Extracto
Aplicaciones
Aunque la resección quirúrgica es la piedra angular del tratamiento del cáncer, las recurrencias locales y distantes seguirá afectando negativamente en el resultado de una proporción significativa de pacientes. La evidencia de que una estrategia de reducción de volumen alternativa que implica la ablación por radiofrecuencia (RFA) induce inmunidad antitumoral incitó la investigación actual de la eficacia de la realización de RFA antes de la resección quirúrgica (pre-resectional RFA) en un modelo de ratón preclínica.
Diseño Experimental
eficacia y sistémicos respuestas inmunes terapéuticas fueron evaluados después del tratamiento RFA pre-reseccional de murino adenocarcinoma de colon CT26.
resultados
El tratamiento con RFA crecimiento tumoral retrasado significativamente pre-reseccional y mejorados la supervivencia global en comparación con cirugía simulada, RFA, o la resección quirúrgica sola. Los ratones en el grupo pre-RFA resectional que logra una respuesta completa demostró la inmunidad antitumoral durable a tumor re-desafío. Si no se logra un beneficio terapéutico en ratones inmunodeficientes confirmó que el control del tumor por pre-resectional RFA depende de una respuesta inmune adaptativa intacta en lugar de cambios en los parámetros físicos que hacen que los tumores de ablación más susceptibles a una escisión quirúrgica completa. RFA provoca un marcado aumento en intratumoral CD8 infiltración
+ de linfocitos T, mejorando así sustancialmente la proporción de CD8
+ células T efectoras: FoxP3
+ células T reguladoras. Es importante destacar que, pre-resectional RFA aumenta significativamente el número de específica de antígeno CD8
+ T células dentro del microambiente del tumor y de los ganglios linfáticos de drenaje de tumor pero no tuvo ningún impacto sobre la infiltración por las células de origen mieloide supresores, macrófagos M1 o los macrófagos M2 en los sitios del tumor o en los órganos linfoides periféricos (es decir, bazo). Por último, antes de la RFA de resección de tumores primarios retrasa el crecimiento de los tumores distantes a través de un mecanismo que depende del CD8 sistémica
+ T inmunidad antitumoral mediada por células.
Conclusión
Mejora de la supervivencia y antitumoral inmunidad sistémica provocada por pre-reseccional RFA apoyar el potencial de traslación de este tratamiento neoadyuvante en pacientes con cáncer con alto riesgo de recidiva local y sistémica
Visto:. Ito M, Ku AW, Bucsek MJ, Muhitch JB, Vardam -Kaur T, Kim M, et al. (2015) Inmune adyuvante Actividad de Pre-reseccional ablación por radiofrecuencia Protege contra la recurrencia local y sistémica en agresivo murino de cáncer colorrectal. PLoS ONE 10 (11): e0143370. doi: 10.1371 /journal.pone.0143370
Editor: Fabricio Mattei, Istituto Superiore di Sanità, ITALIA
Recibido: 10 Febrero, 2015; Aceptado: 4 de noviembre de 2015; Publicado: 23 Noviembre, el año 2015
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la licencia Creative Commons CC0 dominio público dedicación
Disponibilidad de datos:. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación: Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos nacionales de Salud (CA79765 y AI082039 a SS Evans; CA098156 y CA109480 en SO Gollnick, y P30CA016056 a Roswell Park Cancer Institute); y la Fundación de la Familia Linscott Tietgen Jennifer (JJ Skitzki y S. S. Evans). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la cirugía es el tratamiento de primera línea y la mejor opción curativa para pacientes con cáncer con enfermedad resecable. El objetivo de la escisión quirúrgica es la remoción completa de los tumores con márgenes libres de cáncer microscópicas. Desafortunadamente, muchos pacientes desarrollan recidiva local o sistémica a pesar de los avances en la técnica quirúrgica y la quimioterapia adyuvante o radioterapia. En la metástasis hepática colorrectal, por ejemplo, la tasa de recaída es de hasta 60% en pacientes sometidos a una resección potencialmente curativa, presumiblemente debido a la enfermedad residual microscópica o micrometástasis presente en el momento de la cirugía [1-3]. La evidencia de una alta tasa de recurrencia y la diseminación metastásica en pacientes después de la cirugía sugiere, además, que a pesar de la inmunidad antitumoral sistémica es evidente en los pacientes con cáncer avanzado, la respuesta inmune en estado estacionario es insuficiente para proporcionar un control adecuado del tumor [4]. Por aparecen los tumores son detectables que ya han desarrollado mecanismos para escapar del reconocimiento inmunológico y la eliminación [4]. Por lo tanto, las muestras de tumor resecado a menudo muestran la infiltración dispersa por CD3
+ linfocitos T CD8, incluyendo
+ células T efectoras citotóxicas, que se correlaciona con mal pronóstico en varios tipos histológicos de tumores, incluyendo el cáncer colorrectal [5-7].
In situ
técnicas de ablación térmica, como la ablación por radiofrecuencia (RFA), han surgido como opciones de tratamiento prometedoras para tumores sólidos malignos no resecables [8, 9]. RFA es aprobado por la Administración de Alimentos y Fármacos de Estados Unidos (FDA) para la ablación de tumores primarios y metastásicos, y se ha aplicado en el tratamiento de una variedad de neoplasias incluyendo el hígado, colorrectal, pulmón, próstata, riñón, mama, cerebro, tiroides, melanoma, y tumores óseos [9]. En el tratamiento de las metástasis hepáticas de cáncer colorrectal, la RFA se ha utilizado con mayor frecuencia
a través de
, laparoscópica o enfoques percutáneos guiados por imagen abierta y se puede realizar bajo anestesia general o local con mínimas complicaciones [8, 9]. RFA también se utiliza en combinación con la resección quirúrgica en pacientes con lesiones hepáticas múltiples en los que la resección completa no es factible debido a la proximidad del tumor a estructuras vitales (por ejemplo, vasos sanguíneos o conductos biliares) o parénquima insuficiente para apoyar la función de post-hepatectomía [2, 10].
La energía entregada por RFA causa agitación iónica que es convertida por la fricción en la hipertermia alta temperatura focal (≥50 ° C), induciendo de ese modo el daño celular irreparable y necrosis coagulativa [8]. Además de esta actividad antitumoral citorreductora directa, RFA se ha demostrado para provocar efectos inmunomoduladores en estudios preclínicos y clínicos [8, 11]. En contraste con la resección quirúrgica, el tejido tumoral dañado siguiente RFA permanece
in situ
y proporciona una fuente de antígenos tumorales. Estos antígenos son tomados y procesados por las células dendríticas locales (DC) y se presentan a los linfocitos T en los ganglios linfáticos de drenaje tumorales (TdLN), lo que conduce a la expansión de un CD8
+ piscina de células T efectoras específicas de tumor [8 , 12, 13]. En particular, una densa CD3
+ infiltrado de células T ha sido reportado en las zonas tumorales después de la RFA, en consonancia con antitumoral local de reactividad inmune [14, 15]. Otra prueba de la inmunidad sistémica inducida por la RFA se deriva de informes preclínicos y clínicos de efectos abscopal que involucran la regresión espontánea de las lesiones metastásicas distantes después de la ablación del tumor primario [16-20]. Sin embargo, el dependiente de células antitumoral respuesta inmune T generada por RFA en pacientes y modelos de ratón parece ser relativamente débil [11, 14, 15] y un problema importante sigue siendo la alta tasa de recurrencia local en el sitio de tratamiento, especialmente para tumores & gt ; 3 cm o cerca de las principales redes vasculares, donde de entrada de sangre límites de concentración térmica en el tejido diana a través de los efectos del disipador de calor [2, 8]
las preocupaciones sobre el recrecimiento del tumor en la zona de transición de la hipertermia subletal (≤45. ° C) que rodea la zona central necrótica han limitado el uso de la RFA principalmente a la paliación o para pacientes que no pueden tolerar la cirugía de resección. Aquí, hemos probado la hipótesis de que el resultado quirúrgico local podría mejorarse si se utilizó RFA como una estrategia inmunogénica pre-reseccional para aumentar la inmunidad antitumoral. Nos informan de que el control del tumor local y sistémica y la supervivencia global mejoraron significativamente como resultado de la inducción de un CD8
+ respuesta inmune adaptativa mediada por células T después de pre-resectional RFA en un modelo de ratón para el cáncer colorrectal.
Materiales y Métodos
ratones
hembra Balb /cy C57BL /6 ratones (8-12 semanas) fueron de Instituto Nacional del cáncer o Charles River. ratones inmunodeficientes combinados graves (CbySmn.CB17-Prkdc
SCID /SCID J /BALB /c; Jackson Laboratory) y el clon 4 de ratones transgénicos (CBy.Cg-
Thy1a
Tg (TCRA (C14, TcrbC14) 1Shrm /ShrmJ) que expresan un receptor de células α /β T específicas para la hemaglutinina de la gripe (HA;. de Linda Sherman, Scripps Research Institute, la Jolla, CA) fueron criados en el Departamento de Recursos animales de laboratorio Roswell Park los ratones se mantuvieron en de patógenos condiciones de barrera libres. Todos los cuidados y procedimientos de los animales estaban en conformidad con las políticas institucionales para la salud animal y el bienestar y aprobados por el Comité de cuidado de animales y el empleo del cáncer Roswell Park institucional (IACUC).
modelos de tumores trasplantables y CD8
+ T depleción de células
células tumorales (células de adenocarcinoma de colon CT26 y el derivado de CT26-HA transfectadas con un gen que codifica la hemaglutinina [21, 22] singénico para BALB /c o ratones SCID; B16.F10 melanoma singénico a /6 ratones C56BL) se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10% de suero de ternera fetal inactivado por calor (Life Technologies, Carlsbad, CA), 2 mM L-glutamina, 100 U /ml de penicilina, 50 mg /ml de estreptomicina, 50 mu M β-mercaptoetanol, y G418 (400 mg /ml; para CT26-HA). Se inyectaron por vía subcutánea; células tumorales (en 100 l de PBS 10
6 para CT26 o 3x10
5 de B16) en el flanco de los ratones singénicos, a menos que se indique lo contrario. Los volúmenes tumorales (que van desde 150-500 mm
3) no fueron significativamente diferentes entre los grupos asignados en el momento del tratamiento inicial. Los volúmenes tumorales se calcularon mediante la determinación de la duración del corto (
l
) y largo (
L)
diámetros (volumen = l
2 x L /2). se alcanzaron los puntos finales experimentales cuando los tumores superaron los 20 mm de diámetro o cuando los ratones se volvieron moribundos y mostraron signos de recumbancy lateral, la caquexia, la falta de respuesta a estímulos nocivos, o la pérdida de peso observable. El nodo inguinal ipsilateral fue identificado como el TdLN centinela por localización de colorante azul de Evans 1 minuto después de la inyección de colorante cerca de la s.c. sitio del tumor. Para modelar la metástasis de pulmón en estadio final, 10
se inyectaron 5 células CT26 en la vena de la cola 7 días después de la primaria, por vía subcutánea la inyección del tumor; 30 días más tarde, los nódulos CT26 fueron enumerados por investigadores cegados a la identidad de la muestra en los pulmones inflados teñidas con una solución al 15% de tinta china, y blanqueadas por la solución de Fekete. Para el agotamiento de CD8
+ células T in vivo, los ratones fueron inyectados i.p. con 400 mg de anticuerpos anti-CD8a MAB (53 a 6,72, BioXCell) cada 7 días a partir de inmediato el tratamiento posterior a la RFA. CD8
+ agotamiento de las células T se confirmó mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos anti-CD8β MAB (YTS156.7.7, Pe-Cy7) (BioLegend); & Lt; + células T 2% de CD3
eran CD8
+ después del tratamiento con anticuerpos
RFA
Los ratones fueron anestesiados con isoflurano por inhalación de gas (isoflurano al 4% para la inducción de la anestesia;. 1,5% para mantenimiento). Los ratones se colocan boca abajo en una almohadilla de puesta a tierra eléctrica de conducción, y el área del tumor estaba mojado con agua destilada antes de insertar la sonda StarBurst SDE (AngioDynamics) en el centro del tumor. Maintining una temperatura punta de la sonda de 90 ° C durante 1 minuto utilizando el generador de RFA RITA 1500 (AngioDynamics) simula el entorno clínico de la recurrencia del tumor después de la ARF, tal como se describe anteriormente por Johnson et al [23]. Sham RFA se realizó mediante la inserción de la sonda en el tumor sin corriente eléctrica. Para los grupos de control adicionales RFA se administró en la piel de la s.c. tumoral (es decir, hacia atrás, arriba). Los ratones se recuperaron en una manta de calentamiento y se les da analgésico (buprenorfina 0,05 mg /kg de peso corporal) por vía subcutánea para controlar el dolor.
resección quirúrgica
Los ratones fueron anestesiados con isoflurano por inhalación de gas y los tumores fueron extirpados con 1 mM márgenes alrededor del borde visible del tumor. Fascia fue resecado junto con el tumor (
en bloque
) en todos los casos para minimizar la recurrencia del margen de profundidad. La evaluación patológica de la interfaz de tumor /estroma en el momento de la escisión en ratones centinela reveló tumor infiltrante en las fronteras en el 40-60% de los ratones, independientemente de si se administró antes de la resectional RFA. Las incisiones se cerraron con sutura 4-0 Vicryl® (Ethicon, Inc., Somerville, NJ) y /o grapas para heridas de acero que se eliminó en 7-10 días. Como control simulado quirúrgica, los ratones se sometieron a una incisión en la piel 1 cm y el cierre en el flanco contralateral sin manipulación del sitio del tumor. En experimentos seleccionados, se realizó resección parcial, clasificado por la enfermedad residual macroscópica y microscópica detectable en la que se escindió ~ 50% de la masa tumoral. Los ratones se recuperaron en una manta de calentamiento y se les da analgésico (buprenorfina 0,05 mg /kg de peso corporal) por vía subcutánea para controlar el dolor.
La transferencia adoptiva del clon CD8 4
+ células T
esplenocitos agrupados y los ganglios linfáticos (LN) células del clon 4 de los receptores de las células T de ratones transgénicos fueron enriquecidos positivamente por clasificación celular magnética usando un kit de aislamiento de células CD8a T (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). poblaciones aisladas se componen de ~ 85-90% de L-selectina
hi CD44
bajo ingenuo CD8
+ células T de análisis de citometría de flujo como se determina. números equivalentes de clon CD8 4
+ células T (5-10 x 10
6) marcado con un seguimiento medio de contraste (TRITC 4 M; Molecular Probes) [22, 24] se inyectaron por vía intravenosa en ratones individuales 6 horas después de la RFA o tratamiento simulado. TdLN tejidos tumorales y se congelaron en compuesto óptima temperatura de corte (Sakura Finetek).
El suero de IFN-γ análisis
El suero se adquirió a partir de ratones de 1 día y 7 días post RFA o tratamiento simulado a través sangrado retro-orbital. Las muestras se almacenaron congeladas a -80 ° C hasta el ensayo por ELISA comercial para IFN-γ (R & amp; D Systems).
Para el análisis inmunohistoquímico, 9 micras secciones de criostato de serie
La inmunohistoquímica y la histología de inmunofluorescencia de TdLN o tumor se fijaron en acetona, se bloquearon con superbloque tampón de bloqueo (Pierce), y se tiñeron con anticuerpos de rata anti-ratón monoclonales específicos para CD8a (53-6,7; BD Biosciences) [22]. Los complejos inmunes se visualizaron usando los kits Vectastain Elite ABC sustrato y DAB (Vector Laboratories). Para la histología de inmunofluorescencia, 9 micras criosecciones se fijaron a -20 ° C en metanol /acetona (3: 1), y se tiñeron con anticuerpos monoclonales (anti-ratón anticuerpo PNAd, MECA-79; anti-ratón de anticuerpos CD31, MEC 13.3, BD Biosciences) y anticuerpo secundario conjugado a un fluorocromo (Jackson ImmunoResearch) como se describe [22, 24]. Las imágenes digitales de ≥ 10 campos seleccionados al azar (unidad de superficie = 0,34 mm
2 por campo) fueron capturados por los observadores cegados a identidad de la muestra utilizando un microscopio de fluorescencia Olympus BX50 en posición vertical equipado con una cámara SPOT RT (Servicios Spectra). El número de adoptivamente células transferidas ubicados dentro del parénquima de TdLN o tumores (es decir, designado por la localización de las células T marcadas con fluorescencia fuera PNAd
+ o CD31
+ vasos, respectivamente) se cuantificó con el software ImageJ como se describe [ ,,,0],21, 24, 25].
La citometría de flujo
tumores CT26 de 1,100-1,700 mm
3 fueron utilizados para el tratamiento de la RFA con el fin de tener suficiente tejido tumoral residual para analizar por citometría de flujo . Tumores o bazos se desagregan (Medimachine, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) y el análisis fenotípico se realizó mediante citometría de flujo multiparamétrica después de la tinción con anticuerpos monoclonales anti-CD8a (53-6,7, Pe-Cy7), anti-CD4 (RM4- 5, PerCP o V450), anti-CD25 (PC61, APC), anti-L-selectina (Mel-14, APC o PE), anti-CD44 (IM7, FITC), anti-CD3 (17A2, FITC), anti -CD11b (M1 /70, Pe-Cy7), anti-Gr-1 (RB6-8C5, APC), anti-F4 /80 (T45-2342, PE), anti-MHC II (2G9, FITC), anti- CD45 (30-F11, BUV395) (BD Biosciences); anti-FoxP3 (fjk-16, PE) (eBioscience); anti-CD8β (YTS156.7.7, Pe-Cy7), y anti-CD206 (C068C2, BV421) (BioLegend). análisis de citometría de flujo se realizó utilizando un LSR II o LSRFortessa con el software FACSDiva (BD Biosciences) y programa de procesamiento de WinList (Verity Software House).
El análisis estadístico
La significación estadística del crecimiento del tumor se determinó por 2-way ANOVA para medidas repetidas. La supervivencia se analizó con el método de Kaplan-Meier y los grupos se compararon mediante la prueba de log-rank o por la prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon. Se evaluaron todas las demás diferencias entre los grupos de 2 colas de Student no pareada
t-test
. Los datos se presentan como media ± SEM y
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
Pre-reseccional RFA mejora el control local del tumor y la supervivencia
para determinar si el tratamiento RFA antes de la resección quirúrgica podría disminuir la recurrencia local y mejorar la supervivencia, se utilizó un modelo de ratón para el adenocarcinoma de colon CT26 para simular el entorno clínico donde RFA proporciona un control inicial del tumor, pero a menudo es seguido por la recurrencia local. En estudios piloto se optimizó el tamaño del tumor en el momento de la ablación junto con la temperatura y la duración de RFA. Para estos estudios s.c. tumores CT26 de tamaño aproximadamente equivalente (~ 150-500 mm
3 en volumen) fueron tratados con RFA (1 minuto de la ablación a 90 ° C) en el día 10 después de la implantación. La resección de la misma lesión se realizó en día 17, como se indica en el esquema mostrado en la figura 1A y 1B. Nos elegido para utilizar este intervalo de 7 días entre la RFA y la cirugía para que haya tiempo suficiente para que una respuesta inmune antitumoral primaria que se genere después de la ablación [11, 13, 26]. Los ratones control tuvieron una resección o RFA sólo en el día 10, seguida de cirugía simulada (fuera de la región del tumor) en el día 17, o cirugías simuladas tanto en los días 10 y 17 (figura 1A).
(A) Tiempo de horario de esbozar la diferentes tratamientos utilizados. Ratones BALB /c (10 a 12 ratones /grupo) se inyectaron s.c. con 10
6 células CT26 en el flanco izquierdo en el día 0. Los tratamientos se llevaron a cabo 10 días después de la inoculación del tumor. Los tumores primarios fueron tratados como se indica con cirugía simulada, la resección (Rxn) o RFA en día 10 o 17. (B) muestra esquemática la secuencia de administración de RFA (90 ° C durante 1 minuto) 7 días antes de la resección quirúrgica. curvas de crecimiento del tumor (C) y las curvas de supervivencia (D) de los ratones portadores de tumores CT26 en diferentes grupos de tratamiento. En (C), el número de supervivientes a largo plazo sin recurrencia del tumor en 150 días se indica para cada grupo experimental; para (D) *
P Hotel & lt; 0.001 para el grupo RFA pre-resectional en comparación con todos los demás grupos. los ratones (E) Sobrevivir (n = 9) en el grupo pre-reseccional RFA fueron reexponerse 10
6 se representan células CT26 en el flanco contralateral (derecho) en el día 150. Las curvas de crecimiento tumoral en la que
T
= 0 corresponde al momento de la inyección de tumores secundarios. Como control, el crecimiento tumoral se controló después de la inoculación de la misma dosis de células tumorales en la no-tumor (NT) -experienced ratones ingenuos BALB /c (n = 10); *
P Hotel & lt; 0,005 como se determinó por análisis de Kaplan-Meier. Se muestra un experimento representativo de ≥ tres experimentos independientes.
El uso de este plan experimental, se encontró que el tratamiento de CT26 con RFA solo resultó en un 60-80% de necrosis de las lesiones tumorales individuales seguidos de ≥ 75% del tumor recurrencia si se le dio ningún tratamiento adicional (figura 1C). Del mismo modo, la extirpación quirúrgica sola se asoció con una tasa de recidiva local ≥ 75%. En contraste, la combinación de RFA seguida por resección marcadamente retrasado excrecencia tumoral en comparación con los grupos de tratamiento individuales o grupos de control escisión simulado (Fig 1C). En particular, la recurrencia del tumor no se detectó por más de 150 días en ~ 80% (9 de 11 ratones) de los ratones tratados con la combinación de RFA y la cirugía posterior. RFA seguida de resección posterior demostró una supervivencia significativamente mejorada en comparación con todos los demás grupos en este modelo tumoral letal CT26 (Figura 1D). En este sentido, la RFA, seguida de resección resultó en ~ 80% de supervivencia libre de recidiva local, en comparación con el ~ 20% de supervivencia tras el tratamiento, ya sea con un solo RFA o la resección quirúrgica sola.
Los experimentos adicionales excluyen la posibilidad de que el beneficio terapéutico observado combinado de la RFA y la resección podría atribuirse a
(1)
diferencias en el tiempo total del anfitrión fue expuesto a los antígenos tumorales en los diferentes grupos de tratamiento (es decir, 10 días para la resección seguida por el grupo de cirugía simulada frente a 17 días para el grupo de resección) RFA +,
(2)
cirugía más eficaz debido a la citorreducción tumoral inicial durante la pre-reseccional RFA, o
(3)
la inflamación provocada por la inserción de la sonda (S1 a la figura). Para estos experimentos, se observó ninguna mejora en la demora o la supervivencia crecimiento del tumor CT26 si inicial tumor-reducción de volumen se logró el día 10 por la resección parcial (es decir, 50% de reducción de la masa tumoral), seguido de la resección excisional en día 17 o después de RFA simulado en que se insertó la sonda de ablación en tumores sin corriente eléctrica (S1 B y S1C figura). Estudios adicionales en el melanoma B16 en ratones singénicos C57BL /6 (S2A-S2C figura) estableció que la RFA en la configuración antes de la cirugía neoadyuvante tiene un beneficio terapéutico similar a la observada para los tumores de colon CT26. Por lo tanto, las actividades de protección de pre-resectional RFA no están restringidos a un tipo histológico del tumor particular.
Una característica distintiva de la inmunidad adaptativa es el desarrollo de la memoria inmunológica se define por la capacidad de la exposición anterior a los antígenos tumorales para desencadenar una recordar la respuesta a la reexposición. Por lo tanto, se investigó si los ratones supervivientes RFA y la resección de tumores CT26 después combinada desarrollaron reactividad antitumoral por rechallenging supervivientes a largo plazo (es decir, 150 días de implantación del tumor post-primaria) por vía subcutánea con tumor CT26 en el flanco contralateral. Emparejados por edad, sin tratar no tumoral (NT) -experienced ratones no tratados fueron utilizados como controles. Como se muestra en la figura 1E, se observó un retraso significativo en la excrecencia de tumor CT26 en ratones puestos a prueba nuevamente que habían sido tratados previamente con RFA seguido de la escisión quirúrgica. En conjunto, estos datos son coherentes con el desarrollo de una respuesta inmune adaptativa después de pre-resectional RFA que reduce la recurrencia local y mejora la supervivencia mediante la promoción de la inmunidad de larga duración, sistémica.
Survival beneficio de pre-resectional RFA depende en la inmunidad adaptativa
para investigar si la activación formalmente RFA de una respuesta inmunitaria adaptativa específica del tumor antes de la escisión quirúrgica es causal para limitar el crecimiento del tumor se examinaron los efectos de este régimen terapéutico combinado en la progresión del tumor CT26 de inmunodeficiencia combinada severa (SCID) los ratones que carecen de células funcionales T y células B (Fig 2A). La supervivencia se usa como el criterio principal de valoración para la determinación de la eficacia ya que el análisis del volumen del tumor primario no era informativo en ratones inmunodeficientes que frecuentemente sucumbió a la enfermedad diseminada (es decir, en el peritoneo), con independencia del tamaño del tumor primario o el tipo de terapia. En agudo contraste con el beneficio de supervivencia observado en ratones inmunocompetentes (Figura 1D), pero no hemos podido detectar ninguna ventaja en la supervivencia en ratones SCID tratados con RFA combinado y la resección en comparación con cualquiera de los tratamientos por sí solo (figura 2B). Esta dependencia de la respuesta inmune adaptativa proporciona evidencia adicional de que el beneficio de pre-reseccional RFA no puede explicarse únicamente sobre la base de los efectos citorreductora de ablación térmica.
(a) El calendario que describen los grupos de tratamiento. ratones SCID (5 ratones /grupo) fueron implantados s.c. con 10
6 células CT26 en el flanco izquierdo en el día 0. Los grupos de tratamiento incuded cirugía simulada, la resección (Rxn), o RFA en los días 10 o 17. curvas (B) de supervivencia son representativos de dos experimentos independientes; ns: no significativo según lo determinado por análisis de Kaplan-Meier.
Pre-reseccional RFA aumenta circula Th1 /CD8
+ T citoquinas dirigida por células y la proporción de células CD8
+ células T a las células T reguladoras en el microambiente tumoral
para conocer el papel de la respuesta inmune en la mediación de la actividad antitumoral de pre-resectional RFA se evaluó los niveles de citoquinas inmunes después de la administración de RFA en los tumores CT26 en circulación. Se encontró una tendencia hacia un aumento de las concentraciones de la prototípica Th1 /CD8
+ T dirigida por células de citoquinas IFN-γ en circulación tan pronto como 1 día después de la RFA, en comparación con los ratones tratados con placebo y aún más fuerte inducción de IFN-γ era evidente 7 días después del tratamiento RFA (figura 3A). Estos datos están en línea con las contribuciones de Th1 /CD8
+ T citoquinas dirigida por células en la generación de una respuesta inmune antitumoral sistémica.
(A) IFN-γ perfil en el suero de los ratones portadores de tumores CT26 en 1 y 7 días de tratamiento posterior a la RFA. *
P Hotel & lt; 0,02, farsa contra la RFA. (B) microfotografías representativas de inmunotinción endógena CD8
+ células T CD8 y cuantificación de
+ infiltración de células T en las secciones de tejido tumoral de 7 días después de la cirugía simulada o RFA. Barra de escala, 100 micras. (C)
Panel izquierdo
, la cuantificación de la infiltración de leucocitos en tumores 7 días después del tratamiento por citometría de flujo; Las células T reguladoras CD8
+ células T (CD3
+ CD8
+), CD4
+ células T (CD3
+ CD4
+), (CD3
+ CD4
+ Foxp3
+ CD25
+ T
reg), células supresoras de origen mieloide (CD11b
+ Gr-1
+ F4 /80
-); M1 (CD11b
+ Gr-1
-F4 /80
+ CD206
loMHCII
hi) y M2 (CD11b
+ Gr-1
-F4 /80
+ CD206
hiMHCII
LO) macrófagos. Los datos corresponden a 10
3 células totales en muestras de tumores.
Panel derecho
, proporción de CD8
+ células T efectoras (T
eff, L-selectina
baja CD44
hi): T
reg en los tumores determinado por el flujo citometría. (D)
Panel izquierdo
, la cuantificación de leucocitos totales en el bazo de ratones portadores de tumores a los 7 días después del tratamiento RFA por citometría de flujo.
Panel derecho
, proporción de CD8
+ células T efectoras (T
eff, L-selectina
baja CD44
hi): T
reg en el bazo. Datos (B-D) son representativos de ≥ 2 experimentos independientes (
n
= 3-5 ratones por grupo); los volúmenes tumorales variaron de 1,100-1,700 mm
3) en el momento del tratamiento RFA. *
P Hotel & lt; 0,05, frente farsa RFA; ns: no significativo.
Estos hallazgos, junto con la evidencia de control tumoral a largo plazo después de la cirugía combinada RFA y, nos llevó a formular la hipótesis de que el control local del tumor mejorada podría implicar cambios en la proporción de intratumoral subconjuntos de células T que no ha sido previamente investigados siguiente RFA. Los estudios preclínicos en conejos han reportaron un aumento en la infiltración intratumoral por CD3 + células T
en las lesiones tratadas después de la ARF aunque CD4 específica
+ o CD8
subconjuntos de células T + no se examinó [14, 27]. Estudios clínicos han demostrado, además, un aumento en la circulación de CD4 específica de tumor
+ y CD8 células
+ T en pacientes con carcinoma hepatocelular (HCC) a 4 semanas de tratamiento post-RFA [15]. Por el contrario, la RFA según los informes, provoca una disminución en la circulación de CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ células T reguladoras inmunosupresores (T
reg) 30 días post tratamiento en pacientes con cáncer de pulmón que es digno de mención ya que T
reg contrarrestar la función de agentes citotóxicos CD8
+ células T efectoras [6, 28]. Por otra parte, los altos niveles circulantes de células inmunes supresoras como T
reg o células supresoras de origen mieloide (MDSC) han sido recientemente demostrado ser pronóstico de recurrencia del tumor después de la RFA en cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) pacientes y HCC pacientes [29, 30]. Sin embargo, las implicaciones de estos resultados han seguido siendo poco clara ya que las fluctuaciones en la circulación de las células inmunes no son necesariamente un reflejo de su nivel de localización intratumoral después de la ARF.
Para determinar si pre-reseccional RFA afectada por la infiltración intratumoral subconjuntos específicos de células inmunes en el momento de la escisión quirúrgica, cuantificamos CD8 células
+ T 7 días después de la ablación en tumores CT26 resecados, así como en el bazo como un ejemplo de un órgano linfoide periférico que es un sitio de activación inmune. El análisis inmunohistoquímico mostró infiltración intratumoral línea de base mínima por parte endógena CD8
+ células T en ratones tratados con placebo (Figura 3B), de acuerdo con informes de nuestro grupo y otros que los tumores CT26 no son permisivas a la acumulación de células T intensiva [21, 22 , 31]. Sin embargo, se detectó un marcado aumento en CD8
infiltración de células intratumoral + T después del tratamiento RFA cuando se compara con controles simulados (Fig 3B). Análisis de citometría de flujo reveló además que la infiltración de células CD8
+ células T con respecto a la población total de células intratumoral fue mejorada significativamente 7 días después de la ARF, mientras que la densidad relativa del total de CD4
+ células T o CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ T
reg subconjunto se mantuvo sin cambios (figura 3C)
Se examinó el impacto de la RFA en CD8
+ T cell:. T
reg relaciones dentro tumores ya que esto es según se informa un fuerte indicador de pronóstico de un resultado favorable en el cáncer colorrectal metastásico [32]. RFA se encontró para aumentar la proporción global de CD8
+ efector (L-selectina
baja CD44
hi) de células T: T
reg dentro de la RFA tratado tumores (figura 3C). Un aumento significativo en la CD8
+ de células T: relación de Treg también se observó en el bazo 7 días después de la RFA (Fig 3D); sin embargo, esta relación más favorable fue consecuencia de una disminución general en la proporción de T
reg dentro del compartimento esplénico en lugar de un aumento de CD8 + células T
como se observó en el microambiente tumoral (Fig 3C). Disminución de la T
reg en el bazo podría reflejar potencialmente la carga tumoral reducida que resulta de la terapia de ablación. La densidad relativa de células mieloides que expresan marcadores fenotípicos de CD11b
+ Gr1
+ MDSC, CD11b
+ Gr-1
-F4 /80
+ CD206
loMHCII
hi macrófagos M1, o CD11b
+ Gr-1
-F4 /80
+ CD206
hiMHCII
lo M2 macrófagos subconjuntos se mantuvo sin cambios por el tratamiento de la RFA, ya sea dentro de los tumores o el bazo. (Fig 3C y 3D). En conjunto, estos resultados sugieren que la RFA-induce cambios en la contextura inmune favoreciendo Th1 /CD8
+ activación de las células T dentro de los órganos linfoides y microambiente tumoral periférica contribuyen a un mejor control de tumor local y sistémica después de la resección quirúrgica.
expansión dependiente de antígeno de CD8
+ células T se produce en los ganglios linfáticos de drenaje del tumor y el microambiente tumoral después de pre-resectional RFA
razonó que el aumento de CD8
+ células T efectoras detectado en tumores después de RFA podría resultar de la generación de una respuesta inmune adaptativa específica de antígeno, como se informó anteriormente [11, 14, 15], o, alternativamente, de un aumento en la localización no antígeno restringido debido a la inflamación aguda que se produce después de la muerte de las células catastrófica causada por la ablación térmica. Para distinguir entre estas posibilidades, los ratones fueron implantados s.c. con murino adenocarcinoma de colon CT26 ingeniería genética para expresar un antígeno asociado a tumor sustituta, la hemaglutinina (CT26-HA), lo que nos permite controlar el tumor-antígeno (HA) específicos de CD8
+ respuesta de células T. Un segundo grupo de ratones se le implantó la línea tumoral CT26 parentales carecen de antígeno HA. *
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