Extracto
malignidad es un problema importante en los pacientes tratados con agentes inmunosupresores. Hemos demostrado que el tratamiento con inhibidores de la calcineurina (ICN) puede inducir la activación de Ras proto-oncogénica, y puede promover una rápida progresión de cáncer renal humano a través de la sobreexpresión de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Curiosamente, se encontró que la proliferación de la sobreexpresión de VEGF y de células de cáncer inducida por CNI fue inhibida por la rapamicina tratamiento, lo que indica la implicación potencial de la diana de mamífero de la vía de la rapamicina (mTOR) en este proceso tumorigénico. A continuación, se analizó el papel de la vía mTOR en la mediación de la sobreexpresión inducida por Ras CNI- y de VEGF en las células de cáncer renal humano (786-0 y Caki-1). Se encontró que la caída de raptor (usando siRNA) disminuyó significativamente la actividad del promotor inducida por VEGF-CNI como se observa mediante el ensayo de promotor de luciferasa, lo que sugiere el papel de mTOR COMPLEX1 (mTORC1) en la transcripción inducida por VEGF-CNI. Se sabe que la mTOR se activa tras la fosforilación de su PRAS40 regulador negativo, que es una parte de mTORC1. Hemos observado que el tratamiento CNI y la activación de H-Ras (a través de la transfección de un plásmido de H-Ras activo) aumentaron notablemente la fosforilación de PRAS40, y la transfección de células por medio de un plásmido dominante negativo de Ras, disminuyó significativamente la fosforilación PRAS40. La proteína quinasa C (PKC) -ζ y PKC-δ, que son fundamentales para las moléculas vía tumorigénico inducida por el CNI, complejo formado con PRAS40 señalización intermediario; y hemos encontrado que el tratamiento CNI aumentó la formación del complejo entre PRAS40 y PKC, en particular (PKC) -ζ. La inhibición de la actividad de la PKC utilizando inhibidor farmacológico disminuyó notablemente la fosforilación inducida por el H-Ras de PRAS40. La sobreexpresión de PRAS40 en las células de cáncer renal significativamente reducido regulado activación transcripcional inducida por VEGF-H-Ras y CNI-. Por último, se observó que el tratamiento CNI aumenta la expresión de phosho-PRAS40 en los tejidos tumorales renales
in vivo
. Juntos, la fosforilación de PRAS40 es crítica para la activación de mTOR en la sobreexpresión de VEGF inducida por CNI y la progresión del cáncer renal
Visto:. Basu A, Banerjee P, Contreras AG, Flynn E, Pal S (2011) de la calcineurina inducida por los inhibidores y Ras mediada por la sobreexpresión de VEGF en las células de cáncer renal Involucra mTOR a través del Reglamento de PRAS40. PLoS ONE 6 (8): e23919. doi: 10.1371 /journal.pone.0023919
Editor: Sujit Basu, de la Universidad Estatal de Ohio, Estados Unidos de América
Recibido: 15 Julio, 2011; Aceptado: August 1, 2011; Publicado: 23 Agosto 2011
Derechos de Autor © 2011 Basu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue financiado por el texto siguiente: 1) Institutos nacionales de Salud de subvención R01 CA131145 (SP); 2) Juan-Merrill subvención ASN-AST (a los PM). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
las recientes mejoras en las terapias inmunosupresoras han reducido significativamente la incidencia de rechazo agudo de aloinjertos, y el aumento de la supervivencia de los pacientes con trasplante [1], [2]. Sin embargo, estos agentes también pueden contribuir a mayores tasas de mortalidad debido a un aumento del riesgo de cáncer [3], [4], [5], [6]. Se ha establecido que el cáncer representa la segunda causa principal de muerte en pacientes con trasplante renal con función normal del injerto [7]. También se ha demostrado que el entorno de trasplante puede acelerar la recurrencia o progresión del cáncer [3],. Por lo tanto, dianas terapéuticas necesitan ser desarrolladas con el fin de prevenir el desarrollo de cáncer en pacientes bajo terapia inmunosupresora.
Se cree que los agentes inmunosupresores para comprometer mecanismo (s) la vigilancia inmune de las células tumorales y /o interferir con la reparación del ADN normal mecanismos de [4], [5], [8]. En particular, los inhibidores de la calcineurina (ICN) son excelentes agentes inmunosupresores para inhibir el rechazo de aloinjertos; sin embargo, pueden promover el crecimiento de diferentes tumores [9], [10], [11], [12]. El complejo de la calcineurina se compone de tres subunidades, el catalizador A, el B, reguladora y calmodulina [13]. El calcio celular activa la subunidad catalítica para su función como la fosfatasa serina /treonina, que resulta en la activación del factor nuclear de células T activadas (NFAT) la familia de factores de transcripción [14]. La ciclosporina CNI (CsA) se une a cyclophylin, una proteína citoplasmática, y el complejo resultante se une a la subunidad B de regulación de la calcineurina y previene la activación de NFAT [15]. Sin embargo, aparte de la inhibición de NFAT, el ICN puede también regular otras moléculas de señalización que juega un papel importante en el crecimiento del tumor [16], [17]. Hojo
et al.
[9] mostró que CsA promueve la progresión del cáncer y la metástasis por efecto celular directa (s) a través de la producción de factor de crecimiento transformante-β (TGF-β), que es independiente de su efecto sobre el sistema inmunológico sistema del huésped. Koehl
et al.
[18] informó de que el tratamiento con CsA promueve el desarrollo de cáncer de post-trasplante, que depende del proceso de la angiogénesis tumoral altamente. Del mismo modo, Guba
et al.
[19] sugiere que el tratamiento con CsA puede inducir la expresión de citoquinas angiogénicas.
factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) es una de las citoquinas angiogénicas más potentes que juega papel importante en el crecimiento del tumor [20], [21]. Recientemente hemos demostrado que el tratamiento con ICN induce la sobreexpresión de VEGF, y promueve una rápida progresión de cáncer renal humano [22]. inducida por la sobreexpresión de VEGF CNI está regulada tanto a nivel transcripcional y post-transcripcional [22], [23]. También hemos encontrado que los ICN puede activar el proto-oncogénica H-Ras en células de cáncer renal humano [24]; y hemos demostrado que la sobreexpresión inducida por CNI VEGF está mediada a través de la activación de la proteína quinasa C (PKC) -ζ y PKC-δ [22], [23], que son potenciales dianas aguas abajo de Ras [25].
a diferencia de los ICN, el objetivo de la rapamicina en mamíferos (mTOR) rapamicina inhibidor (RAPA) puede tener un efecto totalmente opuesto en términos de desarrollo de tumores [10], [19], [26]. Los pacientes de trasplante que reciben tratamiento RAPA no desarrollan cáncer a la misma velocidad que los que reciben otros agentes inmunosupresores tales como ICN [27], [28]. Se ha demostrado que el tratamiento RAPA puede tener un efecto anti-angiogénico [19]. Curiosamente, se ha demostrado recientemente que el tratamiento RAPA puede inhibir significativamente inducida por CNI VEGF mRNA estabilidad [23], y la proliferación de las células de cáncer renal humano [24] CNI-inducida. Estos resultados sugieren claramente un posible papel de mTOR en vías oncogénicas inducidos por la CNI. En apoyo de estas observaciones, se ha informado de que se requiere la vía de la Akt-mTOR para el crecimiento tumoral inducida por CNI [29]. Además, tanto la PKC-ζ y PKC-δ pueden activar la vía de la Akt-mTOR [30], [31], [32], [33].
La vía mTOR desempeña un papel clave en la supervivencia celular , el crecimiento, la síntesis de proteínas, el metabolismo celular y la angiogénesis [34], [35]. Las alteraciones en la vía de la regulación de mTOR se producen en muchos tumores malignos sólidos, incluyendo cáncer de riñón [36], [37], [38]. mTOR, que se activa de forma constitutiva en muchos tipos de cáncer mediante la activación de oncogenes desregulada o la pérdida de genes supresores de tumores, funciona como complejos macromoleculares [39]. El COMPLEX1 mTOR (mTORC1), que contiene raptor, es RAPA sensibles; mientras que el Complex2 mTOR (mTORC2), que contiene Rictor, es RAPA insensible [34], [39]. Recientemente se ha establecido que un sustrato Akt rico en prolina de 40 kDa (PRAS40) puede regular negativamente la actividad de mTOR [40], [41]. Antes de ser fosforilada por Akt, PRAS40 se une al raptor raptor y secuestra a partir mTORC1; esto conduce a la interrupción de mTORC1 similar al efecto de RAPA [40], [42]. La interacción de PRAS40 con raptor compite con la interacción de aves rapaces con S6K1 y 4E-BP1 [42], [43]. Además, esta interacción de PRAS40 es muy específico para el mTORC1, como PRAS40 no se asocia con o interrumpir mTORC2 [34].
En este estudio, mostramos que el VEGF-inducida CNI y mediada por Ras-PKC sobreexpresión puede canalizarse a través de la vía de señalización mTORC1, y esto es mediada a través de la regulación de PRAS40. Se demuestra que el tratamiento CNI y la activación de H-Ras y PKC puede conducir a la fosforilación de PRAS40; y la sobreexpresión de PRAS40 conduce a la baja regulación de la activación transcripcional inducida por VEGF-Ras y CNI-. Los resultados de nuestro estudio sugieren un nuevo diafonía entre Ras, PKC y mTOR en la regulación de la sobreexpresión de VEGF inducida por la CNI.
Resultados
Participación de la mTOR en COMPLEX1 Inhibidor de la calcineurina inducida por la sobreexpresión de VEGF en células de cáncer renal humano
recientemente hemos demostrado que el tratamiento con inhibidores de la calcineurina (ICN) puede promover la sobreexpresión de VEGF en las células de cáncer renal humano a través de ambos reglamentos transcripcional y post-transcripcional [22], [23]. También hemos demostrado que CNI inducida por VEGF mRNA estabilidad, y la proliferación de células de cáncer renal inducida por CNI son marcadamente inhibida después del tratamiento con el inhibidor de mTOR rapamicina (RAPA) [23], [24]. Nuestros resultados indican claramente el posible papel de mTOR en vías oncogénicas inducidos por la CNI. Aquí, se examinó primero el papel de mTOR en la activación inducida por VEGF CNI transcripcional en las células de cáncer renal humano (786-0 y Caki-1). Las células fueron transfectadas con el plásmido VEGF promotor-luciferasa, y luego tratados con la ciclosporina CNI (CsA) en ausencia o presencia de RAPA. Como se muestra en la Figura 1A, el tratamiento CsA promueve la activación transcripcional de VEGF en células 786-0, y el tratamiento RAPA inhibió significativamente inducida por CsA la actividad del promotor de VEGF. Hemos encontrado un resultado similar (datos no mostrados) en las células Caki-1. A continuación, también se observó que el tratamiento con CsA indujo la expresión de la proteína VEGF como se observa mediante análisis de transferencia Western; y el tratamiento con RAPA la expresión del VEGF inducida por CsA inhibió significativamente (Figura 1B).
A,
786-0 células fueron transfectadas con el 2,6-kb VEGF construcción de promotor-luciferasa (0,5 g /bien). Después de la transfección, las células se cultivaron durante 12 horas, y después se trataron durante la noche (12 horas) con diferentes combinaciones de CsA (5,0 mg /ml) y RAPA (10,0 ng /ml) o vehículo solo (control). Después de 24 horas de la transfección, las células se recogieron, y se pliegan cambio en la actividad de la luciferasa se calculó como el recuento relativas de luciferasa de cada grupo de células en comparación con la de las células tratadas con vehículo solo. Los datos reflejan tres experimentos independientes.
Columnas, España media de las lecturas por triplicado de dos muestras diferentes;
barras de error, España SD.
B, 786-0 células fueron tratadas con diferentes combinaciones de CsA (5,0 mg /ml) y RAPA (10,0 ng /ml) o vehículo solo (control) para 24 horas. Se prepararon lisados de células enteras, y análisis de transferencia Western se realizó con anti-VEGF y anti-β-actina para cuantificar la expresión de la proteína de VEGF y β-actina, respectivamente. El gráfico de barras por debajo de la transferencia Western muestra la expresión relativa de VEGF por densitometría, en el que las señales fueron normalizados a la expresión de la β-actina de control interno. Representativos de tres experimentos independientes.
Columnas de búsqueda promedio de intensidad relativa de la expresión del VEGF a partir de tres diferentes manchas;
bares, España SD.
C,
786-0 células fueron transfectadas con cualquiera de rapaces siRNA (25 nM) o el control de siRNA. Después de 24 horas de siRNA transfección, las células se transfectaron con el 2,6-kb constructo promotor VEGF-luciferasa (0,5 mg /pocillo). Después de 12 horas de la transfección del plásmido, las células se trataron durante la noche (12 horas), ya sea con CsA (5,0 mg /ml) o vehículo solo (control). Las células se recogieron, y el cambio en la actividad de luciferasa se calculó como el recuento relativas de luciferasa de cada grupo de células en comparación con la de las células transfectadas con ARNsi de control y tratados con vehículo solo se pliegan. Los datos reflejan dos experimentos independientes.
Columnas, España media de las lecturas por triplicado de las muestras;
barras de error, España SD. La caída del raptor se confirmó mediante análisis de transferencia Western después de 48 horas a partir de la transfección siRNA (
panel de la derecha) gratis (A-B) *,
p
. & Lt; 0,01 en comparación con las células tratadas con vehículo ; **,
p
& lt; 0,01 en comparación con las células tratadas con CsA solamente. (C) *,
p
& lt; 0,01 en comparación con células de siRNA-transfectadas y tratados con vehículo de control; **,
p Hotel & lt; 0,05 en comparación con las células transfectadas con siRNA control y tratados con CsA
A continuación examinó el papel de mTOR COMPLEX1 (mTORC1) en inducida por VEGF-CNI. transcripción. Como se señaló anteriormente, Raptor es una parte de mTORC1 [34], [39]. En este caso, se observó que la caída del raptor utilizando siRNA significativamente downregulated inducida por CNI actividad del promotor de VEGF (Figura 1C). La caída de rapaces (~ 70%) se confirmó mediante análisis de Western blot (Figura 1C,
panel de la derecha
). En conjunto, estas observaciones sugieren claramente la implicación de mTORC1 en la sobreexpresión de VEGF inducida por la CNI en las células de cáncer renal.
El tratamiento con CNI, y la activación de H-Ras Promueve la fosforilación de PRAS40
Tenemos recientemente se muestra que el tratamiento CNI puede inducir la activación de H-Ras en células de cáncer renal [24]. En un informe reciente [44], se ha demostrado que la activación de Ras puede promover la señalización de mTOR. Como se discutió anteriormente, PRAS40 actúa como un regulador negativo de mTORC1, e inhibe su actividad para los acontecimientos de señalización corriente abajo [34], [40], [41]. Después de la fosforilación, PRAS40 se desvincula de raptor de mTORC1, y por lo tanto se activa mTOR. A medida que nuestro experimento anterior indica la participación de rapaces en la transcripción inducida por VEGF-CNI, aquí hemos querido evaluar si el tratamiento CNI y la activación de H-Ras pueden regular la fosforilación PRAS40. En primer lugar, se comprobó la expresión de fosfo-PRAS40 en las células epiteliales renales normales (RPTEC), y en 786-0 y Caki-1 células de cáncer renal. A través de Western blot, se encontró que la expresión de fosfo-PRAS40 fue marcadamente superior en 786-0 y Caki-1 células en comparación con RPTEC (Figura 2A,
panel superior
); sin embargo, no hubo ningún cambio significativo en la expresión de PRAS40 totales en estas células (Figura 2A, panel de
inferior
). Esta observación sugiere que la vía mTOR es activa en las células de cáncer renal.
A, España La expresión de fosfo-PRAS40 y PRAS40 se midió en lisados de células enteras de RPTEC, 786-0, y Caki-1 mediante análisis de transferencia de Western usando anti-fosfo-PRAS40 y anti-PRAS40.
B, 786-0 células se trataron con diferentes concentraciones (1,0 y 5,0 mg /ml) de CsA o con vehículo solo (control) para 3 horas. Las células se lisaron, y la expresión de fosfo-PRAS40 y PRAS40 se midió por análisis de transferencia Western.
células C, España Caki-1 fueron transfectadas con cualquiera concentraciones crecientes (0,1-1,0 g /pocillo) de H-Ras (12V) o vector de expresión vacío (control) durante 24 horas. Las células se lisaron, y la expresión de fosfo-PRAS40, PRAS40, Ras, y β-actina en los lisados celulares se midió por análisis de transferencia Western.
D,
Caki-1 células fueron transfectadas con cualquiera diferentes concentraciones (0,5 y 1,0 g /pocillo) de la Ras dominante negativo (17N) o vector de expresión vacío (control) para 24 horas. Las células se lisaron, y la expresión de fosfo-PRAS40, y PRAS40 se midió por análisis de transferencia Western. (A-D) representativos de tres experimentos independientes con resultados similares.
Se determinó siguiente, el efecto del tratamiento con CsA sobre la fosforilación PRAS40. 786-0 células se trataron con concentraciones de CsA o el vehículo solo en aumento; y la expresión de fosfo-PRAS40 se examinó por análisis de transferencia Western. Como se muestra en la Figura 2B, el tratamiento CsA aumentó notablemente el nivel de expresión de fosfo-PRAS40 comparación con el control tratado con vehículo (
panel superior
); Sin embargo, no hubo ningún cambio significativo en la expresión de PRAS40 totales después del tratamiento con CsA (
panel inferior
).
A continuación, se buscó evaluar el efecto de la activación de H-Ras en la fosforilación PRAS40. Con este fin, Caki-1 células fueron transfectadas ya sea con concentraciones crecientes del plásmido que expresa forma activada de H-Ras, H-Ras (12V), o el vector de expresión vacío. Después de la transfección, se midió la expresión de fosfo-PRAS40 y PRAS40 total. Se encontró que la activación de H-Ras aumentó significativamente el nivel de phosho-PRAS40 comparación con el control transfectadas con vector (Figura 2C,
primer panel
); no hubo ningún cambio significativo en el total de PRAS40 después de la activación de H-Ras (Figura 2C,
segundo panel
). La sobreexpresión de H-Ras (12V) en estas células se confirmó por análisis de transferencia Western (Figura 2C,
tercer panel
).
Finalmente, se comprobó el efecto de la inhibición de la Ras endógeno sobre la fosforilación de PRAS40. Las células Caki-1 se transfectaron o bien con el mutante dominante negativo de Ras, se midió Ras (17N), o el vector vacío, y la expresión de fosfo-PRAS40. Como se muestra en la Figura 2D, la inhibición de Ras disminuyó la expresión de fosfo-PRAS40 (
panel superior
); sin embargo, no hubo ningún cambio significativo en la expresión de PRAS40 total (
panel inferior
). En conjunto, estas observaciones sugieren que el tratamiento CNI y la activación de la vía de H-Ras en células de cáncer renal humano puede inducir mTOR mediante el aumento de la fosforilación de PRAS40.
Formas de PKC Complejo con PRAS40, y puede inducir su fosforilación
En nuestro informe anterior [22], hemos demostrado que tanto la PKC-ζ y PKC-δ moléculas son críticas para la activación transcripcional inducida por VEGF-CNI señalización intermediario; y estas isoformas de PKC pueden servir como potenciales objetivos de abajo de Ras activa [25]. Aquí, hemos tratado de determinar si la PKC podría regular la fosforilación de PRAS40. En primer lugar, hemos comprobado si había alguna formación de complejos entre PRAS40 y las células ya sea PKC-zeta y PKC-delta en RPTEC y 786-0 en condiciones basales. Por inmunoprecipitación, se observó que, en efecto, tanto la PKC-ζ y PKC-δ podrían hacer complejo con PRAS40 (Figura 3A); sin embargo, la intensidad del complejo era mucho más fuerte en células de cáncer frente a las células epiteliales renales normales. A continuación examinó si el tratamiento CNI podría modular la formación del complejo entre PRAS40 y PKC-ζ y PKC-δ en células 786-0. Como se muestra en la Figura 3B, el tratamiento con CsA aumentó notablemente el complejo entre PRAS40 y PKC-ζ comparación con el control tratado con vehículo; sin embargo, no hubo ningún cambio significativo (datos no mostrados) en la formación del complejo entre PRAS40 y PKC-δ.
A,
lisados de RPTEC y 786-0 células se inmunoprecipitaron con anti- PRAS40.
B, 786-0 células se trataron con CsA (5,0 mg /ml) o vehículo solo (control) durante 2 horas. Los lisados celulares se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-PRAS40. (A-B) Los inmunoprecipitados (IP) fueron capturados por los granos A-Sepharose de proteína, hervidas en tampón de SDS, y se separaron por SDS-PAGE. El análisis de transferencia Western se realizó utilizando anti-PKCζ, o anti-PKC, o anti-PRAS40.
C,
786-0 células fueron tratadas con concentraciones crecientes (o bien 50 a 250 nmol /L) de calfostina C o vehículo solo (control) para 3 horas. Las células se lisaron, y la expresión de fosfo-PRAS40 y PRAS40 se midió por análisis de transferencia Western.
D,
Caki-1 células fueron pretratadas con cualquiera calfostina C (100 nmol /L) o vehículo solo; y las células fueron luego transfectadas con cualquiera de H-Ras (12V) (1,0 g /pocillo) o vector solo por 24 horas, en ausencia o presencia de calfostina C. Las células se lisaron, y la expresión de fosfo-PRAS40 y PRAS40 se midió por El análisis de transferencia Western. (A-D) representativos de tres experimentos independientes con resultados similares.
A continuación, probamos si la inhibición de la PKC a través del tratamiento de inhibidor farmacológico podría disminuir la fosforilación de PRAS40. 786-0 células se trataron con cualquiera de concentraciones crecientes de calfostina C o el vehículo solo. Después del tratamiento, la expresión de fosfo-PRAS40 y PRAS40 total se midió por análisis de transferencia Western. Como se muestra en la Figura 3C, el tratamiento con calfostina C disminuyó notablemente el nivel de phosho-PRAS40 comparación con el control tratado con vehículo (
panel superior
); sin embargo, no hubo ningún cambio significativo en la expresión de PRAS40 total (
panel inferior
). En conjunto, estas observaciones sugieren que PKC puede asociarse con PRAS40, y regular su fosforilación. Sin embargo, no se puede concluir si hay una formación de complejo directa entre PKC y PRAS40, y si algunas otras moléculas asociadas están implicadas en la fosforilación PRAS40 mediada por PKC.
La inhibición de la PKC regula a la baja H-Ras-Induced La fosforilación de PRAS40
En nuestros experimentos anteriores, hemos demostrado que la activación de H-Ras podía inducir la fosforilación PRAS40. Aquí, hemos querido explorar si la inhibición de la PKC podría regular negativamente la fosforilación inducida por Ras-H de PRAS40 en las células de cáncer renal. Con este fin, las células Caki-1 fueron transfectadas con cualquiera de H-Ras (12V) o el vector de expresión vacío en ausencia o presencia del inhibidor de PKC calfostina C. Después de la transfección, la expresión de fosfo-PRAS40 y PRAS40 total se midió. Como se muestra en la figura 3D (
superior del panel
), la activación de H-Ras indujo la fosforilación de PRAS40 comparación con el control transfectadas con el vector; y la inhibición de la PKC significativamente reducido regulado fosforilación inducida PRAS40-H-Ras. No hubo ningún cambio significativo en la expresión de PRAS40 después de la activación total de H-Ras y la inhibición de PKC (Figura 3D,
panel inferior)
. Estas observaciones sugieren claramente que la vía de Ras-PKC, que es crítica para los eventos de señalización inducidos por tumorigénicas CNI, puede fosforilar PRAS40, y por lo tanto puede activar mTOR.
sobreexpresión de PRAS40 Inhibe CNI- y H-Ras-Induced la activación de la transcripción de VEGF
Nuestros experimentos anteriores sugiere que la CNI-inducida y vías de señalización mediadas por Ras podría inactivar PRAS40 a través de su aumento de la fosforilación. A continuación, se analizó en primer lugar si la sobreexpresión de PRAS40 podría inhibir la sobreexpresión inducida por el CNI de VEGF en las células de cáncer renal. 786-0 células fueron co-transfectadas con la construcción de promotor de VEGF-luciferasa y, o bien el plásmido sobreexpresión PRAS40 o el vector de expresión vacío. Las células se trataron con CsA o el vehículo solo. Como se muestra en la Figura 4A, el tratamiento CsA aumentó la activación transcripcional de VEGF en comparación con el control tratado con vehículo; y la sobreexpresión de PRAS40 redujo significativamente la actividad del promotor de VEGF inducida por CsA. La sobreexpresión de PRAS40 en las células transfectadas fue confirmado por Western blot (Figura 4A, panel de
menor
).
A, arriba,
786-0 células fueron co transfectadas con el 2,6-kb VEGF construcción de promotor-luciferasa (0,5 mg /pocillo) y un plásmido de sobreexpresión PRAS40 (myc-PRAS40) (0,5 g /pocillo) o vector vacío. Después de la transfección, las células se cultivaron durante 12 horas, y después se trataron durante la noche (12 horas), ya sea con CsA (5,0 mg /ml) o vehículo solo (control). Después del tratamiento con CsA, se recogieron las células, y se pliegan cambio en la actividad de la luciferasa se calculó como el recuento relativas de luciferasa de cada grupo de células en comparación con la de las células transfectadas con el vector vacío y tratados con vehículo solo.
A, parte inferior, España La sobreexpresión de myc-PRAS40 plásmido en las células transfectadas se confirmó por análisis de transferencia de Western usando anti-PRAS40; y la expresión de β-actina se midió como control interno.
B, células Caki-1 se co-transfectaron con el constructo de 2,6-kb VEGF promotor de luciferasa (0,5 mg /pocillo) y diferentes combinaciones de H-Ras (12V), myc-PRAS40 y el vector vacío (0,5 mg /pocillo de cada plásmido). Después de 24 horas de la transfección, las células se recogieron, y se pliegan cambio en la actividad de la luciferasa se calculó como el recuento relativas de luciferasa de cada grupo de células en comparación con la de las células transfectadas con el vector vacío. (A-B) Los datos reflejan tres experimentos independientes.
Columnas, España media de las lecturas por triplicado de dos muestras diferentes;
barras de error, España SD. En A, *,
p Hotel & lt; 0,01 en comparación con el vacío células tratadas con vehículo transfectadas con el vector y; **,
p
& lt; 0,01 en comparación con las células transfectadas con el vector y tratados con CsA vacías. En B, *
p
& lt; 0,01 en comparación con las células transfectadas con el vector; **,
p
. & Lt; 0,01 en comparación con los vectores y H-Ras (12V) células transfectadas
A continuación, se determinó si la sobreexpresión de PRAS40 podría inhibir H- Ras inducida por la transcripción de VEGF. células Caki-1 se co-transfectaron con la construcción de VEGF promotor-luciferasa y H-Ras (12V) en ausencia o presencia del plásmido PRAS40 sobreexpresión. Las células de control se transfectaron con vectores de expresión vacío. Como se muestra en la Figura 4B, la activación de H-Ras aumento de la activación de la transcripción de VEGF en comparación con las células transfectadas con el vector; y la sobreexpresión de PRAS40 disminuyó significativamente la actividad del promotor de VEGF H-Ras-inducida. En conjunto, estos hallazgos sugieren que los eventos de señalización inducida por Ras CNI- y pueden promover la activación transcripcional de VEGF en una vía mTOR dependientes a través de la regulación de PRAS40.
Tratamiento CNI Aumenta la fosforilación de PRAS40 en los tejidos tumorales renales
Vivo en
recientemente hemos demostrado que en inmunodeficientes (
nu /nu)
ratones, CNI tratamiento (CsA) aceleró significativamente el crecimiento de los tumores renales humanas (786-0) a través de la angiogénesis inducida por VEGF, en comparación con los controles tratados con vehículo [22]. Sin embargo, no evaluamos el nivel de expresión de fosfo-PRAS40 en los tumores. Por lo tanto, aquí se examinó el estado de fosfo-PRAS40 en estos tejidos tumorales de CsA tratada, así como los ratones de control. Como se muestra en la Figura 5, la expresión de fosfo-PRAS40 se incrementó notablemente (como se observa por parches de manchas de color rojo oscuro) en los tejidos tumorales renales obtenidas de ratones tratados con CsA (
parte superior derecha del panel
), en comparación con el tumor tejidos del grupo de control tratado con vehículo (
panel superior izquierdo
). Sin embargo, no hubo ningún cambio significativo en la expresión de PRAS40 totales en los tejidos tumorales obtenidos de tratado con CsA (
medio panel derecho
) o el grupo tratado con vehículo (
central izquierda del panel
). Nuestro
in vivo
de datos es similar a nuestro
in vitro
hallazgos, y sugiere que la CNI y mediada por VEGF inducida por el crecimiento acelerado de los tumores renales humanas pueden entrañar un mayor fosforilación de PRAS40, que puede conducir a la activación de la vía mTOR
células de cáncer renal humano (1,0 × 10
6; 786-0). se inyectaron sc en nude (
nu /nu
) ratones (
n
= 5 en cada grupo), y que fueron tratados con CsA (10 mg /kg /día) o con el vehículo como control . Los tumores se recogieron en el día 25 después de la inyección del tumor. fotomicrografías representativas ilustran la expresión inmunohistoquímica de fosfo-PRAS40 (
paneles superiores
) y PRAS40 (
paneles medias
) en los tejidos tumorales renales cosechadas (ampliación X 400).
manchas de color rojo oscuro, España expresión de phosho-PRAS40, que se incrementó notablemente en los tejidos del tumor en los ratones tratados con CsA. H & amp; E, hematoxilina y eosina. Representativos de tres diferentes muestras de tejido tanto de CsA y los grupos tratados con vehículo.
Discusión
El desarrollo, así como una rápida progresión del cáncer es un problema importante en los pacientes tratados con inmunosupresores agentes [3], [4], [5]. Recientemente hemos demostrado que los inhibidores de la calcineurina (ICN) pueden promover una rápida progresión del cáncer renal humano a través de la sobreexpresión de VEGF [22], [23]; y H-Ras y PKC pueden actuar como moléculas de señalización críticos intermediarios para la sobreexpresión inducida por CNI VEGF [22], [24]. En este estudio, mostramos una nueva vía, en la que indujo-CNI y Ras-PKC mediada por señales pueden implicar mTORC1 a través de la regulación de su PRAS40 molécula inhibidora, y promover la sobreexpresión de VEGF.
Como se señaló anteriormente, los ICN mediar en su función inmunosupresora través de la inhibición de la vía de la calcineurina-NFAT [15]. Sin embargo, ICN también puede regular otras moléculas de señalización implicadas en la expresión de VEGF y otros genes [16], [17]. Recientemente hemos demostrado que el tratamiento CNI puede activar H-Ras, y también puede inducir la fosforilación de sus objetivos de abajo, PKC-zeta y PKC-delta; y promueve la sobreexpresión de VEGF en células de cáncer renal humano [22], [23]. Chen
et al.
[45] han informado de que el estrés oxidativo inducido por CsA puede hasta de regular y activar PKC-ζ en células B humanas infectadas por virus, que pueden conducir a la inducción de trastornos linfoproliferativos en pacientes trasplantados.
Curiosamente, hemos demostrado que la sobreexpresión de VEGF inducida por CNI y la proliferación de células de cáncer renal se inhibe por el tratamiento RAPA, lo que sugiere el posible papel de mTOR en las vías tumorigénicas inducidas por CNI que implica la activación Ras [23], [ ,,,0],24]. . En apoyo a nuestras observaciones, Carriere
et al
[44] han informado recientemente que la activación mitogénica y oncogénico de la vía Ras puede inducir mTORC1; también se ha demostrado que se requiere la vía de la Akt-mTOR para el crecimiento tumoral inducida por CNI [29]. Además, tanto la PKC-ζ y PKC-δ pueden promover la inducción de la ruta de Akt-mTOR [30], [31], [32], [33]; y la PI-3K /Akt /señales mTOR mediada puede canalizarse a través de HIF y SP1 [46], [47], dos de los principales factores de transcripción para la expresión del VEGF [25], [48].
En el presente estudio, encontramos que raptor, que es una parte de mTORC1 es crítica para la activación transcripcional inducida por VEGF-CNI. Se demuestra que la CNI /Ras inducida y la sobreexpresión de VEGF mediada por PKC en células de cáncer renal humano implica PRAS40, un regulador negativo de mTORC1 [34], [40], [41]. El tratamiento CNI, así como la activación de Ras y PKC promueve la fosforilación de PRAS40, que puede conducir a la inducción de la vía de señalización de mTOR. Nuestro estudio sugiere que el papel de H-Ras en la regulación de la fosforilación PRAS40; Sin embargo, no podemos descartar los papeles de otras dos isoformas de Ras (K-Ras y N-Ras) en este proceso. Anteriormente, hemos demostrado que el tratamiento CNI media una rápida progresión de tumor renal humano a través de la angiogénesis inducida por VEGF [22]; Aquí, mostramos que la expresión de fosfo-PRAS40 se incrementa notablemente en estos tejidos tumorales renales después del tratamiento CNI. La sobreexpresión de PRAS40 redujo significativamente la activación transcripcional inducida por VEGF-Ras CNI- y. Por lo tanto, nuestro estudio sugiere claramente que mTOR es una molécula de señalización crítica en la vía de tumorigénico inducida por CNI (s) que pueden dar lugar a la sobreexpresión de VEGF en el cáncer renal.