Extracto
La quimioterapia y /o radioterapia son ampliamente utilizados como tratamientos para el cáncer, pero los efectos antitumorales que producen se pueden mejorar cuando se combina con inmunoterapias. La quimioterapia mata las células tumorales, pero también libera antígeno tumoral y permite la presentación cruzada del antígeno tumoral para provocar respuestas inmunes mediadas por células específicas de antígeno. La promoción de respuestas inmunes de células auxiliares T CD4 + se pueden usar para mejorar la presentación cruzada del antígeno del tumor después de la quimioterapia. La bandeja de HLA-DR de unión al epítopo (péptido PADRE) es capaz de generar células T CD4 + específicas de antígeno que se unen varias moléculas MHC de clase II con alta afinidad y ha sido ampliamente utilizados en conjunción con vacunas para mejorar su potencia mediante el aumento de las respuestas de células T CD4 + . A continuación, se investigó si la inyección intratumoral de PADRE y el adyuvante CpG en HPV16 E7 que expresan TC-1 tumores después de la quimioterapia con cisplatino podría dar lugar a efectos antitumorales potentes y las respuestas inmunes mediadas por células específicas de antígeno. Hemos observado que el tratamiento con los tres agentes produjo los efectos antitumorales más potentes en comparación con las combinaciones de pares. Además, el tratamiento con cisplatino, CpG y PADRE fue capaz de controlar tumores en un lugar distante, lo que indica que nuestro enfoque es capaz de inducir la presentación cruzada del antígeno tumoral. El tratamiento con cisplatino, CpG y PADRE también mejoró la generación de células T CD4 +-padre específico y las células T CD8 + específicas de E7 y disminuyó el número de MDSCs en loci tumor. El régimen de tratamiento que aquí se presenta representa un enfoque universal a la lucha contra el cáncer
Visto:. Canción L, Yang MC, Knoff J, Wu TC, Hung CF (2014) Inmunoterapia contra el cáncer El empleo de una estrategia innovadora para mejorar la célula T CD4 + Ayuda en el microambiente tumoral. PLoS ONE 9 (12): e115711. doi: 10.1371 /journal.pone.0115711
Editor: Thorbald Van Hall, Universidad de Leiden, Países Bajos
Recibido: 19 Marzo, 2014; Aceptado: 27 Noviembre 2014; Publicado: December 22, 2014
Derechos de Autor © 2014 Song et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de /Instituto Nacional del Cáncer Cervical Cancer Salud SPORE P50CA098252 y 2R01CA114425-06 subvenciones. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La quimioterapia y /o radioterapia son ampliamente utilizados como tratamientos contra el cáncer. Tanto la quimioterapia y la radioterapia se ha demostrado que transformar el microambiente tumoral en un entorno adecuado para la vacunación inmunoterapéutica posterior [1], [2]. Hemos utilizado anteriormente quimioterapia con cisplatino para cebar el microambiente tumoral para la vacunación con una proteína recombinante, y se encontró que este régimen de tratamiento indujo efectos antitumorales potentes y las respuestas inmunes mediadas por células específicas de antígeno [1]. No sólo las células tumorales cisplatino matar, sino también los estrenos de los antígenos del tumor y permite la presentación cruzada del antígeno tumoral para provocar respuestas inmunes mediadas por células específicas de antígeno. Sin embargo, los efectos antitumorales producidos por la quimioterapia se pueden mejorar cuando se combina con inmunoterapias.
Una estrategia para mejorar la adhesión a la presentación del antígeno tumoral después de la quimioterapia es la promoción de células T CD4 + helper respuestas inmunes. Un agente capaz de generar células T CD4 + específicas de antígeno que se unen varias moléculas MHC de clase II con alta afinidad es el pan epítopo (péptido PADRE) de unión a HLA-DR [3]. El péptido PADRE ha sido ampliamente utilizado en conjunción con vacunas para mejorar su potencia mediante el aumento de las respuestas de células T CD4 + [4] - [7]. Por lo tanto, la administración intratumoral de PADRE potencialmente puede crear células T cooperadoras CD4 + PADRE-específicos para mejorar aún más la presentación cruzada para generar células T CD8 + específicas de antígeno tumorales. El empleo de un adyuvante inmunoestimulante con péptido PADRE se puede mejorar aún más las células T CD8 + específicas de antígeno tumorales.
El Toll-like receptor 9 (TLR9) agonista CpG es un adyuvante de uso común que se ha demostrado que estimula T CD8 + células transversal cebado mediante la promoción de la producción de interferón de tipo I [8], [9]. CpG también se ha demostrado que tiene efectos antitumorales cuando se inyecta directamente en el tumor [10] - [12]. Además, CpG se ha demostrado que bloquear la actividad inmunosupresora de MDSCs en ratones portadores de tumores [13]. Estos estudios sugieren que la función inmunoestimulante de CpG se puede utilizar para mejorar la presentación cruzada de antígenos tumorales para generar T CD8 + respuestas inmunes mediadas por células específicas de antígeno tumorales.
En el presente estudio, la hipótesis de que el cisplatino seguido por el tratamiento adyuvante CpG y administración péptido PADRE mejoraría la presentación cruzada de antígenos tumorales, resultando en efectos antitumorales potentes. Para probar esto, hemos utilizado ratones portadores de HPV16 E7 que expresan TC-1 tumores y los trató con varias combinaciones de cisplatino seguido de la inyección intratumoral con CpG y el péptido PADRE. Se encontró que el tratamiento con los tres agentes produjo los efectos antitumorales más potentes. Además, el tratamiento con cisplatino, CpG y PADRE fue capaz de controlar tumores en un lugar distante, lo que indica que nuestro enfoque fue capaz de inducir la presentación cruzada del antígeno tumoral. Se encontró que el tratamiento con cisplatino, CpG y PADRE mejorado la generación de células T CD4 +-padre específico, así como las células T CD8 + específica de E7. El tratamiento con cisplatino, CpG y PADRE también disminuyó el número de MDSCs en loci tumor, un proceso encontrado estar mediada por la vía de la apoptosis Fas-FasL. El régimen de tratamiento que aquí se presenta es una aplicación novedosa de una combinación de inmunoterapias que induce potentes respuestas inmunes antitumorales sin requerir conocimiento de los antígenos tumorales inmunodominantes, haciendo que el enfoque potencialmente ampliamente aplicable.
Materiales y Métodos
Declaración de ética
Todos los procedimientos con animales utilizados en este estudio se realizaron de acuerdo a los protocolos aprobados para este estudio específico y de acuerdo con las recomendaciones para el buen uso y cuidado de los animales de laboratorio por la Universidad Johns Hopkins cuidado de animales y el empleo Comisión. Se establecieron todas las líneas celulares y se mantienen con los protocolos aprobados. Los ratones se sacrificaron para el propósito de este estudio utilizando CO
2 de acuerdo con el protocolo de animal. En cuanto a las normas de punto final humanos, ratones que muestran la angustia severa o que tienen tumores que excedían de 20 mm de diámetro fueron sacrificados con el CO
2 de acuerdo con el protocolo de los animales.
Los animales experimentales
de seis a ocho -Semana de edad C57BL /6 ratones se obtuvieron del Instituto del cáncer-Frederick Animal Área Nacional de Producción (Frederick, MD). Los animales fueron alojados en las instalaciones de animales de oncología del Hospital Johns Hopkins (Baltimore, MD).
Las células
El modelo de tumor TC-1 se produjo en nuestro laboratorio mediante la transformación de las células epiteliales del pulmón primaria a partir de ratones C57BL /6 con Ras activo junto con los oncogenes E6 y E7 de HPV16 y la producción y mantenimiento, mediante los protocolos aprobados de esta línea celular se ha descrito anteriormente [14]. Las células fueron cultivadas en medio RPMI-1640 que contenía 10% de FBS, 2 mM L-glutamina, 10% de piruvato de sodio, ácido amino 10% no esencial, y 100 pg /ml de estreptomicina en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 /95% de aire a 37 ° C. células T CD8 + específicas de E7 se generaron a partir de esplenocitos de ratones vacunados E7 y se estimularon con células irradiadas TC-1 y 10 IU de interleucina-2 (IL-2) cada semana. células T CD4 + PADRE-específicas se generaron a partir ratones C57BL /6 inmunizados con pcDNA3-II-PADRE por pistola de genes. Las células fueron estimuladas con DC pulsadas con péptido PADRE irradiados e IL-2 (10 UI) por semana [15].
Péptidos, anticuerpos y reactivos
El péptido PADRE (epítopo reactivo Pan HLA-DR , AKFVAAWTLKAAA), y H2-D
b-restringido HPV16 E7aa49-57 péptido (RAHYNIVTF) se sintetizaron por Beckman Coulter en una pureza de 90%.
FITC, PE y APC-anti-ratón conjugado CD8a (clon 53.6.7), FITC-conjugado anti -mouse IFN-γ (XMG1.2 clon), FITC y PE conjugado anti-ratón CD4 (clon RM4-5), APC-anti-ratón conjugado CD11b (clon M1 /70), PE conjugado anti-ratón Ly6G (clon 1A8), PE conjugado anti-ratón de CD154 (CD40L, clon MR1), Functional anti-ratón CD95 (Fas, clon Jo2) anticuerpos agonistas, y FITC Anexina V Detección de apoptosis Kit, se compraron de BD Pharmingen (San Diego, CA). CD178 conjugado con PE (Fas-L, clonar MFL3), conjugado con PE anti-ratón CD95 (Fas, clon 15A7), conjugado con FITC anti-ratón CD40 (cloneHM40-3), funcional anti-ratón CD40 agonista (1C10 clon) y los anticuerpos anti-ratón de CD154 (CD40L, clon MR1) se adquirieron de eBioscience (San Diego, CA). Conjugado con PE, péptido HPV16 E7aa49-57 y RAHYNIVTF cargados H2-D
b tetrámeros se obtuvieron del Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas Fondo tetrámero (Atlanta, GA). Fas /Fas L antagonista Kp7-6 se adquirió de Merck Chemicals (San Diego, CA).
In vivo
experimentos sobre tratamiento de tumores y el agotamiento de anticuerpos
Los experimentos de tratamiento de tumores se realizaron dos veces de forma independiente. En el día 0, 1 × 10
5 TC-1 células tumorales se inocularon subcutáneamente en ratones C57BL /6 (5 por grupo). Cuatro días después, los ratones portadores de tumores se trataron con cisplatino (5 mg /kg de peso corporal) o control de PBS por vía intraperitoneal. En el día 5, los ratones se inmunizaron por vía intratumoral bien con control PBS, péptido PADRE 20 mg, 10 mg CpG, o la combinación de los dos últimos. Todos los tratamientos se repitieron 3 veces más a intervalos de 7 días. El crecimiento tumoral se controló mediante inspección visual, la palpación, y calibradores digitales (Scienceware) dos veces a la semana. Los ratones se sacrificaron cuando el diámetro del tumor alcanzó 20 mm
.
Para la evaluación antitumoral sistémica, los ratones (5 por grupo) fueron desafiados por vía subcutánea con 1 x 10
5 TC-1 en las células tumorales en el flanco derecho . Cinco días más tarde, 3 × 10
4 TC-1 células tumorales se inocularon por vía subcutánea en el flanco izquierdo. los ratones portadores del tumor fueron tratados con PBS de control o se sometieron a la terapia triple (cisplatino 5 mg /kg IP en combinación con 20 g de péptido PADRE y 10 g CpG mediante inyección intratumoral) tres veces a intervalos de 5 días. En el grupo de la depleción de células T CD8 +, 100 mg de anticuerpo anti-ratón CD8 (clon 2.43) fue entregado a los ratones mediante inyección intraperitoneal en los días 3, 4, 5 después de la exposición tumoral. Posteriormente, 150 anticuerpo anti-ratón CD8 mg /ratón fue entregado por semana para mantener más de un 90% la reducción de células T CD8 +.
Preparación de suspensiones de una sola célula de TC-1 tumor subcutáneo
los tejidos tumorales se diseccionaron suavemente de los ratones. Los tumores sólidos fueron luego picado en 1 a trozos de 2 mm y se incubaron con RPMI 1640 que contiene 0,05 mg medio colagenasa libre de suero /ml I, 0,05 mg /ml de colagenasa IV, 0,025 mg /ml de hialuronidasa IV, 0,25 mg /ml de DNasa I (ambos de Roche, Indianapolis, IN), 100 U /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina y se incubaron a 37 ° C durante 60 minutos como se describe anteriormente [16].
tinción de la superficie celular, citoquinas intracelulares tinción y citometría de flujo análisis
Para la tinción de tetrámero, una sola célula suspendida esplenocitos o linfocitos infiltrantes de tumor se tiñeron con purificada anti-ratón CD16 /32 (bloque Fc, BD Pharmingen, San Diego, CA) primero, y luego con anti-ratón CD8-FITC, PE conjugado con HPV16 E7 aa49-57 (RAHYNIVTF) cargado con péptido H2-D
b tetrámero a 4 ° C. Las células se tiñeron con 7-AAD antes de la citometría de flujo análisis para excluir las células muertas.
Para detectar HPV16 respuestas de células T CD8 + específica de E7 y células PADRE-T CD4 + específicas por tinción intracelular de IFN-γ, PBMCs, esplenocitos en suspensión de una sola célula o linfocitos infiltrantes de tumor fueron estimuladas ya sea con HPV16 E7aa49-57 o péptido PADRE (1 mg /ml) en presencia de Golgiplug (BD Pharmingen, San Diego, CA) a 37 ° C durante la noche. A continuación, las células estimuladas se lavaron una vez con tampón de FACScan y se tiñeron con la rata monoclonal conjugado con PE anti-ratón CD8a o anti-CD4 de ratón. Las células fueron sometidas a tinción intracelular de citoquinas mediante el kit Cytofix /Cytoperm de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BD Pharmingen, San Diego, CA). Intracelular de IFN-γ se tiñó con la rata conjugado con FITC anti-ratón de IFN-γ. La citometría de flujo análisis se realizó utilizando FACSalibur con el software CELLQuest. Todos los análisis se realizaron con el software FlowJo (estrella del árbol).
El aislamiento de las células supresoras de origen mieloide en ratones y supresión de la proliferación de células T
CD11b + Ly6G
MDSCs Hola eran portadores de tumores aislados a partir de suspensiones de esplenocitos de células individuales de la CT-1 C57BL /6 ratones portadores de tumor utilizando kits de aislamiento de CD11b + Ly6G y columnas LS para la separación magnética de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec). La pureza no era inferior al 95%.
in vitro
MDSC apoptosis evaluación
MDSCs purificadas se incubaron a 37 ° C o co-cultivadas con T-CD4 + específicas PADRE las células en una relación de 1:01 hasta por 24 horas en placas de 96 pocillos. Las células fueron teñidas con APC anti-ratón CD11b, PE anti-ratón Ly6G, los anticuerpos FITC anti-ratón de Anexina V y 7 AAD-(kit de detección de FITC Anexina V Apoptosis, BD Pharmingen, San Diego, CA) y se examinaron por citometría de flujo. MDSCs fueron cerrada primero en CD11b + y Ly6G
Hi, y entonces la frecuencia de la apoptosis se midió por Anexina V + y 7-AAD.
Para evaluar anticuerpo inducido apoptosis MDSC, aislado MDSC se cultivaron durante 12 horas con anti-Fas anticuerpo agonista (2 mg /ml, BD Pharmingen, clon Jo2, San Diego, CA), o mAb de isotipo. Para el bloqueo de ensayo in vitro, MDSCs aislados co-cultivadas con células T específicas CD4 + PADRE- a 01:01 ración, después se incubaron con mAb isotipo, o Fas-Fas L antagonista (Kp7-6, Calbiochem) durante 24 horas.
el análisis estadístico
Todos los datos presentados en este estudio se expresan como media ± sE donde se indica. Las comparaciones entre los puntos de datos individuales para la tinción intracelular de citoquinas con citometría de flujo análisis y el tratamiento de tumores se hicieron usando la prueba t de Student de dos colas por Graph Prism 6.0. En los experimentos de tratamiento del tumor, el principal resultado de interés fue la duración hasta que se sacrificaron los ratones. Las distribuciones de tiempo de eventos para diferentes ratones se compararon mediante el método de Kaplan-Meier y la prueba de log-rank por Graph Prism 6.0. Todos los valores de p inferior a 0,05 se consideraron significativos.
Resultados
Tratamiento de la CT-1 portadores de tumores de ratones con cisplatino, CpG y péptido PADRE genera potentes efectos antitumorales
TC-1 ratones portadores de tumores se usaron para examinar los efectos antitumorales de diferentes tratamientos que combinan quimioterapia con cisplatino intraperitoneal, inyección intratumoral de péptido PADRE y /o la inyección intratumoral de CpG. C57BL /6 ratones fueron desafiados con 1 × 10
5 TC-1 en las células tumorales en el día 0, y se dividieron en cinco grupos de tratamiento. Los ratones del grupo 1 no fueron tratados, los del grupo 2 fueron tratados con cisplatino seguido por intratumoral CpG, los del grupo 3 fueron tratados con cisplatino seguido de péptido PADRE intratumoral, los del grupo 4 fueron tratados con intratumoral CpG y PADRE, y los del grupo 5 fueron tratados con cisplatino seguido por intratumoral CpG y PADRE (Fig. 1A). Como se muestra en la Fig. 1B, el tratamiento con cisplatino seguido de CpG intratumoral y PADRE volumen del tumor reducido significativamente en comparación con el control y el tratamiento con CpG y PADRE solamente. Además, el tratamiento con cisplatino seguido por CpG intratumoral y PADRE mejorado significativamente la supervivencia en comparación con todos los otros grupos de tratamiento (Fig. 1C). Estos datos sugieren que la combinación de cisplatino, CpG y PADRE tiene efectos antitumorales significativos contra los tumores TC-1.
C57BL /6 ratones (5 ratones /grupo) se expusieron por vía subcutánea con células tumorales TC-1 y se trataron con diversas combinaciones de cisplatino, CpG y el péptido PADRE. A. Diagrama esquemático de los regímenes de tratamiento. B. Parcela de la cinética de crecimiento del tumor. C. de Kaplan-Meier de supervivencia parcela. (*
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el tratamiento con cisplatino, CpG y péptido PADRE provoca fuertes efectos antitumorales sistémica
Dado que el tratamiento con cisplatino, CpG y PADRE genera los efectos más potentes antitumorales (Fig. 1), el próximo examinó si el tratamiento con los tres agentes podrían generar efectos antitumorales en un tumor secundario. ratones C57BL /6 fueron desafiados por vía subcutánea con 1 TC-células tumorales en el flanco derecho en el día 0, y luego de nuevo en el flanco izquierdo en el día 5. Un grupo de ratones se trató a continuación con anticuerpo anti-CD8 en los días 3-5 y a continuación, semanalmente para agotar las células T CD8 +. Los ratones se trataron como se muestra en la Fig. 2A, con cisplatino inyecta por vía intraperitoneal y con CpG y PADRE inyecta por vía intratumoral en el tumor primario en el flanco derecho. Como se muestra en la Fig. 2B, el volumen del tumor primario se redujo significativamente en los ratones tratados con cisplatino, CpG y PADRE en comparación con ratones no tratados. Por otra parte, el volumen del tumor secundario en el flanco izquierdo también se redujo significativamente en los ratones tratados con los tres agentes en comparación con los ratones no tratados (Fig. 2C). El agotamiento de las células T CD8 + se redujo significativamente el efecto terapéutico de cisplatino, CpG y tratamiento PADRE tanto en los tumores primarios y secundarios, lo que indica que las células T CD8 + son importantes para la eficacia del tratamiento (Fig. 2B y C). Higo. 2D muestra que el tratamiento con cisplatino, CpG y PADRE prolonga significativamente la supervivencia de ratones portadores de tumor TC-1 en comparación con ratones agotados de células T CD8 + y los ratones no tratados. Del mismo modo, el agotamiento de células T CD4 + significativamente afectada los efectos antitumorales de la pauta de tratamiento triple (S1A Fig.). Además, la infusión de las células T CD4 +-padre específico en ratones portadores de tumores significativamente mayor efecto antitumoral (S1B Fig.). Estos resultados muestran que las células T CD4 + también son importantes para el efecto terapéutico observado. Tomados en conjunto, los datos indican que el tratamiento con cisplatino seguido por CpG y PADRE genera respuestas inmunes antitumorales sistémica potentes capaces de actuar contra los tumores en sitios distantes.
C57BL /6 ratones (5 ratones /grupo) se expusieron secuencialmente con células tumorales TC-1 en el día 0 (flanco derecho) y el día 5 (flanco izquierdo), y después se dejaron sin tratar o se trataron con cisplatino en combinación con la inyección intratumoral con CpG y el péptido PADRE en el tumor primario. En el grupo de la depleción de células T CD8 +, los ratones fueron tratados como anteriormente, con la adition de 100 mg de anticuerpo CD8 anti-ratón (clon 2.43) inyectados por vía intraperitoneal en los días 3, 4 y 5 después de la exposición del tumor, y luego 150 g por semana posteriormente. A. Diagrama esquemático del régimen de tratamiento. B. parcela de dispersión de la cinética de crecimiento del tumor primario. C. parcela de dispersión de la cinética de crecimiento de tumores secundarios. D. Kaplan-Meier de supervivencia parcela. (***
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El tratamiento con cisplatino, CpG y mejora PADRE PADRE sistémica. respuestas específicos de células T CD4 + en TC-1 portadores de tumores de ratones
a continuación, se examinó el efecto del tratamiento con varias combinaciones de cisplatino, CpG y en los teléfonos PADRE respuestas inmunes sistémicas T CD4 +. TC-1 ratones portadores de tumores se trataron con diversas combinaciones de cisplatino, CpG y el péptido PADRE tal como se muestra en la Fig. 1A y PBMCs se analizaron por citometría de flujo 1 semana después de la última administración de antígenos para la presencia de IFN-γ secretora de las células T CD4 +-padre específico. Como se muestra en la Fig. 3A y B, los ratones portadores de tumores tratados con cisplatino seguido por CpG y PADRE generan el mayor número de PADRE-específica de células T CD4 + IFN-γ + sistémica en comparación con todos los otros grupos de tratamiento. Esto indica que el tratamiento con cisplatino, CpG y PADRE es capaz de generar respuestas de células T CD4 +-padre específico potente en ratones portadores de tumor TC-1.
C57BL /6 ratones por vía subcutánea (5 ratones /grupo) fueron desafiados con TC-1 en las células tumorales y, posteriormente, tratada con varias combinaciones de cisplatino, CpG y el péptido PADRE tal como se indica. PBMCs fueron analizados 1 semana después de la última administración de antígenos. La presencia de células T CD4 +-padre específico en PBMCs se analizaron mediante tinción intracelular de citoquinas para IFN-γ y CD4 + tinción seguido por citometría de flujo análisis. A. flujo Representante citometría de gráfico de contorno que representa la frecuencia de células T CD4 +-gamma secretoras de IFN en la circulación después de ser pulsadas con péptido PADRE. B. Gráfico de barras cuantificación de los datos (media ± DE).
El tratamiento con cisplatino, y CpG induce PADRE de antígenos específicos de las respuestas locales tumorales de células T CD8 + en ratones portadores de tumor TC-1
ratones portadores de tumor TC-1 se trataron con diversas combinaciones de cisplatino, CpG y el péptido PADRE tal como se muestra en la Fig. 1A. linfocitos tumorales infiltrantes (TIL) se recogieron para su análisis 12 días después de la última administración de antígenos. La presencia de células T CD4 +-padre específico y las células T CD8 + específicas de E7 entre TIL se caracterizó mediante tinción intracelular de citoquinas para IFN-γ, así como CD4 y CD8 tinción y se analizó por citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 4A y C, los ratones tratados con cisplatino seguido por CpG y PADRE generan el mayor porcentaje de células T CD4 +-padre específico entre las células T CD4 + infiltrantes de tumor en comparación con todos los otros grupos de tratamiento. Además, los ratones tratados con cisplatino, CpG y PADRE generan el mayor número de células específica de E7 T CD8 + entre las células tumorales en comparación con todos los otros grupos de tratamiento (Fig. 4B y D). Es importante señalar que los TIL recogidos de dentro del microambiente del tumor están en un estado activado, donde se están internalizados los receptores de células T. Por lo tanto, la tinción aparece como un gradiente basado en los distintos niveles de TCR internalización. Esta apariencia es diferente de el patrón de tinción generalmente observado en la evaluación de las células T específicas de antígeno en la circulación sistémica, donde se observó una población distinta. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que el tratamiento con cisplatino, CpG y PADRE puede conducir a la presentación cruzada del antígeno tumoral, E7, lo que resulta en antígenos específicos de las respuestas inmunes mejoradas tumorales T CD8 + mediadas por células en el loci tumor.
C57BL /6 ratones (5 por grupo) fueron desafiados por vía subcutánea con células tumorales TC-1 y se trató con varias combinaciones de cisplatino, CpG y el péptido PADRE tal como se indica. 12 días después de la última administración de antígenos, se recogieron linfocitos infiltrantes de tumor para analizar los subconjuntos de células inmunes. flujo A. Representante análisis de citometría de que representa la frecuencia de células T CD4 + IFN-gamma secretoras-padre específico entre el tumor total de la infiltración de células T CD4 +. B. Gráfico de barras cuantificación de datos de A. (media ± S. E.). flujo C. Representante análisis de citometría de que representa el número absoluto de células T CD8 + tetramer vinculante E7 en 5 × 10
5 suspensión de una sola célula preparado a partir de tumores. D. gráfico de barras cuantificación de datos de C (media ± DE).
El tratamiento con cisplatino, CpG y disminuye PADRE células mieloides supresoras derivadas de tumores en loci
A fin de examinar la efectos de cisplatino, CpG y tratamiento PADRE, se analizaron las células mieloides inmunosupresores derivados supresores (MDSCs) entre tumor infiltrante linfocitos de ratones portadores de tumor TC-1 tratados. Entre 30 y 35 días después del reto del tumor, los tumores se cosecharon y se analizaron por citometría de flujo como se muestra en la Fig. 5A. Higo. 5B muestra que los tumores de los ratones tratados con cisplatino, CpG y PADRE tenían un porcentaje significativamente menor de CD11b + Ly6G
Hi MDSCs en el loci tumor en comparación con todos los otros grupos de tratamiento. Estos datos sugieren que el tratamiento con cisplatino, CpG y PADRE provoca efectos antitumorales al menos en parte por la reducción de la población de MDSCs en el microambiente tumoral.
ratones C57BL /6 (5 por grupo) se estimularon de forma subcutánea con TC- 1 en las células tumorales y tratados con diversas combinaciones de cisplatino, CpG y el péptido PADRE. A 30-35 días después de la exposición del tumor, cuando los diámetros de los tumores excedieron 10 mm, se recogieron las células infiltrantes de tumor para analizar la presencia de CD11b + Ly6G
MDSCs hi. A. gráficos de contorno representativos que representan la frecuencia de CD11b + Ly6G
MDSCs HI de suspensión de célula única preparadas a partir de tumor. B. Gráfico de barras cuantificación de los datos de la A (media ± DE) (*
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células T CD4 +-padre específico induce apoptosis a través de Fas MDSC y Fas vía ligando
Hemos observado que el tratamiento con cisplatino seguido por CpG y PADRE redujo el número de MDSCs en loci tumor. Anteriormente, se ha demostrado que MDSCs expresan Fas y serán sometidos a la apoptosis mediada por Fas-FasL si encuentra una célula T que expresan FasL [17]. Por lo tanto, que caracteriza el efecto de las células T CD4 +-padre específico activadas en MDSCs en términos de actividad apoptótica y se encontró que MDSCs incubadas con células T CD4 +-padre específico tenían significativamente más alta expresión de anexina V en comparación con las incubadas con medio de control, lo que indica que células T CD4 + activadas son capaces de inducir la apoptosis de MDSCs (Fig. 6). Además, se observó que MDSCs co-cultivadas con células T CD4 +-padre específico combinado con Fas-FasL antagonista Kp7-6 disminuyó significativamente la frecuencia de apoptosis en comparación con el control (Fig. 7). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que las células T CD4 + PADRE-específicos inducen la apoptosis en MDSCs través de una vía Fas-FasL-dependiente, lo que indica que la matanza MDSC se puede producir a través de una vía no-antígeno-específica.
esplénica purificada CD11b + Ly6G
Hola MDSCs se incubaron con células T CD4 + específicas-padre o medio de control durante 24 horas. A. Representante flujo citometría de parcelas que representan la frecuencia de CD11b + Ly6G
Hola Anexina V + MDSCs. B. Gráfico de barras cuantificación de los datos A (media ± S. E.) (****
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A.. La expresión de Fas en MDSCs en presencia y en ausencia de células T CD4 +-padre específico. B. Gráfico de barras cuantificación de los datos en un (media ± S. E.). C. purificada esplénica Ly6G
Hi MDSCs se incubaron durante 12 horas con anticuerpo Fas agonista (Jo2) o IgG de control irrelevante, y el CD11b + Ly6G
se analizaron las células Hi para la frecuencia de apoptosis (anexina V + y 7-AAD -). D. MDSCs fueron co-cultivadas con células T CD4 +-padre específico durante 24 horas en combinación con IgG de control irrelevante o Fas-FasL antagonista Kp7-6. Se analizaron las CD11b + Ly6G
Hi células para la frecuencia de la apoptosis, caracterizado por Anexina V + y 7-AAD-. un resultado representativo citometría de gráficos de puntos que representan la frecuencia de CD11b + Ly6G
Hola Anexina V + MDSCs. E. Gráfico de barras cuantificación de los datos en D (media ± DE) (***
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Discusión
En el presente estudio, hemos demostrado que el tratamiento con cisplatino seguido de la inyección intratumoral de un potente adyuvante, CpG, y un epítopo reactivo Pan HLA-DR, péptido PADRE, genera una potente antígeno las respuestas inmunes mediadas por células y efectos antitumorales específicos. Es de destacar que el tratamiento con cisplatino, CpG y PADRE generan efectos antitumorales sistémicos y fue capaz de controlar tumores en sitios distantes. Además, nuestro tratamiento redujo la población de MDSCs en loci tumor, reduciendo así la inmunosupresión en el microambiente tumoral. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que el cisplatino, CpG y PADRE mejorar la presentación cruzada de antígenos tumorales para generar T CD8 + respuestas inmunes mediadas por células específicas de antígeno tumorales. La combinación de la quimioterapia adyuvante y el péptido inmunógeno presentado aquí representa un enfoque universal para el control del tumor.
Es de destacar que el enfoque actual del tratamiento de triple combinación no incluye la introducción del antígeno E7 mediante la vacunación. Sin embargo, la generación de células T CD8 + específicas de E7 se observa (Fig. 4B). Estamos razón de que la respuesta celular específica de E7 T CD8 + observado es evocada por la presentación cruzada de los antígenos E7 liberados de tumor después de la apoptosis inducida por cisplatino por las células presentadoras de antígenos. Tipo 1 La producción de interferón después del tratamiento CpG otra parte, promover la presentación cruzada.
Aquí se observa que las células T CD4 + PADRE-específicas son capaces de matar MDSCs través de la interacción Fas-FasL. Además de las células T CD4 +-padre específico ser capaz de matar MDSCs en el microambiente del tumor, cualquier otro células T activadas también podrían matar teóricamente MDSCs. De hecho, recientemente hemos demostrado que las células T y las células OT-1-E7 específicas T CD8 + son capaces de inducir la apoptosis en MDSCs después del tratamiento con cisplatino, CpG y el péptido GP33 (Wu et al, comunicación personal). Una vez activado, las células CD4 + y T CD8 + liberan citocinas relevantes, tales como IL-2, que conduce a la regulación positiva de la expresión de Fas en MDSCs. FasL se expresa por las células T activadas en sí. Como resultado, cuando una célula T activada encuentra un MDSC, el MDSC se someterá a la apoptosis mediada por Fas-FasL [17]. La eliminación de los MDSCs inmunosupresores del microambiente del tumor contribuye al control del tumor.
El presente estudio sirve como una plataforma que puede ser aplicable a muchos pacientes con diversos tipos de cáncer. Una característica única del péptido PADRE es que el epítopo se compone de es específico para muchas moléculas MHC de clase II, y por tanto es aplicable a numerosos individuos. Además, suponemos que este enfoque no requiere la identificación de antígeno tumoral. La primera ronda de tratamiento puede inducir la muerte celular del tumor y la liberación de antígeno tumoral en el microambiente tumoral, así como la generación de células T CD4 +-padre específico (Fig. 3). Después de las rondas posteriores de tratamiento, la liberación de antígeno de tumor conduce a la cruz-cebado y la generación de células tumorales específicas de antígeno CD8 + T, que son igualmente capaces de matar a las células tumorales (Fig. 4). Debido a este mecanismo, no es necesario conocer los antígenos tumorales inmunodominantes, haciendo que el enfoque potencialmente ampliamente aplicable.
Desde el enfoque actual implica la inyección intratumoral de agentes terapéuticos, es más aplicable a los tumores accesibles, tales como la cabeza y cuello, piel y tumores de cuello uterino. Sin embargo, el enfoque puede ser limitado en el caso de los tumores de difícil acceso, un problema que debe ser abordado con el fin de ampliar aún más este concepto para la traducción clínica. Esto puede ser resuelto mediante la modificación del péptido PADRE incluir homing tumor o ambiente del tumor de orientación aptámeros. Por ejemplo, el ligando CD13 se ha demostrado que es capaz de entregar el péptido antigénico a loci tumor [18], [19] y provocar una respuesta antitumoral específica de antígeno [1]. Además, hemos demostrado que la mesotelina y NKG2D se puede utilizar como módulos tumor-homing en las proteínas quiméricas, la entrega de las proteínas terapéuticas para los loci del tumor [20], [21]. Se requieren estudios adicionales para ampliar la aplicabilidad del enfoque actual de los tumores inaccesibles.
El enfoque que aquí se presenta puede ser un candidato ideal para la traducción clínica. De hecho PADRE y CpG se han probado en varios ensayos clínicos y ha demostrado ser seguro. PADRE ha sido probado en una formulación de una vacuna preventiva citomegalovirus (CMV) (NCT00722839) [22].