Se requiere
Extracto
telomerasa para la vida útil ilimitada de las células cancerosas. La gran mayoría de los adenocarcinomas de páncreas sobreexpresan actividad de la telomerasa y el bloqueo de la telomerasa podría limitar su vida útil. GRN163L (imetelstat) N3 es un lípido conjugado '→ P5' tio-fosforamidato oligonucleótido que bloquea la región de plantilla de la telomerasa. El objetivo de este estudio fue definir los efectos de la exposición GRN163L a largo plazo en el mantenimiento de los telómeros y la vida útil de las células de cáncer de páncreas. tamaño de los telómeros, la actividad de la telomerasa, y la respuesta de inhibición de la telomerasa a GRN163L se midieron en un panel de 10 líneas celulares de cáncer de páncreas. Las líneas celulares exhibieron grandes diferencias en los niveles de actividad de la telomerasa (variación de 46 veces), pero la mayoría de las líneas tenían telómeros muy cortos (2-3 kb de tamaño). GRN163L inhibe la telomerasa en las 10 líneas celulares de cáncer de páncreas, con IC
50 que van desde 50 nM a 200 nM. exposición GRN163L continua de CAPAN1 (IC
50 = 75 nM) y CD18 células (IC
50 = 204 nM) dio como resultado un acortamiento inicial rápida de los telómeros, seguido por el mantenimiento de los telómeros extremadamente cortos pero estable. La exposición continua a la droga finalmente llevó a la crisis ya una pérdida completa de viabilidad después de 47 (CAPAN1) y 69 duplicaciones (CD18). Crisis En estas células fue acompañada por la activación de una respuesta de daño del ADN (γ-H2AX) y la evidencia tanto de la senescencia (SA-actividad β-galactosidasa) y la apoptosis (contenido de ADN sub-G1, la escisión de PARP). La eliminación del fármaco después de la exposición a largo plazo GRN163L llevó a una reactivación de la telomerasa y re-alargamiento de los telómeros en la tercera semana de cultivo sin GRN163L. Estos hallazgos muestran que la vida útil de las células de cáncer de páncreas puede ser limitado por inhibición de la telomerasa continua. Estos resultados deben facilitar el diseño de futuros ensayos clínicos de GRN163L en pacientes con cáncer de páncreas
Visto:. Burchett KM, Yan Y, Ouellette MM (2014) Inhibidor de la telomerasa imetelstat (GRN163L) limita la vida útil de cáncer de páncreas humano Células. PLoS ONE 9 (1): e85155. doi: 10.1371 /journal.pone.0085155
Editor: Arthur J. Lustig, Universidad de Tulane Centro de Ciencias de la Salud, Estados Unidos de América
Recibido: 19 Julio, 2013; Aceptado: 23 Noviembre 2013; Publicado: 7 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Burchett et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto Nacional del cáncer (NCI) de esporas (P50 CA127297) y la formación de subvención del NCI (T32 CA09476). Los proveedores de fondos tenido ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores tienen los siguientes intereses. GRN163L y el oligonucleótido no coincidente se proporcionan de forma gratuita por Geron Corp. (Menlo Park, CA). Los autores desean expresar su agradecimiento por el asesoramiento, la retroalimentación y reactivos adicionales que se les proporciona por Sergei Gryaznov, Robert Tressler, Ning Ir y Katia Bassett de Geron Corp. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre el reparto datos y materiales.
Introducción
el cáncer de páncreas es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en el mundo occidental. El cáncer de páncreas es una enfermedad de progresión insidiosa y de alta letalidad, con una tasa de supervivencia a 5 años de sólo el 6%. Sólo en los Estados Unidos, se espera que un estimado de 43.920 pacientes a ser diagnosticados con la enfermedad en 2012, y se espera que 37.390 pacientes a morir de ella [1]. La gran mayoría de estos casos son adenocarcinomas ductales pancreáticas, que se desarrollan en los conductos del páncreas. Estos tumores altamente invasivos consisten en un estroma desmoplásico abundante, en el que están incrustadas las células cancerosas malignas que expresan marcadores de células ductales pancreáticas [2], [3]. Para los pacientes con adenocarcinoma ductal pancreático, la única opción es la cirugía curativa [3]. El procedimiento estándar es un pancreaticoduodenectomía (o procedimiento de Whipple), una operación quirúrgica que elimina la cabeza del páncreas, pero respeta el tejido restante. Por desgracia, los pacientes con cáncer de páncreas más actuales con metastásico no resecable o enfermedad localmente avanzada. De hecho, sólo 20% de los pacientes tienen tumores resecables en el momento del diagnóstico [3]. Pero incluso para aquellos pacientes que se someten a cirugía, la tasa de supervivencia global a los 5 años es de sólo el 20%, ya que la mayoría de estos pacientes recaerán dentro de un año de la cirugía [3]. Por lo tanto, hay una necesidad crítica de nuevos fármacos que pueden dirigirse más eficazmente estas células tumorales y /o reducir la incidencia de recurrencia. Se han propuesto inhibidores de la telomerasa para ser especialmente bien adaptado para bloquear el nuevo crecimiento de las células cancerosas residuales después de la terapia convencional del cáncer [4], [5]. No sólo se dirigen selectivamente a las células cancerosas positivas de telomerasa, pero sus efectos inhibidores del crecimiento aumentan a medida que las células diana realizan un número creciente de divisiones celulares. En el presente estudio, hemos caracterizado los efectos de un inhibidor de la telomerasa, GRN163L, en la vida celular y la supervivencia de un panel de líneas celulares de cáncer de páncreas.
La telomerasa es la enzima responsable del mantenimiento de los telómeros, esencial estructuras que tapa y protegen los extremos de los cromosomas lineales. telómeros humanos están hechos de copias en tándem (TTAGGG)
n repite ADN y de las proteínas asociadas, que en conjunto forman un complejo que capsula protectora [6], [7]. Este casquillo protege a los cromosomas de la degradación termina, interchromosomal fusiones y de ser reconocidos como (ds) rupturas de doble hebra de ADN, una forma de daño en el ADN [7], [8]. Debido a los problemas asociados con la replicación de los extremos de las moléculas de ADN lineales, los llamados problemas de replicación final, los telómeros se acortan cada vez que las células somáticas humanas se dividen y este desgaste limita su vida útil [9]. Una vez que el telómero más corto convertirse destapado, una respuesta al daño del ADN es inducido que moviliza el p53 y p16 vías /PRB, que a su vez actúan juntos para inducir la senescencia, un estado viable de quiescencia irreversible [10], [11]. Si las vías de p53 y p16 /pRB están desactivados, las células se ignoran estas señales inhibidoras del crecimiento y continúan dividiéndose y acortar sus telómeros. Con el tiempo, los telómeros acortar el terminal de plomo a la crisis, un estado no viable asociada con la muerte celular programada [10], [11]. Crisis se desencadena por ciclos recurrentes de fusiones telómero-telómero, puentes anafase y la rotura de cromosomas [12]. Cuando está presente, la telomerasa puede prevenir la inducción de la senescencia y la crisis y prolongar la vida celular mediante la síntesis y la adición de nuevas repeticiones teloméricas a los telómeros. La telomerasa es ubicua presente en las primeras etapas del desarrollo humano. Pero por el momento del nacimiento, la expresión de la enzima telomerasa es reprimida y se vuelve ausente de la mayoría de los tejidos somáticos [13], [14], incluyendo el páncreas [15], [16], [17]. especímenes de cáncer, en marcado contraste con los tejidos normales, son casi siempre positivo para la actividad telomerasa [18], incluyendo los adenocarcinomas ductales pancreáticas [15], [16], [17]. Detectado en más de 85% de los cánceres, con independencia del tipo de tumor, la telomerasa es uno de los marcadores más conocidos de las células del cáncer [18]. Por otra parte, se requiere esta expresión de la telomerasa en las células cancerosas para su proliferación ilimitada o la inmortalidad, una característica del cáncer. En consecuencia, la inhibición de la telomerasa en células de cáncer conduce a desgaste de los telómeros y limita la vida útil de estas células [19], [20], [21], [22]. Después de suficiente desgaste de los telómeros ha tenido lugar, las células de cáncer de telomerasa inhibido sucumbirán a cualquiera de senescencia o apoptosis, dependiendo del sistema celular. Esta dependencia de la telomerasa a partir de su crecimiento ilimitado y la expresión casi universal de la telomerasa en las células cancerosas hacer telomerasa un objetivo atractivo para la terapia del cáncer. Un posible inconveniente, sin embargo, son los retrasos necesarios antes de que las células cancerosas específicas han perdido los telómeros suficientes para el envejecimiento o la crisis para ser inducido. Esta acción retardada podría impedir su uso como una primera línea de tratamiento para el cáncer, pero para bloquear el rebrote de la enfermedad residual después de la terapia convencional, se ha esperado que los inhibidores de la telomerasa para tener un buen potencial terapéutico [4], [5].
telomerasa humana contiene dos subunidades esenciales: la proteína hTERT (transcriptasa inversa de la telomerasa humana) y el pequeño hTR ARN nuclear (ARN de la telomerasa humana). El primero proporciona una actividad catalítica y la segunda contiene una secuencia corta (5'-CUAACCCUAA-3 ') que sirve como una plantilla para la síntesis de repeticiones teloméricas [23]. El sustrato de la telomerasa es el voladizo 3'-telomérico monocatenario que limita el final de todos los telómeros. Las funciones de la enzima como una transcriptasa inversa y utiliza el ARN hTR como una plantilla para la síntesis y la adición de ADN telomérico se repite con los salientes 3 'teloméricas. Para la inhibición de la telomerasa, la región de plantilla del ARN de telomerasa humana (hTR) presenta un objetivo accesible para los inhibidores de oligonucleótidos basados en [4], [24]. Los oligonucleótidos diseñados para hibridar con la región de plantilla se pueden utilizar para inhibir la actividad de la telomerasa [25], [26]. Los oligonucleótidos con diferentes composiciones químicas han sido probados y los oligonucleótidos N3'-P5 'tio-fosforamidato han producido algunos de los inhibidores más potentes y selectivos de la telomerasa [25], [27], [28]. Estos compuestos no son tóxicos, solubles en agua, resistentes a las nucleasas y muestran alta estabilidad térmica de los dúplex formados con sus cadenas de ARN complementarias. GRN163L es una segunda generación N3'-P5 'fosforamidato tio-inhibidor de la telomerasa diseñado por Geron Corp. (Menlo Park, CA) [20]. Este inhibidor, también conocido como imetelstat, lleva un resto 5 'terminal palmitoil conjugado con el N3' & gt; P5 'tio-fosforamidato columna vertebral (5'-palmitato-TAGGGTTAGACAA-NH
2-3'). GRN163L es soluble en lípidos y no requiere de la transfección para la captación celular. A concentraciones nanomolares, GRN163L inhibe la telomerasa en un amplio espectro de líneas celulares de cáncer [20]. En estudios de seguimiento, la exposición GRN163L largo plazo podría limitar la vida útil de las células de cáncer cultivadas derivadas de glioblastoma [29], mieloma múltiple [30] y el adenocarcinoma de esófago de Barrett [31], así como de mama [32], [33], pulmón [34] y el hígado [35] cánceres. En modelos de ratón, el inhibidor podría inhibir el crecimiento de xenoinjertos producidos en ratones por la implantación de estas células de cáncer humano [29], [30], [31], [33], [34], [35]. GRN163L está actualmente en ensayos clínicos en pacientes con mieloma múltiple (ClinicalTrials.gov identificador: NCT01242930)., Trombocitemia esencial o policitemia vera (NCT01243073), y mielofibrosis primaria o secundaria (NCT01731951)
Los efectos de la inhibición de la telomerasa, y mucho menos GRN163L, nunca han sido examinados en el cáncer de páncreas, una de las neoplasias más mortales y más recurrentes. En este informe, hemos probado los efectos de GRN163L en un panel de 10 líneas celulares de cáncer de páncreas. Con IC
50 en el intervalo nanomolar, GRN163L telomerasa eficazmente inhibida en las 10 líneas celulares. exposición GRN163L continua de células CAPAN1 y CD18 resultó en un acortamiento inicial rápida de los telómeros, seguido por el mantenimiento de los telómeros extremadamente cortos pero estable. La exposición continua a la droga finalmente llevó a la crisis ya una pérdida completa de viabilidad después de 47 y 69 duplicaciones, respectivamente. Estos resultados muestran que la exposición continua a GRN163L puede revertir el fenotipo inmortal de las células de cáncer de páncreas. Estos hallazgos deberían facilitar el diseño de futuros ensayos clínicos de GRN163L en pacientes con cáncer de páncreas.
Materiales y Métodos
Materiales
suero bovino fetal (FBS) era de Hyclone ( Logan, UT, EE.UU.). T4 polinucleótido quinasa, la proteinasa K, gentamicina, penicilina /estreptomicina, medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio RPMI-1640, medio modificado de Dulbecco de Iscove y medio 5A de McCoy se adquirieron de Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA, EE.UU.). Las enzimas de restricción AluI, MspI, HaeIII, HinfI y RsaI eran de New England Biolabs (Ipswich, MA, EE.UU.), mientras que Cfol se obtuvo de Promega Corporation (Madison, WI, EE.UU.). El cóctel de inhibidores de proteasa de mamífero fue de Sigma-Aldrich (Saint-Louis, MO, EE.UU.). El palmitoil-conjugado N3 '& gt; P5' fosforamidato tio-oligo GRN163L (5'-palmitato-TAGGGTTAGACAA-NH
2-3 ') y oligo no coincidentes (5'-palmitato-TAGGTGTAAGCAA-NH
2-3 '; desajustes subrayados) fueron proporcionados por Geron Corporation (Menlo Park, CA, EE.UU.). El N3 '& gt; P5' oligos se disolvieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para hacer que los stocks 1 mM, que se mantuvieron congeladas a -80 ° C tio-fosforamidato. Todos los demás productos químicos eran de Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, EE.UU.).
Líneas Celulares
Las líneas celulares utilizadas fueron descritos anteriormente por otros [36], [37], [38], [ ,,,0],39], [40], [41]. Las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2. Todas las líneas celulares se cultivaron en medio suplementado con 10% FBS y, o bien 50 mg /ml de gentamicina o 100 U /ml de penicilina /estreptomicina. Los medios utilizados fueron los siguientes: DMEM para la mayoría de líneas celulares (VA13, HeLa, HPAF, CD18, Hs766T, CAPAN1, MiaPaca2, Panc1 y células L3.6pl); medio RPMI-1640 para las células AsPC1; medio modificado de Iscove Dulbecco para CFPAC1; y medio 5A de McCoy para las células CAPAN2.
Análisis de tamaño de los telómeros
ADN genómico total se aisló de gránulos congelados de células. Brevemente, las células se resuspendieron en 2 volúmenes de un tampón que contiene NaCl 100 mM, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) y EDTA 25 mM (pH 8,0), después de lo cual se añadió 0,4 mg /ml de proteinasa K. a continuación, se añadió dodecil sulfato de sodio (SDS) a una concentración final de 0,5% (w /v) y las muestras se rotaron durante la noche a 50 ° C. El día siguiente, las muestras se extrajeron dos veces con Tris fenol saturado con tampón y después una vez con agua saturada CHCl
3. A continuación, las muestras se dializaron durante la noche a 4 ° C frente a dos cambios de tampón TE (EDTA 1 mM y 10 mM Tris-HCl, pH 8,0). muestras de ADN genómico se almacenaron a 4 ° C.
ADN genómico (5-10 g) se digirió a 37 ° C durante 2-4 horas en 100 l de tampón React 1 (mM MgCl 10
2 y 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) con un cóctel de enzimas de restricción que no para cortar ADN telomérico: AluI, CFOI, HaeIII, HinfI, MspI, y RsaI (16 unidades de cada uno). Las muestras digeridas se cargaron en un gel de 25 cm de largo de agarosa al 0,7% en 0,5 x tampón TBE (Tris-EDTA-borato), junto con un [
32P] marcador de ADN de peso -molecular final de la etiqueta. La electroforesis se realiza durante la noche a 50 voltios, después de lo cual el gel se transfirió a un papel de 3 M y se secó al vacío a 60 ° C durante una hora. El gel se empapó en NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M durante 15 minutos, durante el cual el papel de 3 M se despegó. El gel se neutralizó por 2 x 15 minutos en 1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl, pH 7,4 y luego se transfiere a 6 x SSC (NaCl 750 mM, citrato de sodio 75 mM, pH 7,0). Pre-hibridación se realizó durante 2 horas a 30 ° C en un tampón que contiene 5 x SSC, 5 x solución de Denhardt, EDTA 1 mM, 0,1% SDS (w /v) y 10 mM LiCl. La hibridación se realizó en el mismo tampón a 37 ° C durante la noche, el uso de 0,5 a 1,0 × 10
6 cpm /ml de un marcado en el extremo [
32P] - (TTAGGG) sonda
4. El gel se pre-lavado en 5 x SSC (dos veces durante 10 minutos cada uno a 37 ° C) y luego en 0,1 x SSC que contiene 0,1% de SDS (tres veces durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente). Gel se secó con papel secante, se cubrió con Saran Wrap y expuesto a un casete PhosphoImager.
La mediana de los tamaños de los telómeros se estimaron a partir de la exploración densitométrica de cada carril. intensidad de señal se representó primero como una función de la distancia de migración. marcadores radiomarcados peso molecular se utilizan para producir una curva de calibración con la que para volver a calcular el tamaño para cada distancia migrada. a continuación, la intensidad de señal de los telómeros se vuelve a representarse como una función del tamaño estimado, en lugar de la distancia (por ejemplo, la figura S4). La mediana se estimó como el tamaño que corresponde a la mitad de la suma acumulada de todas las intensidades de señal.
Determinación de la telomerasa relativa Actividad Actividad de la telomerasa
se midió utilizando una modificación no radiactivo del ensayo TRAP (repetición telomérica Protocolo de amplificación), de acuerdo con Herbert
et al
. [42]. El ensayo se realizó usando el kit de detección de telomerasa TRAPeze (cat#S7700; Millipore, Billerica, MA), reemplazando el [
32P] marcado con TS oligo con un TS oligo Cy5 conjugado (5'-Cy5-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3 '; Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). El ensayo se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante, excepto que: 1) el colorante de carga no contenía cianol xileno; 2) PCR se realizó durante 33 ciclos; 3) gel se escaneó directamente sin secado. La mitad de las reacciones se separaron en un 10% de poliacrilamida /0,5 × gel TBE durante 165 minutos a 200 voltios, después de lo cual se llevó a cabo la exploración del gel utilizando un Sistema de Imager Typhoon Dinámica Molecular (Molecular Dynamics). El ensayo incorpora un patrón interno (ITAS) con la que para normalizar las señales de las diferencias en la eficiencia de la PCR. Con el programa ImageQuant (Molecular Dynamics), la actividad de la telomerasa se calculó a partir de la relación de la intensidad de los productos teloméricas más de la de los ITAS. Para comparar los niveles de actividad de la telomerasa entre las líneas celulares, las diluciones en serie (50, 100, 200, 500 células /ensayo) de cada línea se ensayaron en paralelo para la actividad de telomerasa (productos de telomerasa /relación ITAS). Trazado de actividad de la telomerasa como una función de los recuentos de células, los datos de cada línea se ajustó mediante regresión de mínimos cuadrados con una curva lineal. La pendiente de cada curva de intervalos de confianza y 95%, entonces podría utilizarse para comparar los niveles relativos de actividad de la telomerasa.
Determinación de IC
50 para GRN163L
IC
50 determinaciones eran realizaron en placas de 96 pocillos. Las células se sembraron a 5 x 10
4 /pocillo, se dejó adjunto, y después se expusieron por triplicado a una dosis variable de GRN163L (0, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 4000 nM) o oligo mismatched (0, 4,000 nM). Veinticuatro horas después, las células se lavaron tres veces con 100 l de solución salina tamponada con fosfato enfriada con hielo (PBS) y después se lisaron en 50 l de 1 x tampón CHAPS (kit TRAPeze). Lisis hecho por el balanceo en hielo durante 30 minutos, después de lo cual se congeló la placa de 96 pocillos. El día del ensayo, la placa se descongeló y las muestras se diluyeron 1:20 en una nueva placa usando frío de hielo 1 × CHAPS tampón (concentraciones finales = 50 células /l). Dos microlitros de cada muestra diluida (100 células) fueron ensayadas como se describió anteriormente usando el ensayo TRAP no radiactivo. Actividad de la telomerasa (productos de telomerasa /relación ITAS) se calculó para cada punto de datos, se expresó como un porcentaje del valor medio de las muestras no tratadas (n = 3), y luego se informó en gráfico de dispersión como una función del log [ ,,,0],GRN163L]. Con SigmaPlot versión 11.0, los puntos de datos se ajustaron posteriormente por regresión no lineal a una curva sigmoide 2-parametter (Porcentaje telomerasa = D + (100-D) /(1 + 10
((log [GRN163L] -log [IC50 ]) * 1,59)), donde D es la actividad residual mínima), de la que se estimó el valor y el intervalo de confianza del 95% del registro [IC
50].
SA-β-galactosidasa actividad
Las células se sembraron a una densidad de 10
4 células /pocillo en una placa de 24 pocillos. El día siguiente, las células fueron fijadas y sometidas a tinción histoquímica para la actividad de β-galactosidasa asociada a la senescencia humana. La fijación y la tinción se realizaron como se describe anteriormente [43]. Sin un filtro de contraste de fase, tanto en las células positivamente (azul) y negativamente (sin teñir) teñidas fueron contados bajo el microscopio. La combinación de datos procedentes de diez campos separados, el porcentaje de células azules se tabuló de un total de al menos 200 células contadas.
Curvas
Crecimiento
Las células se sembraron a una densidad de 3 x 10
5 células por placa de 150 mm. se añadieron Drugs (vehículo PBS, 1 M GRN163L, 1 M oligo no coincidentes) tan pronto como las células se convirtió en adjunto (después de 4-8 horas). Las células se cultivaron durante 7 días, durante los cuales se agregaron período drogas frescas cada 2-3 días. Después de una semana de crecimiento, las células se tripsinizaron y se contaron, y se volverán a calcular el número de duplicaciones de población realizado por cada muestra. Las células se sembraron a la misma densidad original para otra semana de crecimiento, mientras que las células restantes se dejaron de lado, ya sea para el aislamiento de ADN o para la fabricación existencias congeladas. Las células se mantuvieron en cultivo hasta la pérdida total de los cultivos tratados con GRN163L.
Análisis Western Blot
Las células adherentes se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato enfriada con hielo (PBS), se recogieron por raspado en un tampón de lisis que contiene 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), EDTA 1 mM, EGTA 1, 1% de Triton X-100, 1% de proteasa de mamífero inhibidor de cóctel, y cada uno de los siguientes inhibidores de la quinasa /fosfatasa: 1 mM Na
mM NaF 3Vo
4, 50, pirofosfato de sodio 5 mM, 10 mM de sodio 2-glicerofosfato, y 1 M microcistina. células flotantes se recogieron por centrifugación, después de lo cual se lisaron las células en el mismo tampón de lisis. Combinado flotantes y las células adherentes desde el mismo plato eran de flash congelados y almacenados a -80 ° C. Las proteínas se cuantificaron utilizando el método de Bradford (Bio-Rad). Muestras (80 a 100 g /pocillo) se separaron en geles de gradiente de 4-20% de SDS-PAGE (Bio-Rad) y se transfirió a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad). El bloqueo de los pasos y las incubaciones con los anticuerpos se realizaron en TBS-T (50 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, 0,05% de Tween-20, pH 7,6) que contenía 5% de leche seca sin grasa o 5% de albúmina de suero bovino (cuando utilizando anticuerpos primarios fosfo-específicos). Los lavados se realizaron utilizando TBS-T. Se detectaron señales utilizando el kit SuperSignal West Pico (Thermo Científicos). Los anticuerpos utilizados fueron contra H2AX (antisuero de conejo, gato#07-627) y γH2AX (fosfo-Ser139, monoclonal de ratón, clon JBW301) eran de Upstate. El anticuerpo anti-PARP1 (monoclonal de ratón, clon C-2-10) era de Calbiochem /EMD Biosciences mientras que el anticuerpo anti-actina (policlonal de cabra, sc-1616) era de Santa Cruz Biotechnology. Los anticuerpos secundarios utilizados fueron anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano picante contra ratón, conejo o IgG de cabra (Jackson ImmunoResearch).
Análisis de citometría de flujo
Las células adherentes se recogieron por tratamiento con tripsina seguido de centrifugación. células flotantes se recogieron por centrifugación. las células adherentes y flotantes combinadas se volvieron a suspender en PBS, se fijaron mediante la adición de etanol a 80%, y luego se almacenaron a -20 ° C. Veinte mil células fijadas se tiñeron con yoduro de propidio y se analizaron para el contenido de ADN siguiendo las instrucciones del fabricante, utilizando un instrumento FACS Calibur (Invitan Dickinson, Mansfield, MA, EE.UU.).
Análisis de inmunofluorescencia de los telómeros
Las células cultivadas sobre cubreobjetos se lavaron en PBS y se fijaron en metanol: acetona [1:01] a -10 ° C durante 15 minutos. Después de un lavado en PBS, las muestras se bloquearon a temperatura ambiente durante 30 minutos en PBS que contenía 10% de suero de caballo. Después de un lavado en PBS, las muestras se incubaron a 4 ° C durante la noche con el anticuerpo primario en PBS que contenía 2% de suero de caballo. Después de tres 5 minutos lavados en PBS, las muestras se incubaron a TA durante 1 hora con el anticuerpo secundario en PBS que contenía 2% de suero de caballo. Después de tres minutos 10 lavados en PBS, las muestras fueron montadas en Vectashield que contiene DAPI dura. Imágenes se visualizaron en un Zeiss 510 Meta microscopio confocal de barrido láser. Los anticuerpos primarios utilizados fueron un conejo anti-TRF2 (H-300, Santa Cruz) y los anticuerpos de ratón anti-gamma-H2AX (clon JBW301, Upstate). Los anticuerpos secundarios fueron un anticuerpo anti-conejo de burro conjugado con FITC y un anticuerpo anti-ratón de burro conjugado con Cy5, tanto de Jackson ImmunoResearch.
Detección de ALT por PCR cuantitativa
La detección de telomérica C se realizó círculos Ricos indicativos de ALT como se describe por el grupo Reddel [44]. Por triplicado, reacciones de 20 l se contenían 32 ng de ADN genómico, 0,2 mg /ml de albúmina de suero bovino, 0,1% de Tween-20, ditiotreitol 4 mM (DTT), 7,5 unidades de ADN Φ29 polimerasa (New England Biolabs, Ipswich, MA) , 1 × Φ29 tampón de ADN polimerasa y 1 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP. reacciones de la polimerasa se incubaron a 30 ° C durante 8 horas, seguido de 65 ° C durante 20 minutos. Las reacciones se transfirieron a una membrana de punto de nitrocelulosa (Bio-Rad). Después de UV-reticulación, la membrana se hibridó durante la noche a una [
32P] marcado con (TAACCC) 4 sonda
. La hibridación y lavados se realizaron como se describe en la sección de análisis de tamaño de los telómeros (véase más arriba).
Resultados
longitud del telómero y la telomerasa Actividad variar entre líneas celulares de cáncer de páncreas
Un panel de 10 líneas celulares de cáncer pancreático se caracterizó por la longitud de los telómeros y la actividad de la telomerasa relativa. El ADN genómico aislado a partir de cada línea se digirió con un cóctel de 4 cortadores de BP, se resolvieron en gel de agarosa y se sometió a
in situ
hibridación a un [
32P] marcado con (TTAGGG)
4 sonda . Señales reveló una mancha de fragmentos teloméricas, que varían en tamaño de 1 a 7 kpb (Figura 1A). El análisis densitométrico permitió la determinación de la mediana del tamaño de la señal telomérica para cada línea celular (Figura 1B). AsPC1 tenía los telómeros más cortos (mediana = 2,2 kb), mientras que CAPAN2 y Panc1 tuvieron la más larga (medianas = 3,5 y 3,7 kb, respectivamente). En algunas de las líneas, en particular, CAPAN1 y CFPAC1, la distribución de los telómeros fue bifásica. En estas líneas, una abundancia de telómeros cortos coexistía con una pequeña fracción de los telómeros más largos (& gt; 5 kb). Esperar para CAPAN2 y Panc1, todas las líneas tenían telómeros muy cortos a granel, con tamaños medianos variaron entre los 2.2 2,8 kb. A modo de comparación, los telómeros en el páncreas humanos normales están entre 9 y 15 kb de longitud, dependiendo de la edad de los donantes [45].
A) mediciones del tamaño de los telómeros. El ADN genómico se digirió con enzimas de restricción, se resolvieron por electroforesis en geles de agarosa y se detectaron mediante hibridación in situ a [
32P] - (CCCTAA)
4. B) Cuantificación del tamaño de los telómeros. Gel en A fue escaneada y la intensidad de cada carril se representó como una función del tamaño de los telómeros, tal como se describe en la sección Materiales y Métodos. La mediana de tamaño de los telómeros se estimó como el tamaño correspondiente a la mitad de la suma acumulada de las intensidades. C) Detección de la actividad de telomerasa mediante el ensayo TRAP. Los extractos celulares que contienen 300 células cada uno se analizaron utilizando un sustrato oligo TS marcado con Cy5. Después de la PCR con el mismo cebador oligo y un telomérica reaparición, productos se resolvieron por electroforesis y se detectaron con un Typhon PhosphoImager. Buffer fue sólo tampón de lisis. ITAS, Telomerasa interna Ensayo Estándar. D) La cuantificación de la actividad de la telomerasa relativa. la actividad de telomerasa relativa se calculó como la relación de la intensidad de la escala de la telomerasa sobre la intensidad de los ITAS. Cada medida es la media ± S. D. de muestras por triplicado (n = 3). Actividad de la telomerasa en cada línea se expresa como un porcentaje de la actividad de las células HeLa.
Uso de un ensayo TRAP no radiactivo (repetición telomérica Protocolo de Amplificación), se midió la actividad de la telomerasa de línea de base cuantitativamente en cada línea celular. El ensayo TRAP utiliza PCR para amplificar los productos de alargamiento de la telomerasa (escalera de la telomerasa), junto con un estándar de ensayo de telomerasa interna (ITAS). Actividad de la telomerasa se cuantifica como la relación de la intensidad de la escala de la telomerasa sobre la de los ITAS. La Figura 1C muestra un ejemplo representativo de un ensayo TRAP realizado en el panel, utilizando el mismo número de células de cada línea. Se observaron grandes diferencias en la intensidad relativa de la escalera ITAS y la telomerasa, indicativo de grandes diferencias en las actividades telomerasa de línea de base. Para obtener mediciones más precisas de la actividad de la telomerasa, las muestras diluidas en serie de cada línea se analizaron y se compararon con las células HeLa de forma simultánea. El análisis densitométrico permitió el cálculo de la actividad de la telomerasa línea de base para cada línea (Figura 1D). líneas celulares de cáncer pancreático tenían niveles de actividad de la telomerasa, que iban desde el 0,5% (CD18) al 23% (AsPC1) de la de las células HeLa. Cuatro líneas (L3.6pl, MiaPaca2, HPAF, AsPC1) eran parte de un grupo con mayores niveles de telomerasa (15,8 ± 4,8 por ciento de HeLa). Seis líneas (CD18, Panc1, Hs766T, CFPAC1, CAPAN1, CAPAN2) eran parte del grupo se presentan 10 veces menores niveles de telomerasa (1.53 ± 1.1% por ciento de HeLa). Una diferencia de 46 veces en la actividad de la telomerasa se observó entre el AsPC1 (la más alta actividad) y CD18 células (actividad más baja). No se encontró correlación entre el tamaño de los telómeros y el nivel de actividad de la telomerasa (Figura S1 A).
La telomerasa actividad inhibidora de GRN163L de páncreas líneas celulares de cáncer
A continuación, se examinaron los efectos inhibidores de telomerasa de GRN163L en cada una de las 10 líneas celulares de cáncer de páncreas. En cada línea, se midió la actividad de la telomerasa en las 24 horas después de la adición de concentraciones crecientes de GRN163L a las células (n = 3 para cada dosis). La Figura 2A muestra los resultados de este análisis en células HPAF. El análisis densitométrico de las mediciones de gel TRAP permitidos de actividad de la telomerasa relativa, lo que podría expresarse como una función de la concentración GRN163L. Estas curvas de dosis-respuesta se ajustaron por regresión no lineal para permitir el cálculo de un CI
50 para cada línea. La figura 2B muestra el intervalo de 95% de confianza para el valor de la IC
50 en cada línea. Todas las 10 líneas celulares de cáncer pancreático respondieron a GRN163L, con IC
50 que varió de 50 nM a 200 nM. La línea de menor sensibilidad era CD18 (IC
50 = 204 nM) y las más sensibles eran CFPAC1 y MiaPaca2 (IC
50 = 52 nM, ambos). No vimos ninguna correlación entre la actividad de la telomerasa línea de base y la respuesta de las líneas celulares a GRN163L, tal como se mide por sus respectivos IC
50 (Figura S1B).
A) curva dosis-respuesta de inhibición de la telomerasa por GRN163L . células HPAF se trataron por triplicado con concentraciones crecientes de GRN163L (50 nM a 4 m). Veinticuatro horas después, se midió la actividad de la telomerasa usando el ensayo TRAP. Las muestras tratadas con ningún fármaco se establecen en 100%. B) IC
50 de cada línea para la inhibición de la telomerasa por GRN163L. Las curvas de dosis-respuesta se realizaron como en el panel A. curva no lineal fitting permitió el cálculo de un CI
50 para cada línea. Los resultados se expresan como la IC
50 (barra de en medio) y su intervalo de confianza del 95% (que flanquean bares).
Efectos de la exposición crónica GRN163L sobre la proliferación celular y la vida útil
Dos líneas celulares de cáncer de páncreas fueron elegidos para estudiar los efectos de la exposición a largo plazo a GRN163L: CAPAN1 y CD18. Comparable a la mayoría de las líneas estudiadas, CAPAN1 y CD18 ambos tenían telómeros relativamente corto (2-3 kb) y actividades de telomerasa bajo nivel (0,5-1% de las células HeLa). centrifugation.
doi:10.1371/journal.pone.0085155.s005
(TIF)
Acknowledgments
GRN163L