibilidad cisplatino en células de cáncer de pulmón. PLoS ONE 8 (12): e82220. doi: 10.1371 /journal.pone.0082220
Editor: John D. Minna, Univesity de Texas Southwestern Medical Center en Dallas, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Junio, 2013; Aceptado: 24 Octubre 2013; Publicado: 19 de diciembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Gorsic et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores son agradecidos a Instituto Nacional de Salud, Instituto Nacional de Ciencias Médicas generales UO1GM61393 (MED), Instituto Nacional de Salud clínica y traslacional Ciencia Premio TL1 RR25001 (ELA), Instituto Nacional de Biología del cáncer Salud subsidio de estudios T32CA009594 (HEW). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cisplatino es un agente de platino utilizado para el tratamiento de la cabeza y cuello, de ovario, cervical, testicular, y cáncer de pulmón; sin embargo toxicidades graves y resistencia intrínseca /adquirido interfieren con su eficacia [1]. La comprensión de los mecanismos genéticos y moleculares por los cuales este agente quimioterapéutico causa efectos secundarios tóxicos sería de gran beneficio para los pacientes. En particular, la identificación de genes cuya expresión contribuye a la toxicidad que permitiría el desarrollo de la quimioterapia para evitar efectos tóxicos.
Nuestro laboratorio ha desarrollado un modelo preclínico farmacogenómica la utilización de líneas de células linfoblastoides (LCLs) para identificar variantes genéticas asociadas con susceptibilidad a agentes quimioterapéuticos para complementar y mejorar los estudios de farmacogenómica clínicos [2] - [5]. Es importante destacar que las variantes identificadas en el enfoque basado en células se han demostrado que se asocia con la respuesta en el cáncer de ovario [6], cáncer de pulmón [7], de cabeza y cuello [8], y la neuropatía periférica paclitaxel inducida en pacientes con cáncer de mama [ ,,,0],9], proporcionando confianza en el modelo basado en células para la identificación de variantes clínicamente relevantes.
para la mayoría de los estudios de LCL, inhibición del crecimiento celular inducida por el fármaco se midió el fenotipo farmacológico, sin embargo este es un fenotipo amplio que incluye los procesos celulares conduce a la necrosis, la muerte celular a través de las vías de apoptosis y no apoptóticas, la detención del ciclo celular, y las células dañadas sometidos a reparación de ADN [10]. La apoptosis, un fenotipo más específica, podría arrojar luz sobre los polimorfismos relevantes nucleótido único (SNP) asociados con la respuesta cisplatino en pacientes, ya que el cisplatino se sabe que causa la muerte celular a través de una vía de apoptosis [11]. Por lo tanto, en un estudio anterior se trataron HapMap LCLs con cisplatino y se midió la activación de caspasa 3/7, así como inhibición del crecimiento celular [12]. Un GWAS reveló 2449 y 1629 SNPs SNPs sugestivamente asociado con la apoptosis y la citotoxicidad inducida por cisplatino (
P Hotel & lt; 0,001), respectivamente, con 19 SNPs se superponen [12]. Uno de los SNPs común, rs4343077, en la que el alelo menor tenía baja la apoptosis inducida por cisplatino (
P = 0,0007
) y superior survivial (
P = 0,0007
) es también un rasgo cuantitativo locus de expresión (eQTL) asociado con el gen de referencia los niveles de expresión de 28 genes a
P
≤10
-4 [12]. Este SNP se encuentra en un intrón de crecimiento epidérmico receptor del factor de sustrato ruta 8 (
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).
Curiosamente,
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se ha relacionado específicamente con cisplatino y paclitaxel inducida por la respuesta al fármaco, donde las células de cáncer cervical se hicieron más sensibles al tratamiento con fármaco después de
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knockdown [13]. Recientemente,
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También se encontró que se sobreexpresa en los gliomas malignos humanos y promueve su crecimiento celular [14]. Los estudios han reportado una mayor expresión de
EPS8 Hoteles en otros diversos tumores humanos, incluyendo ovario, colorrectal, de pulmón, pituitaria y el cáncer oral [15]. Como resultado,
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atenuación se ha demostrado que afectan la migración celular y la proliferación celular en células de cáncer [15].
Debido a la importancia de
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en respuesta a cisplatino en las células tumorales [13] y nuestra identificación de un SNP dentro de
EPS8 gratis (rs4343077) asociado tanto con cisplatino citotoxicidad y la apoptosis [12], se evaluó adicionalmente la relevancia de
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en la sensibilidad al cisplatino. Con este fin, hemos utilizado siRNA contra
EPS8 Opiniones y un conocido
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inhibidor, mitramicina. Regulación a la baja usando siRNA y /o la inhibición de
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por mitramicina resultó en una disminución mayor inhibición del crecimiento celular en células de cáncer de pulmón mutante no de EGFR y una línea celular de la vejiga tras el tratamiento con cisplatino. Nuestro estudio identifica la importancia de
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en la citotoxicidad inducida por cisplatino.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares
Nueve LCL (GM6991, GM7348, GM10838 , GM11994, GM12239, GM10859, GM11830, GM11840, GM12156) derivado de los individuos del norte y la ascendencia de Europa occidental (HapMap CEU) se mantuvieron en medio RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al 15% (Hyclone, Logan, Utah, EE.UU.) y 20 mM L-glutamina. Las líneas celulares se diluyeron 3 veces a la semana a una concentración de 350.000 células /ml. A549, NCI-H1437, NCI-H1563 y NCI-H1975 (líneas celulares de carcinoma de pulmón de células no pequeñas humano) se mantuvieron en RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al 10%. NCI-H2126 (línea celular de carcinoma de pulmón de células no pequeñas humano) se mantuvo en DMEM: F12 que contenía 0,005 mg /ml de insulina, 0,01 mg /ml de transferrina, 30 nM de selenito de sodio, 10 nM de hidrocortisona, 10 nM beta-estradiol, extra 2 mM L-glutamina y suero bovino fetal al 5% (medio sugerido por ATCC). HTB9 (línea celular de carcinoma de vejiga urinaria grado II) se mantuvo en RPMI 1640 y suero bovino fetal al 10%. Todas las líneas celulares se almacenaron en una incubadora de 37 ° C con 5% de CO
2. Las células cancerosas, mediano y componentes se adquirieron de ATCC (Manassas, Virginia, EE.UU.), Cellgro (Herndon, Virginia, EE.UU.) o Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, Missouri, EE.UU.).
Medicamentos
cisplatino y mitramicina a se adquirieron de Sigma-Aldrich Co. dimetil sulfóxido se utilizó para diluir cisplatino a un almacén 20 mM, mientras que mitramicina se diluyó a una concentración de solución madre de 0,06 M usando tampón fosfato salino.
Correlación entre los
EPS8 Opiniones y fenotipos
pangenómicos de datos de expresión génica fueron generados en nuestro laboratorio con Affymetrix GeneChip Human exón 1,0 ST matriz matriz [16] y todos los datos en bruto exón serie han sido depositado en la Expresión génica Omnibus (no la adhesión. GSE7761).
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los niveles de expresión de los genes se correlacionaron con 5 M cisplatino citotoxicidad inducida y la apoptosis [12] en el CEU LCL (n = 77). análisis de regresión lineal entre
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niveles y cada fenotipo se realizaron utilizando GraphPad Prism 4.
interferencia de ARN
Se llevaron a cabo experimentos de caída para demostrar los efectos de menor
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niveles de citotoxicidad y apoptosis inducida por cisplatino. El uso de Lonza línea celular de 96 pocillos Nucleofector Kit SF (Lonza Inc, Basilea, Suiza), LCL y A549 se nucleofected 24 horas después de haber sido sembradas a 5,5 × 10
5 células /ml y 4,0 × 10
5 células /ml, respectivamente. Las células se centrifugaron a 90 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente y se resuspendieron a una concentración de 1 × 10
6 células /20 l en solución SF /suplemento y 2 mM de concentración final de de AllStars control negativo siRNA marcadas con AlexaFluor488 (Qiagen Inc., Valencia, CA, EE.UU.) o un grupo de Hs_EPS8 (SI00380737, SI03109302, SI00380751, SI00380744) FlexiTube siRNA (Qiagen). Programa de DN-100 se utilizó para LCL nucleofection y CM-130 para A549. Las células se les dio 10 minutos de descanso antes de la adición de medio RPMI, a continuación, chapados para la citotoxicidad o apoptosis y se incubaron durante la noche.
citotoxicidad después de siRNA o el tratamiento con mitramicina
Un ensayo de inhibición del crecimiento celular se alamarBlue usado para medir los efectos citotóxicos del cisplatino y mitramicina [17]. Para
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siRNA experimentos, LCL (GM6991, GM7348, GM10838, GM11994 y GM12239) fueron tratados con cisplatino 5 M 5 horas post nucleofection, mientras que el A549 fue tratado con 5 M de cisplatino 24 horas después de nucleofection. Se incubaron las siguientes celdas de tratamiento de drogas durante 24 horas. Después, se añadió alamarBlue y las placas se incubaron durante 24 horas adicionales antes de su lectura a longitudes de onda de 570 y 600 nm usando el Synergy HT (Biotek, Winooski, VT) y el porcentaje de supervivencia se calculó [12]. Para observar la respuesta citotóxica con
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caída a través mitramicina, las células (GM10859, GM11830, GM11840, GM12156, A549, H1437, H1563, H1975, H2126 y HTB9) y se colocaron en placas tratadas con cualquiera de mitramicina solo (0 y 0,01 M), cisplatino solo (0, 1, 2,5, 5, 10 20, 25 y 50 mM) o cisplatino a diversas concentraciones en combinación con 0,01 M de mitramicina. mitramicina tratamiento se produjo inmediatamente después de la siembra. Las células se trataron luego con cisplatino 6 horas después de la adición mitramicina y 10% del volumen total de bien alamarBlue se añadió 24 horas después del tratamiento con cisplatino. Después de un periodo adicional de 24 horas de incubación, se leyeron las placas como se ha indicado anteriormente. Todos los experimentos para las mediciones de porcentaje de supervivencia se sembraron por triplicado con un mínimo de dos experimentos separados.
Apoptosis ensayo
cisplatino y la apoptosis inducida por mitramicina se midieron usando la caspasa-Glo reactivo de 3/7 Promega Corporation (Madison, WI) tal como se describe anteriormente [12]. Para
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siRNA experimentos, células sembradas fueron tratados con cisplatino 5 M 5 horas después nucleofection y la caspasa 3/7 se midió 24 horas después del tratamiento con cisplatino. Para evaluar
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expresión génica después de la exposición mitramicina, se sembraron las células y se trataron inmediatamente con mitramicina (0 ó 0,01 M), a continuación se trató con 5 M cisplatino 20 horas después de la adición mitramicina. Caspasa 3/7 actividad se midió 24 horas después de cisplatino y se calcula como relación con el control (sin adición de fármaco). Los resultados de las mediciones de la apoptosis representan experimentos chapada por triplicado con un mínimo de dos repeticiones independientes.
Cuantificación desmontables de
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Las células se sedimentaron a los 5, 29, y 53 hrs después nucleofection con
EPS8
revueltos siRNA y de control, así como 6 y 20 horas después del tratamiento mitramicina. El ARN se extrajo usando el kit RNeasy Mini Plus y QIAcube (Qiagen) siguiendo el protocolo del fabricante. El ARNm se transcribe a continuación a cDNA inversa produciendo concentraciones finales de 25 o 50 ng /l utilizando la alta capacidad Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Life Technologies, Grand Island, NY). El cDNA se utilizó para realizar QRT-PCR para confirmar la caída de la
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[18]. imprimación Applied Biosystems TaqMan se utilizó para cuantificar la expresión de ARNm de
EPS8 gratis (Hs00610286_m1).
Efectos mixtos modelo
El efecto de
EPS8
caída de cisplatino inhibición de la apoptosis inducida por el crecimiento y se modeló utilizando el siguiente modelo de efectos mixtos: líneas
experimento y celulares fueron efectos aleatorios que permitan experimento específico y la línea celular intercepta específicas y el estado de caída fue considerado un efecto fijo. Y representa la inhibición de la apoptosis o el crecimiento. Los valores de p para el efecto de caída se calcularon utilizando la prueba de razón de verosimilitud con modelos se ajustan con juego REML en false. Bondad de ajuste de los modelos se evaluó examinando las distribuciones de los residuos. el software estadístico R (R Development Core equipo http://www.R-project.org/) y el
lme4
paquete (versión del paquete R 0,999375-42 http://CRAN.R-project.org/paquete = lme4) se utilizaron para el análisis.
interacción de mitramicina ± cisplatino
para probar el efecto de la interacción del tipo de células (tumorales vs LCL) y el tratamiento mitramicina en la curva de respuesta a la dosis de cisplatino encajamos a efectos mixtos. El modelo final fue: ¿dónde estaba el logaritmo natural de la supervivencia por ciento del resultado y el tumor (estado versus estado LCL) y el tratamiento mitramicina (TRT) fueron efectos con interacción plazo fijo; exp se indica una de las dos réplicas biológicas y fue equipado como efecto aleatorio; dosis de cisplatino y su cuadrado fueron utilizados para modelar la curva de respuesta a la dosis que permite ser diferentes para las líneas de tumor y LCL; Identificación línea celular se añadió como un efecto aleatorio para dar cuenta de la correlación dentro de la línea celular. Al montar el modelo de los resultados a concentración cero de ambos fármacos (filas donde se computó el resultado de supervivencia = 1 debido a la forma en la supervivencia por ciento) fueron excluidos. transformación logarítmica se utiliza para mejorar el ajuste del modelo. El coeficiente del término de interacción tumor:trt se puede interpretar como el cambio promedio de la curva de respuesta a la dosis cuando mithrmycin se añadió a las líneas tumorales en relación con las líneas de LCL.
Resultados
desmontables con éxito de
EPS8
través de la interferencia de ARN
Cinco CEU LCL y la línea celular de cáncer de pulmón A549 se utilizaron para los estudios que implican
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caída. Las células se nucleofected ya sea con un control mezclado o ARNip de
EPS8
. En comparación con el control mezclado,
EPS8
knockdown ha demostrado ser exitoso en todos los 6 líneas de células (Fig. 1A). Los porcentajes medios de
EPS8
en todos LCL en el 5, 29, y 53 puntos de tiempo fueron de 17,2 h (± 7,5), 19,0 (± 4,3) y 40,6% (± 7,3), respectivamente. A549 alcanzó
EPS8
caída hasta el 7,4% y el 10,5% en comparación con el control mezclado a las 29 y 53 horas, respectivamente.
Los valores incluyen 2 experimentos independientes con QRT-PCR por duplicado. cambios en las líneas de células en el porcentaje de supervivencia (
P
= 1.98 × 10
-7) y la caspasa 3/7 actividad (
P
= 0,004) para todos los LCL y A549 (
P = 5,08
× 10
-5) a 5 M cisplatino debido a la
EPS8
caída se muestran con el error estándar de la media usando 6 repeticiones de 2 experimentos independientes (B).
fenotípica cambia con
EPS8
siRNA
Después de confirmar desmontables de
EPS8
, se evaluaron los cambios en la sensibilidad al cisplatino como se mide por el porcentaje de supervivencia y la caspasa 3/7 de activación. La correlación entre el
EPS8
expresión y la citotoxicidad inducida por cisplatino indica los niveles más bajos de
EPS8
expresión correlacionó significativamente con un mayor porcentaje de supervivencia a los 5 M cisplatino (
P = 0,047
); Sin embargo la apoptosis inducida por cisplatino no alcanzó significación (
P = 0,499
) (Fig. S1). El uso de un modelo de efectos mixtos que combina todas las líneas celulares,
interferencias eps8
ARN mostraron un aumento de la supervivencia de LCL tratados con cisplatino en un promedio de 7,9% (
P
= 1.98 × 10
- 7) y disminución de la apoptosis en un promedio de 8,7% (
P
= 0,004) (Fig. 1B). Estos resultados revelan que los niveles más bajos de
EPS8
en LCLs disminuir la sensibilidad celular a cisplatino como se evidencia por el aumento de la supervivencia celular y la reducción de la actividad apoptótica cuando son tratados con cisplatino. Por lo tanto, la disminución de
EPS8 Hoteles en LCL confiere resistencia a la toxicidad del cisplatino. Por el contrario,
EPS8
regulación a la baja en el A549 causó una mayor sensibilidad al cisplatino con una disminución de 20,6% en la supervivencia por ciento (
P
= 5,08 × 10
-5) (Fig. 1B).
mithramycin reduce la expresión de
EPS8 Hoteles en líneas de cáncer y LCL
Los niveles de
EPS8
expresión se midieron 6 y 20 horas después del tratamiento con mitramicina (0,01 M). Los niveles de
EPS8
disminución de expresión a través de los 4 probados LCLs, con un promedio de 74,4% (± 3,4) a las 6 horas y 29,8% (± 3,7) a 20 hrs en relación con el control después de la exposición mitramicina (Fig. 2A ). Mithramycin también disminuyó
EPS8
niveles de expresión en 5 NSCLC líneas celulares y células de cáncer de vejiga línea a un promedio de 95,7% (± 3,4) a las 6 horas y 59,9% (± 14,7) a 20 horas de exposición, en comparación con control sin tratamiento de drogas (Fig. 2B). Estas mediciones confirman que el tratamiento de la mitramicina (0,01 M) da como resultado una menor expresión de
EPS8 Hoteles en células de pulmón y de vejiga cancerosas, así como en LCL no cancerosos.
Los valores porcentuales indicados incluyen dos experimentos independientes con QRT-PCR por duplicado para cada experimento con el error estándar de la media.
mithramycin disminuye la sensibilidad de LCL al cisplatino
a continuación, se determinó el efecto de mitramicina sobre la sensibilidad de LCL a la activación de la caspasa 3/7 inducida por cisplatino. Los niveles medios de la apoptosis a través de la 4 LCLs siguiente cisplatino solo fue 5,94 (± 0,9) con respecto al control, en comparación con cisplatino más mitramicina que disminuyó la caspasa 3/7 promedio niveles de 3,38 (± 0,5) (Fig. 3). Caspasa 3/7 actividad después de mitramicina solo (0,01 M) dio lugar a un promedio de 3,41 (± 0,4) a través de los 4 LCLs. A pesar de que mitramicina y cisplatino inducen apoptosis por separado, hubo una disminución media del 42,7% (± 6,8
P
= 0,0002) en la caspasa 3/7 activación mediante la combinación de mitramicina con cisplatino en comparación con el cisplatino solo, lo que sugiere un efecto protector de mitramicina en términos de la apoptosis. También se ensayaron las células de cáncer de vejiga de pulmón y para la apoptosis con cisplatino (5 M) en presencia y ausencia de mitramicina; Sin embargo caspasa 3/7 niveles de activación de estas células no estaban por encima de la línea de base.
Cada LCL experimentó una menor actividad de apoptosis inducida por cisplatino en relación con la mitramicina añadido a un control sin tratamiento farmacológico. Mitramicina tratada 10859, 11830, 11840, 12156 y resultó en un 47.1, 40.8, 48.9, y 34.0% de disminución de cisplatino solo, respectivamente. Los datos representan dos experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado con el error estándar de la media.
Mithramycin aumenta la sensibilidad de las células tumorales a cisplatino
Además de probar los niveles de apoptosis con cisplatino y mitramicina en LCL y células cancerosas, también se midió la inhibición del crecimiento celular. Cinco líneas celulares de cáncer con diversos estados de mutación fueron elegidos para el estudio; el efecto de mitramicina solo varía para estas líneas celulares de cáncer que van desde 59,7 a inhibición del crecimiento celular del 92,9% (Tabla 1). se encontró sensibilidad al cisplatino a aumentar con el tratamiento mitramicina en 4 células de NSCLC molecularmente distintos (Fig. 4). H1975 con una mutación de EGFR, no experimentó ningún cambio significativo. Desde cisplatino también se usa para el tratamiento de cáncer de vejiga, también elegimos para medir cisplatino y efectos mitramicina en una línea de tumor de vejiga para ver si el efecto sería emular resultados de NSCLC; se observó la supervivencia 59,6% con el tratamiento mitramicina solo (Fig. 4).
forma cuadrado representa las concentraciones de cisplatino solo, mientras que el triángulo representa cisplatino con la adición de mitramicina (0,01 M). Las curvas representan dos experimentos independientes realizaron por triplicado con el error estándar de la media.
Sin embargo, al examinar el efecto de mitramicina sobre la sensibilidad de LCL a cisplatino, no se observó el mismo grado de inhibición del crecimiento celular mejorada. Mitramicina sola por 4 LCL causó una inhibición media de crecimiento de las células del 63,1% (± 12,8) en 0.01 M (Fig. S2). La curva dosis-respuesta para LCL se desplazó a la baja, en promedio, alrededor del 17% cuando se añadió mitramicina. Para las líneas tumorales de la curva de respuesta a la dosis desplazada hacia abajo más o menos 26% de media. El p-valor del término de interacción era
P Hotel & lt; 0,0001. Esto, junto con los resultados de la apoptosis, apoya la idea de que la reducción de la expresión de
EPS8
través mitramicina no es igualmente perjudicial para la supervivencia de LCL como lo es para las líneas de células cancerosas. Mitramicina provoca una mayor sensibilidad en las células NSCLC sin mutación EGFR y posiblemente otros tipos de tejido de cáncer, como se ve por nuestros resultados en la línea de células tumorales de vejiga, HTB9.
Discusión
En este estudio, se evaluó
eps8
como un objetivo potencial para la terapia de combinación con cisplatino.
EPS8
fue elegido sobre la base de los resultados anteriores GWAS preclínicos que utilizan múltiples fenotipos celulares: la citotoxicidad inducida por cisplatino y la apoptosis inducida por cisplatino como se mide por la caspasa 3/7 activación. El SNP (intrónica a
EPS8
), rs4343077, se asoció con la citotoxicidad y la apoptosis inducida por cisplatino, así como la expresión de línea de base de 28 genes diana. Tras la caída de
EPS8
expresión en 5 LCLs, se observó una disminución significativa en la sensibilidad celular a cisplatino, medida por la inhibición del crecimiento celular y la caspasa 3/7 de activación (
P
= 1,98 × 10
-7 y
P = 0,004
, respectivamente) a través de LCL. evidencia de la literatura sugiere
EPS8
caída en las líneas de células tumorales aumenta la sensibilidad celular a cisplatino [13], [15]. Nuestros resultados están de acuerdo con estos hallazgos, demostrando que
EPS8
regulación a la baja sensibiliza a las células de cáncer de pulmón A549 al tratamiento con cisplatino. Hemos ampliado nuestros estudios a otras líneas definidas molecularmente de pulmón de células y una línea de células de la vejiga, así como LCL.
EPS8
caída en LCLs después del tratamiento mitramicina resultó en una disminución de la actividad apoptótica cuando mitramicina se combinó con cisplatino en comparación con el cisplatino solo. Aunque las mediciones de citotoxicidad celular indican un pequeño aumento en la sensibilidad de LCLs a cisplatino después de la exposición mitramicina, la sensibilidad de líneas de células cancerosas fue significativamente mayor con la adición mitramicina comparación con LCLs. La excepción fue la línea celular H1975 CPNM con una mutación de EGFR. Esto implica desmontables de
EPS8
ya sea a través de siRNA o el uso de un inhibidor tal como mitramicina puede ser una estrategia para aumentar la sensibilidad del tumor a cisplatino.
EPS8 es una oncoproteína contribuir a la transformación maligna de las células tumorales [12], [19]. Es un sustrato del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y participa en la señalización a través de EGFR Rac, y el tráfico a través de Rab5 [20]. Su relación tri-complejo con
SOS1
y
Abi1
se ha encontrado que es un componente esencial para la migración lisofosfatıdico ácido estimulada celular y la activación de Rac, que se ha encontrado a desempeñar un papel importante en ovárica cáncer de metástasis [21]. Los niveles de
EPS8
también se han implementado como una herramienta de pronóstico para los pacientes durante las primeras etapas de cáncer de cuello uterino [13]. Los pacientes que tienen una mayor expresión de
EPS8
tienden a experimentar la invasión del parametrio, metástasis de ganglios linfáticos y una disminución en la tasa de supervivencia.
Inicialmente, Yang et al. (2010), investigó mitramicina, un antibiótico de los
Streptomyces
especie, como un inhibidor potencial de
EPS8
. Determinaron que mitramicina reduce los niveles de ARNm y proteínas de
EPS8
en una línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano epitelial y una línea de células epiteliales de carcinoma de pulmón humano. Además,
EPS8
regulación a la baja, a través de tratamiento mitramicina, causa una disminución significativa en el crecimiento de células cancerosas y capacidad de migración [22].
Mithramycin ha sido un medicamento contra el cáncer clínico aprobado desde 1970 [23] y usados en los Estados Unidos para el tratamiento clínico de la enfermedad de Paget, carcinoma testicular, y la hipercalcemia en pacientes que experimentan lesiones óseas malignidad asociada a [24] - [28]. Sin embargo, su uso en el tratamiento de terapia ha disminuido a lo largo de los años debido a sus efectos adversos y el índice terapéutico estrecho [29]. Los pacientes tratados con mitramicina, para estas enfermedades, se han visto experimentar gastrointestinal, hepática, toxicidad renal y de médula ósea, dando lugar a náuseas, vómitos y sangrado [30]. A pesar de sus graves efectos secundarios, ha habido un interés renovado en mitramicina ahora que la comprensión de sus interacciones a nivel molecular está evolucionando [29].
Mithramycin se ha encontrado para interactuar con regiones de ADN ricas en GC situados en el surco menor del ADN [29], [31] - [33], que se cree actualmente para prevenir factor de transcripción proteína especificidad 1 (SP1) de la unión a una variedad de promotores de los proto-oncogenes. Sin embargo, Sp1 sitios de unión que no están relacionados a un subconjunto de los proto-oncogenes parecen verán afectados, tales como el promotor p21
CIP1 /WAF1 [29]. Por lo tanto, mitramicina no puede ser específico a la inhibición Sp1 y potencialmente podría tener como objetivo un oncogén aguas arriba de la interacción Sp1. Anteriormente se ha descubierto que mitramicina también disminuye la expresión de
c-myc
,
c-myb
,
c-src
,
c-met
y FOXM1 [22], [34]; Sin embargo, mitramicina aumenta los niveles de FOXO3A [34], un factor de transcripción que regula la respuesta al daño del ADN. Puede haber una posibilidad de que estos genes están relacionados entre sí en una ruta aguas abajo del objetivo de mitramicina
.
Por ejemplo,
EPS8
también se ha demostrado que regulan al alza FOXM1 [35], un factor importante en la desarrollo y la progresión de ciertos tipos de cáncer [36], que se sabe que se unen directamente con Sp1 [37], [38]. Sp1 y FOXM1 se ha demostrado que transactivar promotores de
c-myc de
sinérgicamente [38]. Por otra parte,
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atenuación se ha encontrado para disminuir los niveles de
Src
,
Shc
y
FAK gratis (también conocido como
PTK2
), una tirosina quinasa intracelular que participan en la adhesión celular y la motilidad [39]. FOXO3A también puede estar regulada por la presencia o ausencia de
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a través de diversas vías, ya sea a través de PI3K /AKT /mTOR señalización [40] o a través de la vía de Ras-Raf-MEK-ERK [41]. Shiota et al. (2010) investigaron la resistencia a cisplatino y determinó que el cisplatino células resistentes se convirtieron sensibilizados a tratamiento a través de la inducción de FOXO3A por mitramicina [34]. Una disminución en la señalización de AKT activa FOXO3A e induce la apoptosis [36]; Por lo tanto, es posible que una reducción en los niveles de
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disminuye AKT, lo que provocó la fosforilación de FOXO3A y las células cancerosas a experimentar apoptosis en lugar de continua proliferación.
Echando un vistazo colectiva en la literatura y nuestra da como resultado que parece interesante que la línea celular de cáncer de pulmón, que no experimentaron la muerte celular aumentó con mitramicina (H1975) tiene una mutación de EGFR. línea celular de tumor de pulmón H1975 tiene una mutación puntual en el bucle de activación que causa un cambio de leucina a arginina (L858R) en el exón 21, así como un punto de mutación secundaria, T790M, alterar la actividad de EGFR normal [42]. Los inhibidores de EGFR de tirosina se utilizan normalmente para sensibilizar a los tipos de tumores mutados EGFR a los agentes de platino, sin embargo los tumores de tipo salvaje EGFR raramente respuesta a estos inhibidores [43]. Potencialmente, la adición de un régimen mitramicina puede ser beneficioso para pacientes con EGFR de tipo salvaje se tornen sensibles al tratamiento con platino a través de la inhibición de
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y aguas abajo objetivos que desempeñan un papel importante en la proliferación de células tumorales, la adhesión y la motilidad . Una dosis mitramicina lo suficientemente grande como para inhibir ciertos oncogenes, pero lo suficientemente baja como para no causar efectos adversos adicionales, permitiría que el agente quimioterapéutico para causar más eficazmente la muerte celular de las células tumorales.
En conclusión, nuestros resultados validan
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participación en la respuesta de las células al tratamiento con cisplatino. Aunque hemos probado mitramicina, puede haber inhibidores más específicos de
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que se traducen en un mayor diferencial entre las células cancerosas y las células normales. La capacidad de mitramicina para disminuir los niveles de
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causaron menos actividad apoptótica en LCL que con el tratamiento con cisplatino solo. expresión de
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mediante el tratamiento con mitramicina es menos dañino para las células normales (como se mide en LCL) en comparación con las células cancerosas reducida. En conjunto, nuestros datos proporcionan una confirmación adicional de la función e importancia de los
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de la toxicidad inducida por cisplatino y como un objetivo prometedor para mejorar la terapia con cisplatino.
Apoyo a la Información
Figura S1. Correlación entre
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niveles de expresión y de registro transformado por ciento de supervivencia CEU LCL (
P = 0,047
, r
2 = 0,05, superior) y la caspasa 3/7 actividad (
P = 0,499
, r
2 = 0,006, inferior)
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figura S2.
LCL se muestran a varias concentraciones de cisplatino con la presencia y ausencia de mitramicina. Forma cuadrada representa las concentraciones de cisplatino solo, mientras que el triángulo representa cisplatino con la adición de mitramicina (0,01 M). Las curvas representan dos experimentos independientes realizados por triplicado con el error estándar de la media
doi:. 10.1371 /journal.pone.0082220.s002 gratis (TIFF): perfil
Reconocimientos
Los autores Agradecemos a la farmacogenómica de agentes anticancerosos línea celular núcleo de la Universidad de Chicago para la ayuda en ordenar y recibir estas líneas celulares.