Extracto
El metabolito activo de la vitamina D
3, 1,25 -dihydroxyvitamin D
3 (calcitriol) tiene efectos antiproliferativos en el cáncer de próstata no agresivo, sin embargo, sus efectos en los sistemas modelo más agresivo aún no están claros. En estos estudios, los efectos de calcitriol y un menos calcémica análogo de la vitamina D, QW-1624F
2-2 (QW), se pusieron a prueba
in vivo
, utilizando el agresivo adenocarcinoma transgénico autóctona de próstata de ratón ( TRAMP) modelo. Para el estudio de prevención del cáncer estimulado por andrógenos de la próstata, vehículo, calcitriol (20 mg /kg), o QW (50 mg /kg) se administraron a los ratones 4 semanas de edad, TRAMP intraperitoneal (ip) 3 × /semana en un horario MWF para 14 semanas. Calcitriol y QW progresión ralentizada de cáncer de próstata como se indica por la disminución del tracto urogenital (p = 0,0022, el calcitriol; p = 0,0009, QW) y peso de la próstata (p = 0,0178, el calcitriol; p = 0,0086, QW). la proliferación tumoral Sin embargo, sólo el aumento de calcitriol expresión del marcador pro-diferenciación, cadherina 1 (p = 0,0086), y la reducción (p = 0,0467). Por el contrario, ni análogo de vitamina D tuvo ningún efecto sobre el cáncer de próstata resistente a la castración en los ratones tratados antes o después de la castración. Curiosamente, aunque la vitamina D mostró que la actividad inhibidora frente a tumores primarios en ratones de la hormona intacta, las metástasis de órganos distantes parecían ser mejorada después del tratamiento (p = 0,0823). Por lo tanto, los ratones TRAMP fueron tratados a largo plazo con calcitriol para examinar más a fondo los efectos sobre la metástasis. El calcitriol aumenta significativamente el número de metástasis a distancia cuando los ratones fueron tratados a partir de las 4 semanas de la edad hasta el desarrollo de tumores palpables (20-25 semanas de edad) (p = 0,0003). En general, los datos sugieren que la intervención temprana con vitamina D en TRAMP ralentizó la progresión tumoral estimulado por andrógenos, pero el tratamiento prolongado resultó en el desarrollo de una enfermedad resistente y más agresivo asociado con un aumento de la metástasis órgano distante
Visto:. Ajibade AA, Kirk JS, Karasik E, Gillard B, Moser MT, Johnson CS, et al. (2014) A principios de inhibición del crecimiento es seguido por enfermedad metastásica en el aumento de la vitamina D (calcitriol) Tratamiento en el modelo TRAMP de cáncer de próstata. PLoS ONE 9 (2): e89555. doi: 10.1371 /journal.pone.0089555
Editor: Karl X. Chai, University of Central Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Septiembre, 2013; Aceptado: January 21, 2014; Publicado: 26 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Ajibade et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de Roswell Park Cancer Institute y el Instituto Nacional del cáncer (NCI) CA016056 subvención#P30, por el NIH /NCI subvención#5R01 CA95367 (a BAF), y por el Departamento de defensa (DOD) Pre-doctoral de becas de subvención#W81XWH-05 -1-0571 (AAA). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es una de las principales causas de cáncer y la mortalidad relacionada con el cáncer en los hombres estadounidenses [1]. etapa inicial, confinado al órgano, el CP puede ser administrado por la cirugía, la radioterapia o conducta expectante, mientras que los hombres con CaP localmente avanzado o metastásico son tratados principalmente por la terapia de deprivación androgénica [2]. Sin embargo, muchos pacientes eventualmente desarrollan resistencia CaP castración, para los que las opciones de tratamiento actuales sólo son paliativos. La prevalencia, larga latencia, la morbilidad y la mortalidad asociada con CaP han generado un interés significativo en el desarrollo de agentes para la quimioprevención de la enfermedad [3].
asociaciones epidemiológicas entre la vitamina D y el CP sugieren que la vitamina D puede ser un importante regulador del crecimiento y la diferenciación CaP [4]. Sin embargo, los estudios que relacionan los niveles séricos de la vitamina D y la incidencia y la mortalidad CaP no están fuertemente correlacionados (revisado en [5]). En contraste, los estudios preclínicos demuestran que la vitamina D tiene potentes efectos contra el cáncer en células de CaP
in vitro
, incluyendo la inhibición de la proliferación celular [6] y la invasividad [7], la inducción de la detención del ciclo celular [8], la estimulación de apoptosis [9], y la promoción de la diferenciación [10]. Por otra parte, numerosos
in vivo
estudios que utilizan sistemas de xenoinjertos de ratones demuestran que los compuestos de vitamina D suprimen el crecimiento tumoral y la metástasis [6], [11], [12]. Además, el uso de modelos de ratones genéticamente modificados que se desarrollan de forma espontánea cáncer, demuestran que la vitamina D puede prevenir la progresión de las lesiones pre-cancerosas CaP [13] y suprimir el crecimiento tumoral en la castración PCa resistente [14].
ensayos clínicos realizados en pacientes con CaP han sido en su mayoría decepcionantes [15], [16], [17], [18], aunque ha habido algunos resultados positivos [19], [20], y se ha avanzado en la comprensión de la vitamina D farmacocinética y farmacodinámica. Una razón para la pobre rendimiento clínico de la vitamina D es su principal hipercalcemia toxicidad, limitante de la dosis. A pesar de la hipercalcemia se maneja fácilmente, puede ser la prevención de la utilización óptima de calcitriol. Por lo tanto, menos calcémicos análogos de vitamina D se han desarrollado con la intención de retener los efectos anticancerígenos potentes de calcitriol. QW-1624F
2-2 (QW) es un análogo híbrido fluorado de calcitriol que es 100 veces menos calcémica, altamente antiproliferativa, y provoca efectos aguas abajo similares a calcitriol [21], [22]. Además, la administración de altas dosis de QW (3 g) inhiben 7,12-dimetilbenz [a] antraceno-TPA-inició y promovió la carcinogénesis de piel en ratones sin efectos secundarios hipercalcémicos [23].
El adenocarcinoma transgénico de próstata de ratón (TRAMP) modelo es un modelo agresivo, autóctona de CaP [24]. A las 10 semanas de la edad, los ratones TRAMP desarrollan bajo grado, el cáncer de próstata no invasivo [25]. Dado que los ratones continuar con la edad, el tumor progresa de no invasivo para alto grado, adenocarcinoma invasivo, y posteriormente los tumores neuroendocrinos pobremente diferenciados por 20-25 semanas de la edad. La naturaleza progresiva del modelo presenta una oportunidad para examinar los efectos de los agentes quimiopreventivos en las etapas tempranas y tardías de desarrollo del CaP, en lugar de sólo uno o el otro. Hasta el momento, la cabeza en la comparación de los efectos quimiopreventivos de diferentes compuestos de vitamina D en la progresión de CaP estimulado por andrógenos y resistente a la castración aún no se han llevado a cabo. Dado que la mortalidad por cáncer de próstata se produce en los hombres con cáncer avanzado de la última etapa, hemos tratado de examinar la eficacia anticancerígena de los compuestos de vitamina D utilizando el modelo TRAMP más agresivo. En estos estudios, se utilizó el modelo TRAMP para investigar si calcitriol o QW pueden prevenir o lento estimulado por andrógenos y resistente a la castración CaP iniciación, progresión y metástasis.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
usos experimentales de animales de laboratorio se llevaron a cabo en estricta conformidad con los Institutos nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y uso de animales de laboratorio y el protocolo fue aprobado por el Instituto del cáncer Roswell Park (RPCI) Cuidado de animales y el empleo (Aseguramiento#A3143-01). RPCI es un centro de investigación con animales AALAC Internacional acreditado. Toda la cirugía se realizó con isoflurano para la anestesia por inhalación y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales.
Animales
colonias de cría se mantuvieron en el Departamento de Laboratorio de Recursos Animales y facilidad de la base (DLAR) a Roswell Park Cancer Institute (Buffalo, Nueva York). TRAMP ratones machos homocigotos fueron criados con el tipo salvaje FVB ratones hembra (Taconic, Germantown, NY) para obtener C57BL /6 × FVB 50:50 TRAMP ratones machos. Los ratones fueron genotipo para confirmar la transmisión de la línea germinal del transgén [24]. Todas las ratas fueron heterocigotos para el transgén, y se mantienen en la dieta Harlan Teklan S2335 que contiene 2.980 UI /kg de vitamina D3.
estudios de quimioprevención vitamina D
1α-hidroximetil-16-eno -24,24-difluoro-25-hidroxi-26,27-bis-homovitamin D
3 (QW-1624F
2-2, QW) se obtuvo del Dr. Gary Posner (Universidad Johns Hopkins, Baltimore, MARYLAND). stocks calcitriol y QW se disolvieron en etanol al 100%, y estaban recién resuspendieron en solución salina antes de cada inyección. Los animales se pesaron, controlado para la toxicidad, y palparon para evaluar la carga tumoral en una base semanal. Generalmente, los estudios se terminaron 72 h después de administrar el tratamiento última droga. En el momento de la eutanasia, se midieron los pesos corporales finales y el tracto urogenital (UG) (vejiga, vesícula seminal y próstata) se escindió y se pesaron. El dorsal, lóbulos de la próstata ventral y lateral se microdissected del tracto GU y pesarán para obtener los pesos de la próstata. incidencia metastásico se determinó basado en el examen macroscópico de la pelvis ganglios linfáticos, el hígado, riñones y pulmones, y por tinción inmunohistoquímica de tejido con un anticuerpo específico del antígeno T de SV40. Los siguientes tejidos se recogieron en casetes 9-cámara para la histología: dorsal, próstatas laterales, ventral y anterior, vesícula seminal, los ganglios linfáticos peri-aórticos, el riñón, el intestino y el hígado. Colección de tejidos para histología fue priorizada, por lo tanto, solamente los tejidos sobrantes de los tumores de próstata grandes se snap-congelado en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C para el análisis de Western blot.
Para estudiar el efecto del calcitriol o QW en la progresión de CaP estimulado por andrógenos, tres cohortes de ratones TRAMP 4 semanas de edad, se trataron con vehículo (n = 40), calcitriol (n = 41) o QW (n = 42) ip 3 x /semana los lunes, miércoles y viernes (MWF) durante 14 semanas (Figura 1A). El estudio se dio por terminado cuando los ratones tenían 18 semanas de edad y los tejidos se recogieron como se describe anteriormente. Algunas muestras fueron incapaces de ser analizado, o no se evalúa sobre la base de criterios de exclusión establecidos. Un segundo estudio se realizó para investigar el efecto de
a largo plazo
administración de calcitriol sobre la progresión del CaP estimulado por andrógenos. Dos cohortes de ratones TRAMP 4 semanas de edad fueron tratados
a largo plazo con vehículo (n = 47) o calcitriol (n = 49) por vía intraperitoneal 3 x /semana MWF, hasta que desarrollaron tumores palpables (Figura 1A). Se recogieron tumores cuando detectable por palpación abdominal.
(A) Representación esquemática de la evolución en el tiempo de los estudios de quimioprevención. Todos los ratones fueron castrados a las 12 semanas en los estudios refractarios de la hormona. (B-C) Cuatro ratones TRAMP semanas de edad fueron tratados con vehículo (control), calcitriol (20 mg /kg) o QW (50 mg /kg) por vía intraperitoneal 3 x /semana durante 14 semanas. (B) los pesos corporales finales (g) de control (n = 40), calcitriol (n = 41) y QW (n = 42) ratones miden 72 h después del último tratamiento. los niveles de (C) en suero de calcio (mg /dl) para el control (n = 39), calcitriol (n = 40) y QW (n = 42) ratones midió 72 h después del último tratamiento. Todos los datos se representan como diagramas de caja con medianas, y bigotes representan el 5
º y 95
º percentiles. • (puntos), representan los puntos fuera de la 5
º y 95
percentil. Todos los valores de p se generaron utilizando la prueba de Mann-Whitney.
Dos estudios fueron diseñados para evaluar el efecto del calcitriol o QW en la prevención del CaP resistente a la castración en ratones TRAMP castrados quirúrgicamente. En el
después de la castración
estudiar, se inició inmediatamente después de la castración tratamiento de los ratones TRAMP a las 12 semanas de la edad. Tres cohortes de 12 semanas de edad, los ratones castrados fueron tratados con vehículo (n = 33), calcitriol (n = 31) o QW (n = 30) i.p. 3 x /semana MWF durante 12 semanas (Figura 1A). Los ratones fueron sacrificados a las 24 semanas de la edad y las muestras de tejidos se adquirieron como se describe anteriormente. El
antes de la castración
estudio, 4 ratones TRAMP semanas de edad fueron tratados con vehículo (n = 29) o calcitriol (n = 34) por vía intraperitoneal 3 x /semana durante 8 semanas MWF. A las 12 semanas de la edad, todos los ratones fueron castrados y el tratamiento se continuó durante 12 semanas adicionales (Figura 1A). Los ratones fueron sacrificados a las 24 semanas de la edad y de las muestras de tejido se adquirieron como se describe anteriormente.
El análisis histopatológico
Los tejidos fueron cosechadas, fijo, procesados, secciones incluidas en parafina y tejidos (5 micras ) se cortaron para el análisis histológico. Hematoxilina y eosina (H & amp; E) tinción de secciones de tejido, se efectuó y grados tumorales fueron asignados por la evaluación cegada por A.A.A. y B.A.F. utilizando un sistema de clasificación histopatológica estándar desarrollado para el modelo TRAMP [25]. En este sistema de clasificación, la próstata normal (grado 1) se desarrolla progresivamente lesiones prostáticas incluyendo neoplasia de bajo grado intraepitelial prostática (PIN) (grado 2), carcinoma de
In situ gratis (grado 3), cáncer invasivo (grados 4 y 5) y el cáncer en etapa tardía pobremente diferenciado (grado 6) [25]. Los términos utilizados para describir las lesiones prostáticas en los estudios actuales se adaptaron a partir del sistema de clasificación antes mencionada, donde
de bajo grado gratis (LG) son equivalentes a las lesiones tumorales grados 1 y 2,
grado intermedio
lesiones (IG) representan el grado 3 y
cáncer
es equivalente a los grados 4, 5 y 6. El dorsal, lóbulos de la próstata ventral y lateral se clasificaron de forma individual y se asigna una calificación general y lo peor grado. La nota global se determina mediante la evaluación del grado del tumor predominante presente en cada lóbulo de la próstata. incidencia metastásico se confirmó mediante el examen de los ganglios linfáticos, el hígado, los riñones y los pulmones bajo un microscopio de luz después de la tinción inmunohistoquímica para el antígeno T grande de SV40. fotomicrografías representativas fueron tomadas con una cámara digital de color KP-D50 (Hitachi, Brisbane, CA).
La inmunohistoquímica
Muestras de tejido fueron des-con parafina usando xileno y rehidratada con alcoholes graduados. La recuperación del antígeno se realizó por ebullición con 1 × tampón de citrato, pH 6,0 (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) durante 20 min. peroxidasa endógena fue bloqueada por deslizamientos de sumergirlo en un 3% H
2O
2 en metanol durante 15 min. Las láminas fueron incubadas con los siguientes anticuerpos primarios: el antígeno T grande de SV40 (Tag) (1:400, BD Pharmingen, San Diego, CA), MKI67 (1:1000, Novocastra Laboratories, Newcastle upon Tyne, Reino Unido), 1 cadherina (CDH1 ) (1:500, BD Pharmingen), receptor de andrógenos (AR) (1:200, Upstate, Lake Placid, NY) y sinaptofisina (SYP) (1:400, Zymed). El anticuerpo secundario solamente se utilizó como control negativo para todos los anticuerpos. Los portaobjetos se lavaron con 1 x tampón de fosfato de Tris, pH 7,8 (8,4 mM Na
2HPO
4, KH 3,5 mM
2 PO
4, Tris 10 mM, NaCl 120 mM) seguido por incubación con el siguiente: anticuerpos secundarios de conejo conjugado con HRP anti-ratón (DakoCytomation, Carpinteria, CA), conjugado con HRP porcina anti-conejo (DakoCytomation) y biotina de cabra anti-conejo (vector Laboratories, Burlingame, CA). La inmunorreactividad se detectó usando el reactivo Vectastain ABC (Vector Laboratories) y 3,3 '-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB, Sigma, St. Louis, MO). Los tejidos fueron de contraste con hematoxilina, se deshidrataron con alcoholes graduados, despachada con xileno y se montaron utilizando cubreobjetos de vidrio.
La puntuación CDH1 del lóbulo ventral se calculó contando el número de glándulas CDH1 positivas por 15 glándulas en un 10 × campo. El índice de proliferación del lóbulo ventral se determinó contando el número de células positivas MKI67 en tres campos (40 aumentos) que eran representativas de las áreas con el grado del tumor peor, dividido por el número total de núcleos en cada campo.
Western blot análisis
La inmunotransferencia se realizó como se describió anteriormente [22]. En pocas palabras, los tejidos se congelaron se homogeneizaron con Triton X-tampón de lisis /SDS que contiene 1 × inhibidor de la proteasa Cocktail (BD PharMingen) y los inhibidores de la fosfatasa. Las muestras fueron resueltas por SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF durante la noche a 4 ° C por electroforesis. Las membranas se bloquearon a temperatura ambiente durante al menos 1 h utilizando 5% de leche en TBST 1 x (w /v). Después de la incubación durante la noche con anticuerpos primarios para el antígeno T grande de SV40 (1:250, BD Pharmingen) y actina (CP01, Calbiochem, San Diego, CA), las membranas se lavaron con TBST, se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante un mínimo de 1 h y expresión de la proteína se detectó por quimioluminiscencia.
análisis Serum
la sangre se obtuvo por punción cardiaca terminal en el momento de la necropsia y el suero se recogió de las muestras de sangre mediante centrifugación. Los niveles de calcio se midieron en los Laboratorios Clínicos del Instituto del Cáncer Roswell Park.
El análisis estadístico
Todos los gráficos y el análisis estadístico se generaron utilizando GraphPad Prism versión 5.0D para Mac OS X, GraphPad Software, San Diego California, EE.UU., www.graphpad.com. Se realizó la prueba no paramétrica de Mann-Whitney para comparar entre los resultados cuantitativos, mientras que el análisis categórico se llevó a cabo mediante el desarrollo de tablas de contingencia y el uso de la prueba exacta de Fisher chi-cuadrado o. Los resultados cuantitativos se representan como diagramas de cajas que representan el 5
ª, 25
ª, 50
ª, 75
º y 95
º percentiles de los conjuntos de datos en cada grupo de tratamiento, y categórica Los resultados se representan como porcentajes de cada grupo de tratamiento.
resultados
compuestos de vitamina D no son tóxicos y no interfieren con la expresión del antígeno T grande de SV40
Los efectos de la vitamina compuestos D en la progresión del CaP estimulado por andrógenos se evaluaron en ratones a la madurez sexual, que comienza aproximadamente a las 4 semanas de la edad en TRAMP. Tres cohortes de ratones TRAMP 4 semanas de edad, fueron tratados con calcitriol (20 mg /kg), QW (50 mg /kg) o vehículo durante 14 semanas en un horario MWF (Figura 1A). Los ratones tratados con los compuestos de vitamina D no experimentaron ninguna pérdida de peso después de la terapia (Figura 1B). los pesos corporales finales fueron 31,5 ± 2,1 g para el vehículo, 31,5 ± 2,5 g para el calcitriol, y 30,7 ± 2,7 g para los ratones tratados QW. Además, los niveles de calcio se mantuvieron sin cambios después de 14 semanas de tratamiento con vehículo (8,6 ± 1,0 mg /dl), calcitriol (8,5 ± 1,4 mg /dl, p = 0,3334), o QW (8,5 ± 0,9 mg /dl, p = 0,9096) , lo que sugiere la hipercalcemia sostenida no es un problema (Figura 1C). Los niveles de calcio se elevan durante unos ratones portadores de tumores (control del vehículo, n = 2/39; calcitriol, n = 1/40, y QW, n = 1/42), pero esto está probablemente relacionado con el fenotipo tumoral e independiente del tratamiento. Dado que la expresión específico de la próstata de los genes tempranos de SV40 (T y antígenos T; TAG) es necesaria para la progresión del tumor en TRAMP [24], era importante determinar si los agentes terapéuticos alteran la expresión del transgen. Al igual que en el grupo control (Figuras 2A, D, G), la etiqueta se expresó en las dorsales (Figuras 2B-C), lateral (Figuras 2E-F) y ventral (Figuras 2H-I) lóbulos de la próstata después del tratamiento con calcitriol o QW respectivamente. El análisis de transferencia Western confirmó además que los compuestos de vitamina D no interfirieron con la expresión de Tag (figura 2L).
ratones TRAMP fueron tratados con vehículo (control), calcitriol (20 mg /kg) o QW (50 g /kg ) ip 3 x /semana durante 14 semanas. El análisis inmunohistoquímico de la expresión de Tag en el dorsal (A-C), lateral (D-F), y los lóbulos ventrales (G-I) de los ratones 18 semanas de edad. (J) SV40 Tag tinción del lóbulo ventral de los ratones no transgénicos de la misma edad. (K) no manchar anticuerpo control negativo. Las microfotografías se tomaron a 20 × magnificación. (L) Análisis de transferencia Western de la expresión de etiquetas en muestras de tumores de próstata pobremente diferenciado de control, calcitriol y QW-ratones tratados. Actina se utilizó como control de carga. WT, de tipo salvaje y de los tejidos de la próstata no transgénicos de la misma edad. El número de la muestra utilizada para inmunotransferencia varía (control = 5, el calcitriol = 2, QW = 5), ya que se dio prioridad a la recogida de tejidos para histología. Solamente los tejidos sobrantes de los tumores de próstata grandes estaban disponibles para inmunotransferencia.
Efecto de los compuestos de vitamina D en la incidencia y progresión del tumor
La capacidad de calcitriol o QW para inhibir o retrasar la formación de tumores en TRAMP se analizó después del tratamiento de andrógenos estimulada por la castración y resistente CaP (Figura 1A). En los ratones de andrógenos estimulada tratados con vehículo, calcitriol, o QW, a partir de las 4 semanas de la edad hasta las 18 semanas de la edad, la incidencia de tumores fue evidente en el 35,0% de los ratones de control del vehículo (n = 14/40), el 26,8% de los ratones tratados con calcitriol (n = 11/41) y el 35,6% de los ratones tratados con QW (n = 15/42) (Figura S1). Aunque hubo una disminución del 8,2% en la incidencia de tumores con el tratamiento con calcitriol, esta disminución no fue significativa (p = 0,6337, prueba de Chi-cuadrado).
Después de la castración a las 12 semanas de la edad, los ratones TRAMP desarrollan la castración tumores resistentes a las 24 semanas de la edad [25], [26]. Para determinar si los compuestos de vitamina D pueden retrasar o prevenir CaP recurrencia, tres cohortes de ratones TRAMP de castración fueron tratados con vehículo, el calcitriol (20 mg /kg), o QW (50 mg /kg) durante 12 semanas
después de la castración
(Figura 1A). Aproximadamente el 64% (21/33) de los ratones de control del vehículo desarrollado tumores resistentes a la castración, comparado con el 68% (21/31) y 57% (17/30) de los ratones en el calcitriol y QW grupos, respectivamente (Figura S1). Sin embargo, estos cambios no fueron significativos (p = 0,6648, prueba de Chi-cuadrado). También se investigó si la intervención con el tratamiento con vitamina D
antes de la castración
podría alterar la recurrencia de la castración. Dos cohortes de ratones TRAMP 4 semanas de edad, se trataron con vehículo o calcitriol (20 mg /kg) a partir de las 4 semanas de la edad. A las 12 semanas los ratones-de-edad fueron castrados y la terapia se continuó hasta que los ratones eran de 24 semanas de edad (Figura 1A). Aproximadamente el 62% (18/29) de los ratones tratados con el vehículo y el 74% (25/34) de los ratones tratados con calcitriol desarrollaron enfermedad resistente castración (Figura S1), pero no se observó ninguna diferencia significativa (p = 0,4184, prueba exacta de Fisher). En general, estos resultados indican que los compuestos de vitamina D no fueron capaces de reducir la recurrencia del CaP resistente a la castración en TRAMP.
Efecto de los compuestos de vitamina D en el grado del tumor y la carga de la enfermedad
A fin de evaluar los efectos de compuestos de vitamina D en la progresión de CaP estimulado por andrógenos en ratones después de 14 semanas de tratamiento, la enfermedad prostática se puntuó mediante evaluación histológica estándar (ver
Materiales y Métodos
). En general los grados tumorales fueron asignados tras el examen cegada de H & amp; diapositivas E-manchada. informes anteriores demuestran que el lóbulo ventral es más sensible a la intervención terapéutica [27], [28], por lo tanto, los grados globales de tumores de la próstata ventral se compararon entre los grupos de tratamiento (Figura 3). lesiones de bajo grado (LG) eran no invasiva y se caracterizaron por un aumento de la estratificación epitelial con la arquitectura glandular intacta (Figura 3A). (IG) lesiones de grado intermedio también eran no invasiva, pero muestran nucleolos prominentes, tufting epitelial, estructuras micropapilares, arquitectura cribiforme y una arquitectura glandular intacta (Figura 3B). Por último, los cánceres en etapa tardía prominente consistían en capas de células anaplásico con pérdida de la arquitectura glandular (Figura 3C). La incidencia de lesiones LG fue 40% en el vehículo tratado, 54% en el calcitriol tratada, y 39% en QW ratones (Figura 3D) tratada. Por el contrario, las lesiones IG y el cáncer en etapa tardía desarrollan con mayor frecuencia en el control (60%) y QW (61%) en comparación con los grupos de ratones tratados con calcitriol (46%) (Figura 3D). Además, la incidencia de las lesiones cancerosas era 25% en el control, 34% en el grupo de QW, y 20% en el grupo de calcitriol (Figura 3D), sin embargo, estos cambios no fueron significativos (p = 0,4699, test de Chi-cuadrado). La intervención también tuvo ningún efecto sobre el grado del tumor en dorsal y los lóbulos laterales de la próstata (datos no mostrados)
H & amp.; E tinción se realizó en secciones de tejido de los ratones TRAMP tratados con vehículo (control), calcitriol (20 mg /kg) o QW (50 mg /kg) i.p. 3 x /semana durante 14 semanas. tejidos de la próstata se clasificaron en base a un sistema de clasificación histopatológica se discutió en la sección
Materiales y Métodos
. fotomicrografías representativas (20 aumentos) de H & amp; E tinción de los lóbulos ventrales que representa (A) de bajo grado (LG) lesión prostática del grupo de calcitriol, (B) de grado intermedio (IG) de la lesión, y (C) el cáncer en etapa tardía en el grupo control. (D) Incidencia (%) de las lesiones LG, lesiones GI, y el cáncer en los lóbulos ventrales de control (n = 40), calcitriol (n = 41) y QW (n = 41) grupos. Se realizó una prueba de chi-cuadrado para determinar si había alguna asociación entre el tratamiento y la enfermedad en estadio.
Carga de la enfermedad en TRAMP puede estar directamente relacionado con la próstata y el tracto urogenital (UG) de peso [25]. El efecto de los compuestos de vitamina D en la carga de enfermedad se examinó inicialmente en todas las muestras, incluyendo LG, IG, y los cánceres en etapa tardía. No se observaron diferencias significativas, probablemente como resultado de la aparición de tumores voluminosos en los cánceres en etapa tardía. Una vez que los tumores voluminosos han desarrollado, los pesos de estos tumores pueden enmascarar cualquier efecto de la vitamina D tiene sobre las lesiones LG e IG. Por lo tanto, todos los análisis posteriores realizados por estimulado por andrógenos CaP se realizaron en las lesiones prostáticas no invasivos LG e IG. Calcitriol (p = 0,0022) y QW (p = 0,0009) disminuyeron significativamente el peso UG en comparación con vehículo en la enfermedad estimulado por andrógenos (Figura 4A). Además, el calcitriol (p = 0,0178) y QW (0,0086) tanto reducido peso de la próstata (Figura 4B). Sin embargo, en los tumores resistentes a la castración TRAMP histológicamente comparables con el cáncer en etapa tardía, compuestos de vitamina D no alteraron estadísticamente carga de la enfermedad durante el tratamiento posterior a la castración (Figura 4C) o pre-castración (Figura 4D). En general, los resultados sugieren que los compuestos de vitamina D fueron eficaces en la ralentización del crecimiento de la etapa temprana de andrógenos estimulada por CaP, pero ineficaz en la enfermedad TRAMP resistente etapa tardía de la castración.
(A-B) Los ratones se trataron con vehículo (control) , calcitriol (20 mg /kg) o QW (50 mg /kg) ip 3 x /semana durante 14 semanas. Sólo las muestras con calificación global no invasiva baja (LG) y lesiones prostáticas grado intermedio (IG) en la parte dorsal, se analizaron los lóbulos laterales y ventral, mientras que todos los tipos de cáncer fueron excluidos del análisis. (A) Urogenital (UG) los pesos (mg) de control (n = 30), calcitriol (n = 32) y QW (n = 28) ratones. pesos (B) de la próstata (mg) de control (n = 29), calcitriol (n = 32) y QW (n = 28) grupos. pesos (C) UG (mg) de ratones castrados TRAMP 24 semanas de edad tratados con vehículo de control (n = 33), calcitriol (n = 30) o QW (n = 30)
después de la castración
. (D) UG peso (mg) de ratones castrados TRAMP 24 semanas de edad tratados con vehículo de control (n = 29) o calcitriol (n = 34)
antes de la castración
. Todos los datos se representan como diagramas de caja con medianas, y bigotes representan el 5
º y 95
º percentiles. • (puntos), representan los puntos fuera de la 5
º y 95
percentil. Todos los valores de p se generaron utilizando la prueba de Mann-Whitney.
El calcitriol promueve la diferenciación e inhibe la proliferación en ratones TRAMP andrógenos estimulada
Sobre la base de las observaciones que el calcitriol UG inhibido y peso de la próstata en el lóbulo ventral (Figura 4), los análisis adicionales se realizaron en las lesiones LG y IG no invasivos. La pérdida de cadherina 1 de expresión (CDH1) se asocia con la progresión del CaP y la disminución de la diferenciación en TRAMP [25], [29]. expresión CDH1 se encuentra predominantemente en la membrana plasmática. Sin embargo, cuando las células cancerosas pierden estado de diferenciación, la regulación de CDH1 puede ser interrumpido resultando en citosólicas y nucleares patrones de expresión [30]. Además, aumentos en la expresión de CDH1 se correlacionan con la inducción de la diferenciación inducida por análogos de vitamina D en las líneas celulares de CaP [31]. Por lo tanto, la expresión de CDH1 se evaluó para determinar el efecto de calcitriol sobre la diferenciación. En contraste con los ratones de control (figuras 5A-B), CDH1 se expresa fuertemente en los lóbulos ventrales de los ratones tratados con calcitriol (figuras 5C-D). Si bien se observó cierta tinción citoplásmica de CDH1 en ambos grupos de tratamiento, la mayoría de la tinción CDH1 permaneció unida a la membrana. cuantificación posterior confirmó que el calcitriol aumenta significativamente el número de glándulas CDH1 positivos en comparación con vehículo (Figura 5G) (p = 0,0086). Además de CDH1, receptor de andrógenos (AR) expresión también fue examinado en las próstatas ventrales del vehículo y los ratones tratados con calcitriol (Figuras 5E y 5F). Aunque no se observó diferencia en la expresión AR, es importante tener en cuenta que la expresión de AR se mantuvo. Por último, hay una aparición estocástica de los cánceres neuroendocrinos en el modelo TRAMP que se caracteriza por el aumento de expresión de sinaptofisina durante la progresión tumoral [25]. El examen de la expresión de sinaptofisina indica que el calcitriol y el tratamiento QW no alteraron la incidencia del fenotipo neuroendocrino (datos no mostrados).
La inmunohistoquímica se realizó con anti-CDH1, anti-AR y anticuerpos anti-MKI67 en secciones de tejido de control, calcitriol y los grupos de tratamiento QW. (A-D, G) la expresión de CDH1 en el grado no invasivo bajo (LG) y grado intermedio (IG) tejidos de la próstata ventral. fotomicrografías representativas de tinción CDH1 en el control (A-B) y calcitriol (C-D) grupos. El recuadro en (A) representa la tinción positiva CDH1 de las células epiteliales de colon normales. Las microfotografías se tomaron a 40 aumentos (A, C) y áreas enmarcadas representan el aumento de 100x (B, D). fotomicrografías representativas (40 aumentos) de AR expresión en las lesiones prostáticas no invasivos de lóbulos ventrales de control (E) y (F) Grupo de calcitriol. puntuación (G) CDH1 de lesiones del lóbulo ventral no invasivos de control (n = 25) y calcitriol (n = 27) grupos se calculó mediante la cuantificación de número de glándulas E-cadherina positivos como se describe en
Materiales y Métodos
sección. (H) proliferativa índice de LG y lesiones IG ventral del lóbulo de control (n = 30), calcitriol (n = 33) y QW (n = 27) grupos se determinó mediante la cuantificación de MKI67 tinción como se describe en
Materiales y Métodos
sección. Sólo se analizaron las lesiones prostáticas LG e IG, mientras que los cánceres en etapa tardía fueron excluidos por tanto de puntuación CDH1 y tinción MKI67. Todos los datos se representan como diagramas de caja con medianas, y bigotes representan el 5
º y 95
º percentiles. • (puntos), representan los puntos fuera de la 5
º y 95
percentil. Todos los valores de p se generaron utilizando la prueba de Mann-Whitney.
Además de examinar el estado de diferenciación de LG y lóbulos ventrales IG, la tinción inmunohistoquímica se realizó con un anticuerpo MKI67 para examinar el efecto del calcitriol y QW sobre la proliferación del lóbulo ventral. En comparación con vehículo, calcitriol disminuyó significativamente la proliferación en el lóbulo ventral (p = 0,0467), mientras que fue ineficaz QW (p = 0,2667) (Figura 5H). Análisis de apoptosis demostró que la expresión general de la caspasa pro-apoptótica 3 fue muy baja (datos no mostrados).