Extracto
pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo. Clínicamente, el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) se puede mejorar la detección precoz y el diagnóstico del riesgo entre la población. Para satisfacer esta necesidad, aquí se describe la aplicación de una amplia fraccionamiento nivel de péptido acoplado con conexión de etiquetas proteómica cuantitativa para el descubrimiento de potenciales biomarcadores séricos para el cáncer de pulmón, y el uso de análisis de microarrays de tejidos (TMA) y el seguimiento de la reacción ensayos Múltiple (MRM) para los siguientes hasta validaciones en la fase de verificación. El uso de estos arte del estado de, disponibles en la actualidad técnicas de proteómica clínica, en la fase de descubrimiento con confianza identificaron 647 proteínas séricas, proteínas y 101 mostraron una asociación estadísticamente significativa con NSCLC en nuestras muestras de descubrimiento 18. Este conjunto de datos proteómicos de suero nos permitió discernir los patrones diferenciales y procesos biológicos anormales en la sangre del cáncer de pulmón. De estas proteínas, alfa-1B-glicoproteína (A1BG) y ricos en leucina alfa-2-glicoproteína (LRG1), se seleccionaron dos glicoproteínas de plasma con función previamente desconocida como ejemplos para los que se realizaron TMA y MRM de verificación en un gran conjunto de muestras que consiste sobre 100 pacientes. Hemos puesto de manifiesto que A1BG y LRG1 se sobreexpresa tanto en el nivel de la sangre y las secciones del tumor, lo que se puede denominar de separar a los pacientes con cáncer de pulmón de los casos sanos
Visto:. Liu Y, X Luo, Hu H, R Wang, Sun Y, Zeng R, et al. (2012) integrativa Proteómica y Tejidos de microarrays de perfiles indican la asociación entre sobreexpresa proteínas séricas y de células no pequeñas cáncer de pulmón. PLoS ONE 7 (12): e51748. doi: 10.1371 /journal.pone.0051748
Editor: Giuseppe Viglietto, Universidad Magna Grecia, Italia |
Recibido: 25 Junio, 2012; Aceptado: 5 Noviembre 2012; Publicado: 19 de diciembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este proyecto fue apoyado por subvenciones del Ministerio de Ciencia y Tecnología (2010CB912100, 2011CB910200), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de china (91029301, 30821065, 81101760, 81172218, 81101761), Comisión de Ciencia y Tecnología de la municipalidad de Shanghai (09JC1416302), Academia china de Ciencias proyecto (KSCX2-YW-R-106, KSCX1-YW-02), la Universidad de Fudan (09FQ78) y el hospital de cáncer de la Universidad de Fudan (YJ200804, YJ200701). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es el cáncer más frecuente en el mundo, tanto en términos de incidencia y mortalidad. Cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) representa el 80-85% del cáncer de pulmón con una tasa de supervivencia global a 5 años inferior al 14% [1]. En concreto, la tasa de supervivencia a 5 años es de apenas 3% al 7% para el estadio IIIB, y es menos de 1% para la enfermedad en estadio IV [2]. Sin embargo, los pacientes diagnosticados en una etapa temprana y tienen experiencia en la cirugía una supervivencia global a los 5 años del 86% [3]. Por lo tanto, se necesitan nuevos métodos de diagnóstico para detectar el cáncer de pulmón en estadio temprano, ya que se puede curar con cirugía. Varias firmas de proteínas potenciales, tales como el antígeno carcinoembrionario, CYFRA21-1, calicreína plasmática y B1 enolasa específica de las neuronas se han descubierto y utilizado clínicamente como biomarcadores candidatos para el cáncer de pulmón. Sin embargo, ninguno de ellos mostró suficiente sensibilidad, especificidad o reproducibilidad [4]. Por lo tanto, se necesitan con urgencia biomarcadores para el diagnóstico precoz del cáncer de pulmón.
biomarcadores moleculares para la detección precoz del cáncer de pulmón puede adoptar muchas formas. biomarcadores histológicos son de suma importancia, ya que se pueden asociar directamente con los cambios patológicos, el riesgo de contracción, la presencia o el estadio de la enfermedad. Se cree que tiene potencial para distinguir los diferentes mecanismos de la enfermedad moleculares de NSCLC. Por otro lado, los biomarcadores séricos para el cáncer de pulmón son aún más atractivo, porque la sangre es de fácil acceso y se cree que adquirir proteínas secretadas, cobertizo, o de otro modo liberado de los tejidos por los que circula la sangre. Incluso algunas proteínas plasmáticas abundantes moderados podrían ser indicadores de la condición de organismo especial y se ha informado de que fluctúe en respuesta a ciertos tipos de enfermedades [5].
En la actualidad, se ha introducido el proteómica impulsada por la enfermedad basado en la espectrometría de masas al descubrimiento de ambos biomarcadores histológicas y serológicas. A pesar de la importancia del descubrimiento de biomarcadores séricos, uno de los principales desafíos técnicos ha sido el hecho de que la sangre proteoma es extremadamente compleja, que abarca un rango de concentración de al menos diez órdenes de magnitud. Se anticipa que los métodos de agotamiento eficientes y sistemas de fraccionamiento multidimensionales podrían ser útiles para separar las proteínas de baja abundancia y extender el límite de detección de [6]. En esto, se utilizó una extensa fraccionamiento en el nivel de péptido para el perfil de la albúmina de suero empobrecido proteoma, por un sistema multidimensional integrada única cromatografía líquida (IMDL) desarrollado en nuestro laboratorio [7]. Otro obstáculo es la técnica de cómo comparar de forma rápida y eficaz los niveles de proteína en todos los tejidos o muestras de plasma. Por lo general, estas muestras no son compatibles con la estrategia de marcaje isotópico estable in vivo de cuantificación basado en MS. Secuencialmente, in vitro estrategias de etiquetado, tales como los isótopos de acrilamida [9] iTRAQ [8] y están emergiendo como alternativas. Sin embargo, estas técnicas tienen limitaciones asociadas con los costos, la cobertura proteoma generalmente más pequeños debido a la selectividad etiquetado, la aplicabilidad y las diferencias en la eficiencia de marcaje. En este estudio, por lo tanto, utilizaron una estrategia simple y robusto etiqueta libre de cuantificación (LFQ) por recuento espectral en la fase de descubrimiento. Además, la urgente necesidad de análisis MS reproducible ha conducido al desarrollo de técnica de monitorización de reacción múltiple (MRM). Esta técnica se puede utilizar para medir las concentraciones de proteína en las muestras de plasma clínicos cuando se integra con los estándares de péptidos sintetizados y análisis de cuantificación absoluta (AQUA). Mejor selectividad, sensibilidad y rango dinámico se puede lograr mediante MRM, que son cruciales para la validación clínica [10].
El objetivo de este estudio es, en primer lugar de utilizar la proteómica escopeta de discernir directamente los patrones proteoma diferencial suero asociados con enfermedades de NSCLC, para entender las proteínas séricas regulados en términos de su importancia biológica, como las actividades moleculares, y para establecer una base de datos de indicadores de suero para el NSCLC. En segundo lugar, para validar nuestro esfuerzo descubrimiento, se seleccionaron dos candidatos nuevo biomarcador -A1BG y LRG1-, por medio de métodos de verificación tradicionales, tales como la transferencia convencional occidental y /o microarrays de tejidos (TMA), así como mediciones de GRM en la muestra más grande cohortes.
Métodos
Ética y Recogida de muestras de suero
las muestras de sangre de los pacientes recién diagnosticados se obtuvieron antes de cualquier tratamiento en el Departamento de Cirugía de Tórax en el hospital de cáncer de Shanghai. Los criterios de inclusión de los sujetos consistía en diagnóstico confirmado de CPCNP, sin metástasis a distancia u otras contraindicaciones quirúrgicas. Los consentimientos informados escritos fueron proporcionados por todas las personas involucradas en este estudio. muestras anónimas de los pacientes fueron seleccionados al azar. Este estudio ha sido aprobado por la junta de revisión institucional de la Universidad Fudan de Shanghai Centro de Cáncer.
Las muestras de suero fueron procesadas usando el mismo protocolo estandarizado. Brevemente, las muestras de sangre se dejaron coagular a temperatura ambiente durante 30 min, se centrifugó a 3000 g durante 20 min (4 ° C), y se recogieron los sobrenadantes, hecho a alícuotas, y se almacenan en -80 ° C hasta el ensayo. Intervalo de tiempo entre el procesamiento y la congelación no era más que 2 h para cada muestra. Ninguna de las muestras fue descongelado más de dos veces antes del análisis.
eliminación de lípidos y el agotamiento de la albúmina en las muestras de suero
El agotamiento de eliminación de lípidos y de albúmina en la fase de descubrimiento se modificaron de acuerdo con protocolos previamente comunicados [11] , [12]. En pocas palabras, para cada muestra, suero 50 l bruto se diluyó con 250 l de tampón (NaCl 100 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4), y se centrifugó a 10.000 g durante 30 min a través de un filtro de 0,22 micras (Millipore) para eliminar los lípidos. A continuación, el suero de 260 l sin lípidos se precipitó con 180 l de etanol previamente enfriado (Sigma), se incubaron durante una hora a 4 ° C con agitación suave, y se centrifugó a 16.000 g durante 45 min. Se recogieron los gránulos de albúmina-eliminado, se liofilizaron y se resuspendieron en tampón de lisis 100 l que contenía 8 M urea, 4% de CHAPS, mM Tris-base 40, DTT 65 mM y cóctel inhibidor de proteasa (Roche, Ltd.).
en solución de la digestión de proteínas
mezclas de proteína se incubaron con ditiotreitol 10 mM (DTT) a 37 ° C durante 2,5 h, y carbamidometilado con 20 mM yodoacetamida (IAA) durante 45 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Las soluciones de proteínas se precipitaron alquilados por cinco volúmenes de acetona pre-frío /etanol (01:01, v /v) con ácido acético al 0,1% a -20 ° C durante 12 h [13]. Los pellets de proteína se resuspendieron en 50 mM de tampón de cloruro de amonio (pH 8,3), y se incubaron con tripsina (25:1, Promega) durante 20 horas a 37 ° C. péptidos digeridos fueron liofilizadas y almacenadas a -80 ° C para el análisis de espectrometría de masas.
Línea de dos dimensiones de análisis MS /MS por Integrated cromatografía líquida multidimensional
La extensa fraccionamiento de los péptidos de suero se realizó en nuestro sistema integrado de cromatografía líquida multidimensional (IMDL) como se describe anteriormente [7]. Básicamente, una columna integrada bi-fase se utilizó para conseguir la separación HPLC en línea de dos dimensiones. Esta columna integrada incluye una columna catiónico fuerte (SCX, 320-micras ID, 50-mm longitud, Columna Technology Inc., CA) y una columna de cromatografía de fase inversa (RP) (150-m Identificación, 100 mm de longitud, Columna Technology Inc.). La mezcla de péptido fue en primer lugar inyectado por el inyector automático Surveyor (ThermoFinnigan, San Jose, CA) y luego se fraccionó mediante 11 pasos de pH (pH 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 7,0, 8,0, 8,5) usando una serie de tampones de pH (configurados por el ácido cítrico al 5 mM ajustado por NH
4OH). Diferentes tampones de pH se aplicaron a la columna integrada usando una inyección de bucle lleno de 100 l a 3 l /min antes de que el gradiente de RP-HPLC en línea. Los disolventes RP-HPLC utilizadas fueron 0,1% de ácido fórmico (v /v) acuosa (A) y ácido fórmico al 0,1% (v /v) de acetonitrilo (B), con el gradiente de 2-40% de fase móvil B en 115 minutos en 2 l /min después de la división. El espectrómetro de masas utilizado fue una trampa de iones lineal LTQ (Thermo). Una tensión de 3,0 kV se aplicó a la aguja ESI, y la energía de colisión normalizada era 35,0. El número de iones almacenados en la trampa de iones fue regulada por el control automático de ganancia. Los espectros fueron adquiridos en el modo dependiente de los datos, con la opción de que 10 iones más intensos de cada espectro MS para el análisis MS /MS. La función de exclusión dinámica se estableció como sigue; Número de repeticiones 3, repetir la duración de 0,5 minutos, y la duración de exclusión de 1,5 min.
Proteína de identificación
Los BioWorks ™ se utilizó 3,2 paquete de software para generar las listas de pico de todos adquirido espectros MS /MS ( parámetros por defecto), que luego se buscan automáticamente contra la proteína humana Internacional Índice de base de datos de secuencias de proteínas (versión 3.22, que contiene proteínas 57,867), utilizando la versión 2.7 SEQUEST (Universidad de Washington, con licencia para Thermo Finnigan) programa de búsqueda. Para estimar la tasa de identificaciones incorrectas (falsos positivos), todos los espectros filtrados fueron sometidos a la base de datos en busca contra una base de datos compuesta que contiene las secuencias de proteínas humanas, tanto en el delantero (correcta) y una orientación inversa (incorrecta) [14]. En todas las búsquedas de bases de datos, la tripsina fue designada como la proteasa, y se permitió que una sola hendidura perdido. tolerancia de masa máxima se establece como 3 Da para el ion precursor y 1,0 Da para los iones de fragmentos. Carbamidomethylation (57,0125 Da) fue registrada como una modificación fija en cisteína, y la oxidación (15.99492 Da) se estableció como una modificación variable sobre la metionina. Un software casero Buildsummary se utiliza para eliminar los datos redundantes como se define anteriormente [15].
Las proteínas se identificaron con criterios estrictos. En concreto, hemos empleado la estrategia de objetivo-señuelo ingenuo conservadora, que estima la identificación de proteínas tasa de falso descubrimiento (FDR) de forma análoga al péptido partido de espectro (PSM) FDR, es decir, mediante la aproximación de la cantidad esperada de la identificación de proteínas de falsos positivos por el número de proteínas señuelo identificación [16]. Se aplicaron umbrales para Xcorr de acuerdo con PSM preliminar FDR menor que 1% y la proteína final FDR menor que 5%. Todo resultado SEQUEST aceptado debe tener una puntuación ΔCn de al menos 0,1 independientemente del estado de carga [17].
Etiqueta cuantificación libre mediante recuento espectral y estadísticas
Una etiqueta enfoque simple cuantificación gratis con recuento espectral se utilizó para el perfil proteoma de suero entre los casos de control [18] y NSCLC. partidos péptido de secuencia asignados a cada grupo de las proteínas se suman entre sí y se toma como base de la cuantificación relativa [13], [17]. Los casos en cada cohorte fueron tratados como réplicas biológicas relacionadas con NSCLC. Se calculó el factor de enriquecimiento relativo, R
e, que se define como R
e = (n
f /n) /(N
f /N) para priorizan las proteínas sobreexpresadas o insuficientemente expresado [19 ]. En esta ecuación, n
f es el número de visitas de péptidos de una proteína en una muestra, n es el número total de accesos de péptidos en esta muestra, N
f es el total golpea cantidad de esta proteína en las muestras y N es el número total de accesos de péptidos de todas las proteínas en todas las muestras. Sobre la base de R
e, ejecutamos ANOVA y el estudiante prueba T, mediante una prueba de permutación de 200.000 veces en Pomelo II [20]. El análisis Característica de funcionamiento del receptor (ROC) se realizó mediante el paquete Proc en I [21]. En el análisis ROC de un panel de biomarcadores, se utilizó el modelo de regresión logística para evaluar el resultado del panel, que incorpora los candidatos que queremos incluir en el panel (es decir, usando la entrada del bloque de variables), junto con las probabilidades. Este modelo se realizó en SPSS (v13.0). Las probabilidades estimadas de ocurrencia del evento (como el cáncer o normal) fueron incorporados como predictores en línea ROC; y el área bajo la curva ROC (AUC) se calculó para estimar la potencia del panel de [22]. análisis jerárquico agrupación (HCA) y el análisis de componentes principales (PCA) se llevó a cabo por el software R (http://www.r-project.org/), utilizando los valores normalizados de cuantil recuentos espectrales transformados logarítmicos, es decir, mediante la transformación de log
2 (recuentos espectrales +1) para cada proteína en suero en cada muestra.
análisis de microarrays de tejidos (TMA)
inmunohistoquímica (IHC) tinción se realizó utilizando microarrays de tejidos adquirido de Shanghai outdo Biotech Co .. En resumen, las secciones incluidas en parafina, fijados con formalina de 90 pacientes con CPNM, que consta de 44 adenocarcinoma de pulmón (AD), 38 carcinoma de células escamosas (SCC), y 8 casos de otros subtipos, se deparaffinized y rehidratada. La peroxidasa endógena se inactivó con 3% de H (v /v).
2O
2 Después de la recuperación de antígeno y de bloqueo, las secciones se incubaron con anticuerpo policlonal de conejo anti-A1BG (1:100, LifeSpan Biosiences), policlonal de conejo anti-USP1 (01:25, Abgent), monoclonal de ratón anti-Mucin5B (01:25, Millipore) y monoclonal de ratón anti-LRG1 (dilución 1:200, Abonva) a 4 ° C durante la noche. Después de un enjuague con una solución de PBST, las secciones se incubaron secuencialmente con anticuerpo secundario biotinilado y el reactivo ABC (Vectastain), seguido de tratamiento con una solución de DAB (Shanghai Sangon tecnología biológica Engineering & amp; Service Co.). Por último, las secciones se counterstained con hematoxilina QS (Vectastain). Entre los 90 casos, sólo una porción se perdió durante el tratamiento, lo que resulta en las secciones 89 de NSCLC válida con sus controles emparejados no tumorales.
IHC diapositivas fueron revisados por dos patólogos (XL, y HC), cegados a todos los datos clínico-patológicas. Los resultados se promediaron por sus evaluaciones independientes, y se puntuaron estimando el porcentaje (P) de células que muestran tinción característica (de nivel no detectable o 0%, para tinción homogénea o 100%) y por la estimación de la intensidad (I) de la tinción (0, sin manchas visual, 1, tinción débil; 2, tinción moderada, o 3, fuerte tinción). El porcentaje se determinó mediante la proporción de todas las células positivas, sin juicios intuitivos de tipos de células. Los valores porcentuales fueron luego colapsaron en una puntuación P 0-9, correspondientes a los rangos de 0 a 5%, 5-15%, 15-25%, 25-35% a 85-100% finalmente. A medida que nos propusimos en un estudio anterior [13], la expresión de la proteína relativo del nivel histológico se obtuvo multiplicando la puntuación P por el valor de la intensidad I, es decir, mediante la denominada puntuación rápida (Q) (Q = P × I; mínimo = 0 y el máximo = 27).
Western blot
Se realizó el análisis de transferencia Western en 12 tríos seleccionados al azar de lo normal, AD y sueros SCC. Las muestras de proteína se resolvieron en un gel de poliacrilamida al 12% y se transfirieron a una membrana de PVDF (Pall Inc.). Se diluyó conejo policlonal anti-A1BG (LifeSpan Biosiences) como las instrucciones del fabricante y se utilizó para sondear la mancha. Immunodection se realizó utilizando ECL plus reactivos (Amersham Biosciences) y se expusieron a película de rayos x (Kodak). Después de las imágenes adquiridas WB finales, un software de imagen denominado Multi Gauge (v3.0, FUJI FILM CO. LTD) se utilizó para extraer los datos de expresión de proteínas por valor IOD.
medición LC-MRM
cuatro péptidos isotópicas asignados a A1BG y LRG1 (dos por cada proteína) se sintetizaron usando química de Fmoc estándar incorporado con puro, pesado [
13C
6] leucina (Sigma-Aldrich). Sin etiqueta [
12C] formas de cada péptido también se sintetizaron (GL Biochem, China). Todos los péptidos sintéticos se purificaron a & gt;. 95% de pureza con la cantidad informada del proveedor
Los péptidos digeridos de 0,1 l de suero crudo (el 70 CPNM muestra y 30 controles emparejados por edad, véase la Tabla S1) se resolubilized en 0,1% de ácido fórmico, se trataron con péptidos patrón interno, y se separó mediante cromatografía micro líquida de alta resolución en fase inversa en un sistema HPLC 1200 junto con un espectrómetro de masas 6410 QQQ (Agilent Technologies). La separación se lleva a cabo a una velocidad de flujo de la fase móvil de 1,5 l /min con tampón A (0,1% de ácido fórmico) y tampón B (90% de acetonitrilo en 0,1% de ácido fórmico), en una columna C18 trampa (300 micras × 5 mm, Agilent Technologies ) seguido de una columna C18 analítica (150 micras × 100 mm, columna Technology Inc., CA). El gradiente binario formado por 3-17% de B en 2,5 min, 17 a 23% de B en 25 min, 23 a 40% de B en 5 min, 40 a 100% de B en 5 min y a 100% de B durante 2,5 min. Los datos fueron adquiridos con un voltaje capilar de 4000 V, el secado de gas de 300 ° C en 3,0 L /min, y el gas nebulizador de 18 psi. voltaje del fragmentador y la energía de colisión (CE) se han optimizado con la infusión de cada péptido. En experimentos de GRM, los tiempos de ciclo no superaron 1,2 segundos y un mínimo de 20 puntos de datos fueron recogidos por el pico.
Se llevó a cabo la cuantificación absoluta de los niveles séricos A1BG y LRG1
análisis de datos MRM usando MassHunter cualitativa de software (Agilent). [
12C] /[
13C] áreas de los picos se registraron por la inspección manual de conducta estricta co-elución, teniendo todo el [
13C] transiciones como referencia. Para A1BG y LRG1, las verificaciones de su abundancia en diferentes cohortes fueron alcanzados por todos los pares de transición, pero sólo se utilizaron los mejores transiciones, que albergaban mejor respuesta de linealidad para la cuantificación absoluta. La linealidad de ensayo se caracteriza por la dilución de una digestión tríptica de una muestra de suero que se incorporó con péptidos de luz para generar una gama de concentraciones de analito endógenos que abarcan 3
7 y 3
8 veces intervalo de concentración (método modificado de Michael et al., [23]) para LRG1 y péptidos de referencia A1BG respectivamente. La cantidad de péptido [
12C] se midió por el punto de concentración en la que las relaciones de área de [
12C] /[
13C] eran más cercano a 1 (1.029 por A1BG y 0,922 para LRG1). relaciones de área se utilizaron para calcular las concentraciones endógenas de proteínas diana en el suero, por la fórmula equipado la curva de linealidad. inter-ensayo coeficiente de variación (CV) fue evaluada por cinco procesamiento separado y MRM replica de una muestra mezclada, y se definió límite de detección (LOD) como las concentraciones a las que el S /N del analito es igual a 3 [24 ]. El límite de cuantificación (LOQ) se determinó empíricamente como la menor concentración de analito que puede mantener la linealidad aceptable (correlación de Pearson, R & gt; 0,99) y se puede medir con. & Lt; 20% de CV [23]
Resultados
Una base de datos de alta calidad de NSCLC asociado proteínas séricas
sueros pre-terapia de 13 pacientes con CPNM (8 AD y 5 CCE) y 5 controles sanos fueron procesadas para IMDL-MS /MS análisis ( Figura 1). Para desentrañar la complejidad del proteoma de suero, que mejoró un método de precipitación anterior para eliminar la albúmina de suero humano y se utiliza el fraccionamiento HPLC de dos dimensiones. El proceso de agotamiento era rápido y de bajo costo, y era bastante reproducible y eficiente, como se demuestra en la Figura S1. Se utilizó una nueva serie de memorias intermedias de once valores de pH diferentes en IMDL, teniendo en cuenta la complejidad del proteoma de suero humano (Figura 1, panel central). En comparación con una separación tradicional unidimensional RP-LC, la cobertura proteoma se ha mejorado, teniendo en cuenta que más de tres veces la cantidad de proteínas se identificaron por IMDL bajo los mismos criterios PSM FDR (datos no mostrados)
.
Panel izquierdo , colección de muestras de suero y el agotamiento para eliminar la albúmina de suero humano (HSA); Panel central, fraccionamiento IMDL que separa péptidos de suero por su pIs (2.5~8.5) y la hidrofobicidad, con un ejemplo de cromatografía de HPLC-MS /MS mostró para cada etapa de elución de pH; Panel derecho, el número de pacientes con NSCLC y el número de controles sanos emparejados por edad en la fase de verificación por Western Blot, TMA y medición MRM. SCX, fuerte intercambiador de cationes, RP fase inversa cromatografía. AD: El adenocarcinoma; SCC: Carcinoma de células escamosas; CPNM:. Cáncer de pulmón no microcítico
Con el respeto a la creciente preocupación por la cuestión de la confianza de proteínas de la sangre identificado [25], se utilizaron los criterios estrictos, ingenuo objetivo-señuelo FDR en proteínas para calificar el nivel sérico proteoma [16]. En conjunto, 629,804 péptido hits de 4.456 péptidos únicos, asignando a 647 se identificaron las proteínas del suero (proteína FDR & lt; 4,6%) y se incorporan en la etiqueta cuantificación libre. a continuación, se observó la distribución XCorr de la identificación de péptidos en proteoma suero. Como se indica la figura S2, todos los espectros tenían un XCorr mayor que 2,25, y fueron dominados por identificación de mucho más altas puntuaciones tanto para carga 2+ y 3+ iones de carga. Para determinar aún más el rendimiento de la estrategia de la diana señuelo y sus derivados FDR, otro flujo de trabajo de identificación de proteínas ampliamente utilizado, Trans-Proteómica Pipeline (TPP) [26], también se aplicó a todos los espectros en bruto procedentes de una muestra de suero sano. Todos los PSM con PeptideProphet ≥0.75 fueron retenidos y asignados a las proteínas. Por otra parte, 89,7% de proteínas en nuestro resultado la identificación tenido un ProteinProphet ≥0.9, y alrededor de un 65,1% de proteínas tenido un ProteinProphet igualó 1. Por el contrario, si conservamos la etiqueta de señuelo en el TPP, proteínas de suero con ProteinProphet ≥0.9 tenido un FDR superior a 10,7 %. Estas propuestas de la confianza bastante alto de nuestra proteoma suero.
perfiles y detección de biomarcadores en el CPNM proteoma suero
A continuación calculamos el rango dinámico de la etiqueta de perfiles gratuita. Existe una correlación significativa entre la proteína recuentos espectrales y sus correspondientes concentraciones conocidas [27], [28] se obtuvo (Tabla S2). Por lo tanto, nuestro enfoque proteómico permitió oportunidades de identificación y cuantificación relativa de las proteínas del suero a través de seis órdenes de magnitud (tan bajo como varias nanogramos por mililitro).
Para establecer un CPNM asociada proteoma suero, comenzamos con la realización de agrupación jerárquica análisis (HCA) y el análisis de componentes principales (PCA) en el proteoma total a la dirección a la cual, si las proteínas séricas sustanciales fueron regulados debido a la ocurrencia de NSCLC. HCA y PCA se llevan a cabo tanto en la información espectral de contar todas las 647 proteínas séricas (ver método). El HCA implicaba que NSCLC y sujetos normales se incorporaron en dos grupos grandes (Figura 2A). Del mismo modo, en el análisis de PCA, NSCLC sueros podía separarse de 5 controles normales por sólo un componente principal, y la variación en el grupo de cáncer era mucho más que eso en el grupo normal (Figura 2B). Debido a que el análisis de MS de los casos de control se inserta aleatoriamente en las carreras de secuenciación de NSCLC 13 sueros, los factores pre-analíticos deben ser incierto y menos significativo que el fenotipo del cáncer. A pesar de las posiciones relativas de todos los casos de NSCLC en HCA y PCA no eran los mismos, se observó moderada divergencia entre AD y pacientes SCC. Para responder si la separación entre las cohortes venía de sólo una o dos proteínas abundantes cambiado de manera significativa, también empleamos PCA para todas las identidades de proteínas (ver las flechas rojas en la figura 2B). Este "bi-plot" sugiere que las proteínas importantes, en lugar de un pequeño número de proteínas, contribuyeron a la separación.
(A) Análisis de agrupación jerárquica y (B) Análisis de componentes principales de todas las 647 proteínas cuantificados a través las 18 muestras de suero. Extremos de las flechas rojas en (B) representan los resultados de la PCA para cada proteína.
Dado que la proteína de suero podría sostener identificado oportunidades para delinear o predecir NSCLC, permutado ANOVA y se emplearon estudiante prueba T entre las cohortes. Un total de 101 proteínas se filtraron como significativamente diferencial proteínas (p & lt; 0,01, ver detalles en la Tabla S3) y su patrón de enriquecimiento relativo como un mapa de calor se muestra en la Figura 3A. Entre 101 proteínas se filtraron, más de 25% se indicó anteriormente como NSCLC candidatos de biomarcadores. Esta consistencia significativa validado fuertemente nuestro enfoque experimental en la fase de descubrimiento. Es de destacar que la mayoría de los estudios anteriores se basaron en gel de 2D y reportaron mucho menos proteínas diferenciales que nuestro resultado [29], [30], [31]. Además, nuestra proteína 101 configurado con éxito cubrió una proporción sustancial de los candidatos informó de un laborioso trabajo previo [32], lo que combinado extensa cromatografía líquida multidimensional y electroforesis en gel diferencia de dos dimensiones para cada fracción de cromatografía. Estas evidencias demuestran que nuestro fraccionamiento IMDL en línea no sólo conveniente, sino también relativamente sensible en la detección de potenciales biomarcadores sanguíneos. Además de los marcadores candidatos NSCLC reportados, encontramos proteínas notables considerables estrechamente relacionados con otros tipos de cáncer, tales como alfa-1B-glicoproteína [33], del complemento C1q subcomponente subunidad A [34], el fibrinógeno alfa /cadena gamma [35], [36] , fibulin-1 [37], el factor plaquetario 4 y su variante [38]. Aún así, hubo varias proteínas que albergaban muy buenas estadísticas, pero carecían de la evidencia previa para vincularlos a la condición de cáncer, tales como la MAPA proteína (nombre alternativo, la alfa-1-microglobulina), multivesiculares subunidad cuerpo 12B y de tipo V de protones ATPasa 116 kDa subunidad. proteínas interesantes que directamente vinculados a un estado canceroso (ya sea CPNM u otro tipo de cáncer en el ser humano) por la literatura minera se enumeran en la Tabla 1.
(A) la agrupación jerárquica mapa de calor de 101 proteínas alteradas significativamente. Expresión valores se muestran como una escala de colores con los valores más altos representados por amarillo y inferior representado por azul. procesos biológicos (B) de ontología de genes considerablemente enriquecido en 101 conjunto de proteínas. Gene símbolos en círculos azules o rojos (podría ser denominado en la Tabla S3) indicar las proteínas correspondientes de abajo o hasta reguladas en el CPNM sueros.
Procesos Biológicos enriquecidas en suero proteoma diferencial de CPNM
a continuación trató de caracterizar las 101 proteínas en el contexto de sus funciones biológicas. Al comparar proceso biológico GO anotado por BINGO, encontramos varios procesos fueron significativamente enriquecido (ajuste p & lt; 0,05 después de la corrección BH, Figura 3B). En concreto, los procesos de respuestas de fase aguda (p = 5.26E-10) y la homeostasis de cationes celular (p = 1.31E-6) en el sistema circulatorio tendían a ser de hasta reguladas en los sueros cancerosos. Los procesos relacionados con la activación del complemento (p = 1.28E-7), la muerte celular (p = 1.15E-2) y la apoptosis (p = 1.27E-3) fueron también significativamente regulada. Además, encontramos una serie de actividades de proteínas no conocidas previamente a residir en el cáncer de pulmón, como el inhibidor de la proteasa y la actividad de unión al receptor acoplado a proteína G, cuyas proteínas relevantes eran en su mayoría las reguladas (p = 1.56E-11 3.24E y -6). En conjunto, estas observaciones implican NSCLC no sólo en las respuestas de fase aguda y la inmunidad, sino también en la transducción de señales específicas y los procesos de muerte.
TMA y de puntuación para validar la expresión histológica A1BG, USP1 y 5B mucina en tejidos de NSCLC
Para demostrar que algunos, si no todos, de las proteínas de interés están de hecho relacionados con el riesgo de NSCLC, en la fase de verificación hemos utilizado diferentes enfoques de validación. Debido a alta concordancia se observó anteriormente entre la medición TMA y RT-PCR [39] o perfiles proteómicos [40], nos preguntamos si el TMA podría permitir una estimación rápida, rigurosa y semi-cuantitativa de los biomarcadores histológicos. En esta sección, además de alfa-1B-glicoproteína (A1BG) y ricos en leucina alfa-2-glicoproteína (LRG1) que son de la abundancia de gama media en el suero, se optó por la mínima ubiquitina abundantes proteínas de suero carboxilo-terminal hidrolasa 1 ( USP1) que se detectó en sueros NSCLC. Además, dado que la línea celular lisado podría ser biológicamente más cerca de la muestra de tejido, se seleccionaron en candidato mucina-5B que detectó en el nivel de células NSCLC de acuerdo con un conjunto de datos en nuestro estudio anterior [17]. Nuestra TMA hacia estas cuatro proteínas proporcionan un perfil homogéneo y sincrónica de 90 secciones en NSCLC pareadas. Todas las proteínas analizadas presentaron mayor nivel de expresión en secciones de tumor de NSCLC (Figura 4A). Para acceder a cerca la diferencia de nivel entre NSCLC y sus secciones no tumorales adyacentes, la intensidad de la tinción IHC (I, 0-3) y el porcentaje (P, 0-9) de células teñidas positivas fueron distribuidos (Figura 4B y la figura S3) . La mayoría de las secciones de tumores se caracterizaron con mayor intensidad (I≥2) y las células más positivos (P & gt; 60%). Tian et al.