Extracto
El complejo partícula de proteína tráfico 4 (TRAPPC4) está implicada en la mediada por vesículas transporte, pero su asociación con la enfermedad rara vez ha sido reportado. Hemos explorado su potencial interacción con ERK2, que forma parte del complejo de ERK1 /2 en la proteína activada por mitógeno quinasa /regulada por señal extracelular-quinasa (ERK-MAPK), por una levadura de dos híbridos pantalla y confirmado por la co-inmunoprecipitación (Co -IP) y glutatión S-transferasa (GST) desplegable. Más investigación encontró que cuando se agota TRAPPC4, ERK1 /2 activada disminuyó específicamente en el núcleo, que fue acompañado con la supresión del crecimiento celular y la apoptosis en células de cáncer colorrectal (CRC). La sobreexpresión de TRAPPC4 promovió la viabilidad celular y causó activa ERK1 /2 para aumentar en general, pero especialmente en el núcleo. TRAPPC4 se expresó más altamente en el núcleo de las células de CRC que en epitelio del colon normal o adenoma que correspondía con la tinción nuclear de pERK1 /2. Se demuestra aquí que TRAPPC4 puede regular la proliferación celular y la apoptosis en CRC por la interacción con ERK2 y posteriormente la fosforilación de ERK1 /2, así como la modulación de la localización subcelular de pERK1 /2 para activar la vía de señalización correspondiente
Visto:. Zhao SL, Hong J, Xie ZQ, Tang JT, Su WY, Du W, et al. (2011) TRAPPC4-ERK2 Interacción Activa ERK1 /2, modula su localización nuclear y regula la proliferación y la apoptosis de las células del cáncer colorrectal. PLoS ONE 6 (8): e23262. doi: 10.1371 /journal.pone.0023262
Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 12 de mayo de 2011; Aceptado: 10 de julio de 2011; Publicado: 3 Agosto 2011
Derechos de Autor © 2011 Zhao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales del Programa clave (Nº 30.830.055) a J-YF (http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default106.htm) y por las subvenciones del Nacional de Ciencias Naturales Fundación del Programa de Jóvenes de S-LZ (Nº 31.000.634) (http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default106.htm), Shanghai Comisión de Ciencia y Tecnología de S-LZ (núm 10ZR1419000) (http : //www.stcsm.gov.cn/structure/index.htm), la Oficina de Salud de Shanghai para que los jóvenes LZ-S (Nº 2009032) (http://wsj.sh.gov.cn/website/), Shanghai Escuela de Jiao Tong-Fundación Universidad de Medicina de Ciencia y Tecnología de S-LZ (09XJ21065) (http://www.shsmu.edu.cn/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
TRAPPC4, el ortólogo humano de Trs23p levadura, también conocida como synbindin, se conoce generalmente como una proteína citoplasmática neuronal identificado originalmente por la levadura de dos híbridos utilizando el syndecan-2 (que pertenece a una familia de la superficie celular proteoglicanos heparán sulfato que regula el comportamiento de células a través de vías de transducción de señales [1], [2], [3]) dominio citoplásmico como cebo [4]. Se considera un ligando fisiológico de sindecano-2 en las espinas dendríticas que participa en la formación de sindecano-2 inducida por la columna vertebral mediante la contratación de vesículas intracelulares hacia sitios post-sináptica en las neuronas del hipocampo de rata. TRAPPC4 se ha detectado en las células madre /progenitoras hematopoyéticas CD34 + (HSPCs) y por lo tanto también se conoce como HSPC172.
TRAPPC4 como miembro de la partícula de proteína tráfico (Trapp) la familia de proteínas está implicada en el transporte de vesículas mediada , un proceso llevado a cabo por prácticamente todas las células y es necesario para la correcta orientación y la secreción de proteínas. En la actualidad, hay 10 conocidos subunidades Trapp levadura (Bet5p, 3p, Trs20p, 23p, 31p, 33p, 65p, 85p, 120p, 130p), y eucariotas superiores tienen ortólogos para ocho de ellos (TRAPPC1~5,6a, 6b, 8,9) [5]. Juntos, forman dos tipos de complejos mutisubunit: Trapp I y II Trapp. En la levadura, funcionan estos complejos en una serie de procesos, incluido el transporte retículo endoplasmático-a-Golgi (Trapp I) y un paso mal definida en la red trans del Golgi (Trapp II) [6], [7], [8] . Los estudios en células normales de riñón de rata (NRK) y células HeLa también mostraron que el complejo de TRAPP desempeña un papel durante el transporte ER-Golgi [9], [10]. El dominio PDZL en TRAPPC4 es una de las características más singulares del complejo de vertebrados, en comparación con la levadura Trapp I. La disfunción de subunidades Trapp han sido implicados en enfermedades humanas. Las mutaciones en TRAPPC1 se informaron (MUM-2) para resultar en la expresión de péptidos antigénicos en el melanoma [11], y las mutaciones en TRAPPC2 (sedlin) se han relacionado con espondiloepifisiaria tarda displasia (SEDT) [12]. Sin embargo, el papel de TRAPPC4 en la enfermedad rara vez se ha estudiado.
El cáncer colorrectal (CCR) es una causa importante de morbilidad y mortalidad en todo el mundo [13]. carcinogénesis colorrectal es un proceso de múltiples pasos complejo que implica la interrupción progresiva de la proliferación de células epiteliales, la apoptosis, diferenciación y supervivencia mecanismos intestinales [14]. La proteína activada por mitógeno cinasa /regulada por señal extracelular quinasa vía (ERK-MAPK) es una de las vías de transducción de señales más importantes para la fisiología celular, y varios factores de crecimiento clave y proto-oncogenes promover el crecimiento y la diferenciación a través de esta cascada [15] . Tras la activación, el complejo de ERK1 /2 migra al núcleo donde fosforila diversos factores de transcripción que regulan genes para aumentar la proliferación celular y modulan la apoptosis de las células [16]. Sin embargo, los mecanismos detallados de la activación y translocación nuclear de ERK1 /2 no han sido completamente aclarado.
En el presente estudio, se realizó una evaluación de la levadura de dos híbridos para identificar ERK1 y ERK2 proteínas de unión. TRAPPC4 se encontró que se unen con ERK2. Se confirmó la interacción y el más investigado el papel de la interacción TRAPPC4-ERK2 en el CCR.
Resultados
TRAPPC4 fue identificado como un factor de ERK2 interactuar mediante el cribado de dos híbridos
la fosforilación y la entrada nuclear de ERK1 /2 es crítica para la activación de la vía de ERK-MAPK. Para identificar los factores relacionados con el proceso, una levadura de dos híbridos pantalla se realizó con ERK1 y ERK2 como cebos (de larga duración) en conjunción con una biblioteca de ADNc de HeLa MATCHMAKERTM humano. De las colonias que crecen en Leu-Trp-His placas que fueron seleccionados, 57/61 fueron positivos para ERK2 y 12/32 de ERK1 en un ensayo de ß-galactosidasa. Se extrajeron los plásmidos a partir de estas colonias positivas, amplificado en bacterias y co-transformada de nuevo en la levadura junto con los plásmidos cebo para pruebas posteriores mediante el ensayo de ß-galactosidasa. Once clones fueron confirmados para tener una interacción positiva con ERK2 y ERK1 con doce. Entre estos plásmidos que fueron éxitos positivos para ERK2 y ERK1, TRAPPC4 se identificó en cinco y seis de las secuencias, respectivamente, después de la secuenciación. Esta fue la primera vez que TRAPPC4 fue identificado como una proteína que interactúa potencial de ERK2.
Validación de la interacción TRAPPC4-ERK2
Para confirmar aún más la interacción entre TRAPPC4 y ERK2, co-inmunoprecipitación y se llevaron a cabo experimentos GST pull-down. Para la co-inmunoprecipitación, de larga duración TRAPPC4 cDNA se obtuvo y se clonó en pCDEF-Myc, mientras que la secuencia ERK2 fue clonado en pCDEF-Flag. Los vectores pCDEF-Myc-TRAPPC4 y pCDEF-Flag-ERK2 resultantes fueron validados mediante secuenciación y co-transfectaron en la línea celular 293T. El análisis de transferencia Western (Fig. 1A) mostró que los plásmidos podrían expresar niveles significativos de las proteínas. Después de usar un anticuerpo anti-Myc para co-inmunoprecipitación, tanto la banda de banda y ERK2-flag TRAPPC4-myc se detecta a partir de las células co-transfectadas pCDEF-Myc-TRAPPC4 y pCDEF-Flag-ERK2, que indica que hay una interacción entre TRAPPC4 y ERK2. En la muestra de control positivo con el co-transfectadas pCDEF-Myc-p16 y vectores pCDEF-Flag-TSSK1, tanto la banda banda de p16-Myc y TSSK-bandera fueron detectados, lo que indica que las proteínas podrían ser co-immunoprecipitated de nuestro protocolo basado en la interacción conocida entre p16 y TSSK1. Sólo la banda TRAPPC4-myc se detectó cuando pCDEF-Myc-TRAPPC4 fue co-transfectadas con un vector de bandera de vacío, mientras que ninguna banda se detectó cuando pCDEF-Flag-ERK2 fue co-transfectadas con el vector vacío Myc, lo que sugiere que las interacciones observadas anteriormente son específicos y no mediados por las etiquetas de proteínas
A:. Co-inmunoprecipitación de TRAPPC4 y ERK2. Las células 293T se transfectaron con el vector pcDNA vacío o vector pcDNA para expresar Flag etiquetados ERK2 (42 kD), o Myc etiquetados TRAPPC4 (26 kD). Los lisados celulares se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpo anti-Flag-HRP o anticuerpo anti-Myc-HRP. La presencia de ERK2-Flag y TRAPPC4-Myc en extractos de células antes de la inmunoprecipitación se controló utilizando anticuerpos anti-Myc anti-Flag y (Entrada). La co-transfección de vectores de expresión para p16-Myc y TSSK1-Flag se utilizó para el control positivo (carril 1). B: Los resultados representativos de experimentos de validación GST desplegables. (A) El análisis por inmunotransferencia de GST, y las proteínas GST-ERK2 utilizados como control negativo (carril 2) y el cebo (lane3) para el ensayo de pulldown. Las proteínas se detectaron utilizando anti-6 × SU anticuerpos después de SDS-PAGE y la transferencia de membrana. El carril 1 mostró el ensayo en blanco, sin GST o GST-ERK2. (B) ERK2 expresa como una proteína de fusión GST a partir de bacterias fue unida a perlas y se incubaron con TRAPPC4 expresa como 6 × proteína de fusión His-TRAPPC4 para un experimento de pulldown. La proteína GST-ERK2 (carril 1), proteína GST (lane2) y la proteína TRAPPC4 (Lane4) se detectaron mediante tinción de Coomassie. Lane3 mostró el marcador.
Como es posible que el TRAPPC4 y la interacción ERK2 pueden ser indirectos debido a otros factores de proteína en el extracto celular pueden estar implicados en la mediación de la interacción, por ejemplo, actuando como factores de 'salir del paso', el próximo examinado una posible interacción directa entre las dos proteínas usando ensayos de GST pull-down. TRAPPC4 se tira hacia abajo con las proteínas de fusión GST-ERK2 (Fig. 1B, carril c), pero no con GST sola (Fig. 1B, carril b), lo que indica que TRAPPC4 y ERK2 específica y directamente interactuaron
in vitro
.
TRAPPC4 regula ERK1 /2 fosforilación en la línea celular SW1116
la fosforilación de ERK1 /2 es un paso crítico en la vía de señalización de ERK. Ahora que habíamos demostrado que TRAPPC4 interactuó con ERK2, el próximo examinado la contribución relativa de TRAPPC4 en ERK1 /2 fosforilación. Después de reducir el nivel de expresión en las células SW1116 TRAPPC4 por RNAi o sobreexpresan por transfección de un plásmido que codifica el gen de longitud completa, se determinó el cambio en los niveles de pERK por transferencia de Western. La detección de GAPDH se utilizó como control de carga. Si bien no hubo diferencias observadas en los niveles de proteína de ERK1 totales /2 en todos los grupos (Fig. 2), el nivel de fosforilación de ERK1 /2 se había reducido regulado después de siRNA mediada por el agotamiento de TRAPPC4 (Fig. 2A) y hasta -regulated después de su sobreexpresión (Fig. 2B). Además, se trataron dos grupos de células con el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), uno de los activadores de la vía ERK-MAPK, y encontramos que el nivel de ERK1 /2 fosforilación después de que el tratamiento no fue significativamente diferente entre los grupos, a pesar de sus diferencias en los niveles TRAPPC4 (Fig. 2).
se lisaron
las células, y cantidades iguales de proteína fueron analizados por Western blot utilizando anticuerpos contra fosfato ERK1 /2 (pERK1 /2), o ERK1 /2, o TRAPPC4. La densidad de las bandas de Western blot se normalizaron a la cantidad de proteína GAPDH. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos repetidos. *,
p Hotel & lt; 0,05. A. Las células se transfectaron con TRAPPC4 siRNA (siTRAPPC4) desmontables expresión TRAPPC4 o con negtive Control de siRNA (siCONTROL) como control; También se trataron las células con PDGF para activar vía ERK-MAPK, o con su disolvente (PBS + 0,1 BSA) como control. B. Las células fueron transfectadas con el vector de pCDEF-myc-TRAPPC4 para sobreexpresar la proteína TRAPPC4 o con vector pCDEF-myc como control; También se trataron las células con PDGF para activar vía ERK-MAPK, o con su disolvente (PBS + 0,1 BSA) como control.
TRAPPC4 regula la distribución espacial de fosforilada ERK1 /2
Ya que habíamos demostrado que TRAPPC4 podría influir en el estado de activación de ERK1 /2, quisimos determinar su efecto sobre la localización subcelular de pERK1 /2. A continuación, se compararon pERK1 /2 y ERK1 /2 en la expresión citoplásmica separados y las fracciones nucleares cuando TRAPPC4 se agotó o sobreexpresa como se describe anteriormente. Una vez más, GAPDH se utilizó como control de carga para la entrada de proteína citoplasmática, y TBP se utilizó como control para la entrada de la proteína nuclear
.
Por transferencia Western, se encontró que después del tratamiento TRAPPC4 siRNA, el nivel de pERK1 /2 disminuido significativamente en el núcleo (Fig. 3A). Mientras tanto, no hay diferencia significativa en pERK1 /2 se encuentra en el citoplasma cuando cuantificado, a pesar de un ligero aumento se sugirió visualmente (Fig. 3B). Por otro lado, cuando se sobreexpresa TRAPPC4, pERK1 /2 expresión se upregulated significativamente en el núcleo (Fig. 4A). Mientras que en el citoplasma, nuestros resultados mostraron un aumento visual ligero sin diferencias significativas cuando cuantificado (Fig. 4B).
células SW1116 se transfectaron con TRAPPC4 siRNA (siTRAPPC4) desmontables expresión TRAPPC4 o con negtive Control de siRNA (siCONTROL ) como control; También se trataron las células con PDGF para activar vía ERK-MAPK, o con su disolvente (PBS + 0,1% de BSA) como control. extractos de citoplasma y nucleares se prepararon como se describe en los procedimientos experimentales, y cantidades iguales de proteína se analizaron por análisis de transferencia de Western usando anticuerpos contra fosfo-ERK1 /2 (pERK1 /2), o ERK1 /2, o TRAPPC4. La densidad de las bandas de Western blot se normalizaron a la cantidad de proteína GAPDH para la proteína citoplasma o TBP para la proteína nuclear. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos repetidos. *,
p
. & Lt; 0,05
SW1116 células fueron transfectadas con el vector pCDEF-myc-TRAPPC4 que sobreexpresan la proteína TRAPPC4 o con pCDEF-myc vector como control; También se trataron las células con PDGF para activar vía ERK-MAPK, o con su disolvente (PBS + 0,1% de BSA) como control. Nuclear (A) y los extractos de citoplasma (B) se prepararon como se describe en los procedimientos experimentales, y cantidades iguales de proteína se analizaron por análisis de transferencia de Western usando anticuerpos contra fosfo-ERK1 /2 (pERK1 /2), o ERK1 /2, o TRAPPC4 . La densidad de las bandas de Western blot se normalizaron a la cantidad de PDD para la proteína nuclear o proteínas GAPDH para la proteína citoplasma. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos repetidos. *,
p
. & Lt; 0,05
PDGF puede activar la vía ERK-MAPK a través de los receptores tirosina quinasas [17]. Cuando la línea celular SW1116 fue estimulado con PDGF, una ligera disminución de pERK1 /2 se observó visualmente en la fracción nuclear después TRAPPC4 knock-down, pero no fue significativa en la cuantificación. Mientras tanto, ninguna alteración significativa en pERK1 /2 se cuantificó en la fracción citoplásmica, a pesar de un ligero aumento se sugirió visualmente (Fig. 3). Sin embargo, la estimulación del PDGF de las células que sobreexpresan TRAPPC4 resultó en significativa pERK1 /2 upregulation en el núcleo, pero no en el citoplasma (Fig. 4).
TRAPPC4 modula la proliferación y el agotamiento de TRAPPC4 induce la apoptosis en la línea celular SW1116
La activación de las quinasas ERK-MAP se ha relacionado con la proliferación celular [16]. Para estudiar más a fondo la función de TRAPPC4 en las células CRC, comparamos la proliferación celular de las células SW1116 cuando la expresión se redujo TRAPPC4 de siRNA o sobre-expresado con larga duración de transfección génica TRAPPC4 con el del control simulado. Resultados del Kit Recuento celular (CCK) -8 ensayo revelaron una inhibición significativa del crecimiento después de la depleción TRAPPC4 y un aumento de la viabilidad celular cuando TRAPPC4 se sobreexpresa tanto a partir de 24 h después de la transfección (Fig. 5A).
R: CCK-8 ensayo. células SW1116 se sembraron en una placa de 96 pocillos hasta subconfluentes. Las células viables se determinaron por CCK-8 ensayo. Tres independiente del tiempo se realizaron por triplicado. Las células se trataron con TRAPPC4 siRNA desmontables expresión TRAPPC4 o con negtive Control de siRNA utilizados como control (a), así como con tranfered vector pCDEF-myc-TRAPPC4 para sobreexpresar la proteína TRAPPC4 o con vector pCDEF-myc como control (b). *,
p Hotel & lt; 0,05. B: Análisis de la apoptosis. Después las células se trataron con SW1116 TRAPPC4 siRNA o negtive Control de siRNA utilizado como control para 48 h. La apoptosis se llevó a cabo utilizando el ensayo de V Anexina con yoduro de propidio contratinción permitiendo la cuantificación por citometría de flujo. Tres independiente del tiempo se realizaron por triplicado. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (SD). No hubo diferencia significativa entre los dos grupos (
p Hotel & lt; 0,01) guía empresas
acumulación TRAPPC4 en el núcleo se asocia con pERK1 /2 tinción en los cánceres colorrectales humanos
a medida que poco se sabe acerca de la expresión y localización de TRAPPC4 en el cáncer colorrectal
in vivo
, que luego comparó su expresión en el epitelio del colon, adenoma y adenocarcinoma de tejidos normales por inmunohistoquímica, como se describe en Materiales y métodos. En epitelio colónica normal, la tinción TRAPPC4 estaba restringida al citoplasma (Fig. 6A). 4,55% de las células en las muestras de adenoma mostró tinción nuclear, mientras que era 55,89% en las muestras adencarcinoma (
p
& lt; 0,01). No se han observado diferencias significativas en la expresión total de TRAPPC4 entre los tres grupos (grupo epitelio normal del colon = 85,7%; grupo de adenoma = 72,7%; grupo de adenocarcinoma = 79,4%;
p Hotel & gt; 0,05).. (Tabla 1 )
(a), pERK1 /2 (B) y ERK1 /2 (C) en el epitelio del colon normal (a), adenoma (b), y el adenocarcinoma (c). Polygrams (d) muestran la expresión de las proteínas en el citoplasma (rosa), el núcleo (amarillo), y total (azul). A: Expresión de TRAPPC4 no tiene ninguna diferencia significativa en los tres grupos totalmente, pero aumenta en el núcleo de A a C. B: su nivel aumenta de manera significativa de A a C pERK1 /2 se encuentra principalmente en el núcleo, y. C: Expresión de ERK1 /2 no tiene ninguna diferencia significativa en los tres grupos totalmente, pero aumenta en el núcleo de A a C. aumento original × 200.
Por otra parte, se analizó la asociación entre TRAPPC4 y pERK1 /2 o ERK1 /2 en la tinción normales del colon epitelio, adenoma y adenocarcinoma. Si bien se detectó ERK1 /2 tinción tanto en el citoplasma y el núcleo (Fig. 6C), su tinción en el núcleo aumentó significativamente en el grupo de adenocarcinoma en comparación con los otros dos grupos. Además, los pERK1 /2 proteínas activadas fueron situados en el núcleo, y no hubo diferencias significativas entre los tres grupos (Fig. 6B). Por lo tanto, nuestros resultados demuestran una correlación significativa entre la expresión TRAPPC4 nuclear y /2 niveles pErk1 (
r = 0,996
), y también entre la expresión TRAPPC4 nuclear y /ERK1 2 niveles (
r = 0,994
).
Discusión
los dos componentes del complejo de ERK1 /2 se encuentran siempre a ser co-localizados en los carcinomas colorrectales [17], [18], [19], [20] y la ERK1 y ERK2 MAPKs han atraído el interés de la investigación intensa debido a su participación fundamental en la regulación de la proliferación celular y Surviva [17]. ERK activadas fosforilan y regulan las actividades de una lista cada vez mayor de los sustratos que se estima que comprenden más de 160 proteínas [21]. Por lo tanto, ERK1 y ERK2 fueron utilizados como cebo para la detección de dos híbridos de levadura en una biblioteca de ADNc humano Hela en el primer paso de este estudio. Como resultado, entre las 23 proteínas de unión (11 con ERK2 y 12 con ERK1), la posible interacción de TRAPPC4 y ERK2 pero no con ERK1 se reveló por primera vez. Nuestra co-inmunoprecipitación y experimentos GST-menú desplegable confirmó además TRAPPC4 como un compañero de interacción ERK2.
Dado que se ha reportado poca evidencia de proteínas Trapp en CRC, y el papel de la interacción TRAPPC4-ERK2 es aún desconocido, nos primero analizado el efecto de TRAPPC4 en ERK1 fosforilados /2, la forma activada de ERK1 /2. Hemos encontrado que, en su conjunto, la sobreexpresión de TRAPPC4 activa ERK1 /2, mientras que su agotamiento disminuyó /2 niveles pERK1 en la línea celular derivada de cáncer de colon SW1116. Por lo tanto, TRAPPC4 actúa como un regulador positivo de pERK1 /2.
Aunque algunos se encuentran en el citoplasma, la mayoría de los sustratos de ERK son proteínas nucleares [22]. ERKs activados pueden trasladar al núcleo donde se fosforilan y regulan diversos factores de transcripción, tales como factores de transcripción Ets familia, en última instancia conduce a cambios en la expresión de genes [23]. La evaluación posterior de las fracciones citoplasmáticas y nucleares puso de manifiesto que la ubicación de pERK1 /2 también alteró junto con los niveles de expresión TRAPPC4. Cuando TRAPPC4 fue derribado, el nivel pERK1 /2 nuclear fue notablemente reducido regulado, pero no hubo diferencia significativa se muestra en el citoplasma. Cuando se sobreexpresa, pERK1 /2 expresión aumentó tanto en el núcleo y el citoplasma, pero más notablemente en el núcleo. Por lo tanto, TRAPPC4 está implicado no sólo en la fosforilación de ERK1 /2, sino también su distribución espacial en las células epiteliales colorrectales. proteínas Trapp son conocidos por ser parte de un gran complejo multi-proteína implicada en ER-a-Golgi y el tráfico intra-Golgi [5], [7], [8]. Se presentan como varias isoformas que difieren en subunidades, la función, y la ubicación. Por ejemplo, TRAPPCI está incluida en el reclutamiento de vesículas derivados del ER a la cis-Golgi [8], y se requiere TRAPPCII [7] para el transporte retrógrado desde los endosomas. Eva Loh
et al.
Reveló que Bet3, el componente más conservada del complejo Trapp, se expresa en ocho diferentes tejidos de ratón, existe en dos piscinas distintas en el citosol y funciones durante el transporte ER-Golgi [10] . Por lo tanto, TRAPPC4 puede jugar un papel en el transporte nucleocytoplasmic en el cáncer colorrectal, pero este mecanismo requiere un estudio adicional.
PDGF puede señal a través de la vía de ERK-MAPK y activar la cascada de ERK a través de tirosina quinasas receptoras. Se encontró que después del tratamiento con PDGF, el efecto de TRAPPC4 en pERK1 /2 era completamente o parcialmente oscurecida. Los resultados nos dio una indicación de que TRAPPC4 puede estar implicado en ciertos pasos de la activación mediada por PDFG de la ERK1 /2 en cascada. En cuanto a ERK1 /2 fosforilación, el efecto de TRAPPC4 puede no ser tan potente como la de PDGF. Sin embargo, el mecanismo detallado aún no se ha investigado a fondo.
Por otra parte, se encontró que TRAPPC4 afectada la proliferación celular, así como la muerte celular. El agotamiento de TRAPPC4 inhibió el crecimiento celular y la apoptosis inducida, mientras que su sobreexpresión contribuyó a la celda de crecimiento. Se informó de que activa ERK1 /2 interactúa con algunos sustratos, tales como Phosphoprotein enriquecido en astrocitos 15 (PEA-15), y la proteína de muerte asociado quinasa (DAPK), y es secuestrado en el citoplasma [24]. Supresión de la PEA-15 estimula la proliferación marcadamente ERK-dependiente y la transcripción de genes; mientras PEA-15 bloquea la sobreexpresión de la proliferación a través de su capacidad para unirse y secuestrar ERK1 /2 en el citoplasma [25]. DAPK secuestra ERK1 /2 en el citoplasma mediante la interacción con ERK a través de un D-dominio en el mismo la muerte. y la interacción promueve la función proapoptótico de DAPK [26]. Por lo tanto, la inhibición de ERK1 /2 de localización nuclear afecta las señales de supervivencia ERK1 /2 mediada y, además, aumenta las señales proapoptóticos. En nuestro estudio, después de la caída de TRAPPC4, la disminución de la activación de ERK1 /2 se correspondía con menos de localización nuclear, que en última instancia puede conducir a surpression crecimiento y la apoptosis. Considerando que, más localización nuclear cuando TRAPPC4 sobreexpresa puede promover el crecimiento celular.
La mayoría de la investigación previa sobre la familia Trapp se centró en la levadura y normales células o tejidos de mamíferos [4], [5], [8] , [10]. Para nuestro conocimiento, sólo la expresión de TRAPPC2 se ha investigado en la enfermedad de SEDL [27]. Hasta la fecha, la ubicación de subunidades Trapp principalmente se ha informado en el citoplasma de células de mamíferos [9], [10]. Según los informes, TRAPPC4 se encuentra en espinas de las neuronas cultivadas del hipocampo [4], pero se ha obtenido poca información sobre su papel en la enfermedad. Aquí, analizamos la expresión TRAPPC4 en el epitelio humano normal del colon, adenoma, y los tejidos de adenocarcinoma por inmunohistoquímica. Los resultados revelaron que TRAPPC4 nuclear aparece después de tejido epitelio normal progresa a adenoma y adenocarcinoma. Por lo tanto, la alteración en la localización de TRAPPC4 puede estar relacionado con la carcinogénesis colorrectal. La pregunta es si puede ser el resultado de mutaciones de genes o modificaciones estructurales que se plantean en TRAPPC4 durante la carcinogénesis colorrectal. Mientras tanto, pERK1 /2, que se localiza en el núcleo en nuestro estudio, se incrementó en comparación con los tejidos adenocarcinoma adenoma y tejidos epiteliales normales. Como se mencionó anteriormente, la función principal de la familia Trapp es en la regulación del transporte vesicular, y TRAPPC4 está implicada en el tráfico de membrana en sitios post-sinápticas en neuronas. Cabría preguntarse si el mecanismo de localización nuclear de TRAPPC4 en el CCR es relevante para el transporte de pERK1 /2 desde el citoplasma al núcleo. De hecho, se demostró que el complejo Trapp para que actúe como factor de intercambio de nucleótidos de guanina (GEF) para Ypt1 y Ypt31 /32 GTPasas tanto
in vitro e
in vivo
[28], [29 ]. Mientras Ypt1 GTPasa se requiere en el cis-Golgi para la segmentación y fusión de vesículas derivados del ER [30], [31], las funciones de los Ypt31 /32 GTPasas también son esenciales para la formación de vesículas trans-Golgi [32] . Queda por ver si existe un mecanismo molecular similar para TRAPPC4 en el CCR en aún más estudios.
En conclusión, nuestro estudio demostró la interacción de TRAPPC4 con ERK2. En el cáncer colorrectal, que no sólo regula la activación de ERK1 /2, pero también afecta a la distribución de activado ERK1 /2. Se modula la proliferación celular y la apoptosis en células de CRC. En consideración con los estudios previos, se especula que, en el CCR, TRAPPC4 se une y activa ERK1 /2, así como participa en el transporte nuclear de pERK1 /2. Cuando se agota TRAPPC4, menos ERK1 /2 es fosforilada, y relativamente más pERK1 /2 permanece en el citoplasma, lo que conduce a la supresión de la proliferación celular y la apoptosis. Cuando se sobreexpresa TRAPPC4, se activa más ERK1 /2, y aún más se transporta en el núcleo, por último conduce a un mayor crecimiento de las células (Fig. 7). Se requerirán más estudios para aclarar este mecanismo molecular propuesto.
señales extracelulares, tales como PDGF, activar cascadas de ERK (MER /ERK RAS /RAF /) a través de los receptores tirosina quinasas (RTK) y utimately regular la proliferación celular y la apoptosis. TRAPPC4 une y activa ERK1 /2, así como participa en el transporte nuclear de pERK1 /2. Cuando se agota TRAPPC4, menos ERK1 /2 es fosforilada, y relativamente más pERK1 /2 permanece en el citoplasma, lo que conduce a la supresión de la proliferación celular y la apoptosis. Cuando se sobreexpresa TRAPPC4, se activa más ERK1 /2, y aún más se transporta al interior del núcleo, finalmente, conduce a un mayor crecimiento de las células.
Materiales y Métodos
Los plásmidos y transfecciones
La larga duración ERK1, ERK2, y TRAPPC4 ADNc se obtuvieron mediante PCR a partir de una biblioteca de ADNc humano. Para la levadura de dos ensayos de híbridos, fragmentos de longitud completa de ERK1 y ERK2 ADNc se clonaron tanto en el marco con el
Sfi sitio
I en el plásmido pGB. Para los ensayos de unión, los de larga duración TRAPPC4 cDNA fue clonado en pCDEF-Myc y de larga duración ERK2 cDNA fue clonado en pCDEF-Flag. ERK2 se subclonó en pGEX-5X para producir glutatión
S
transferasa (GST) proteínas de fusión, y TRAPPC4 se subclonó en pET-28a para producir sus proteínas de fusión.
Para el co-inmunoprecipitación experimentos abajo, 1,6 × 10
6 células /pocillo de placas de 6 cm fueron co-transfectadas con vectores pCDEF-Myc-TRAPPC4 y pCDEF-Flag-ERK2 expresar TRAPPC y ERK2, respectivamente, utilizando un plásmido: relación de reactivo de transfección de 1:4 (4 g cada plásmido). controles de vectores vacíos fueron pCDEF-Myc o pCDEF-Flag (ambos de Shanghai Genómica).
Se llevó a cabo la levadura de dos ensayos de híbridos
La levadura de dos híbridos para identificar las proteínas ERK1 y ERK2 por interactuar utilizando el sistema de Clontech Matchmaker de dos híbridos (Cat.#K1612-1) según las instrucciones del fabricante. plásmidos cebo PGB-ERK1-G y PGB-ERK2-G se transformaron en la cepa de levadura Y190. Los efectos de toxicidad y pruebas de auto-activación se realizaron utilizando un ensayo de β-galactosidasa. Levaduras transformadas con plásmidos cebo se cultivaron y se tamiza con lo humano HeLa Matchmaker biblioteca de cDNA (Clontech, Cat#HL4048AH) y luego cultivadas en Leu-Trp-His placas para la selección y validación utilizando el ensayo de ß-galactosidasa. Se extrajeron los plásmidos de las colonias positivas, amplificado en bacterias y co-transformó de nuevo en la levadura junto con los plásmidos cebo para realizar más pruebas en ensayos de ß-galactosidasa. Los plásmidos de éxitos positivos fueron secuenciados y analizados.
se realizó co-inmunoprecipitación (co-IP) y GST-menú desplegable análisis
Co-inmunoprecipitación como se describe anteriormente [33]. Tanto la entrada y muestras IP se analizaron por Western blot usando diversos anticuerpos en las siguientes diluciones: Bandera de anticuerpos (1:1000), myc (1:1000) Bandera-HRP de anticuerpos (1:4000), Myc-HRP de anticuerpos (1 :2000) (todos de Shanghai Genomics, Shanghai, china), y de cabra anti-ratón IgG-HRP de anticuerpos (1:5000) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, EE.UU.). La co-transfección de vectores de expresión para p16 y TSSK1 (Shanghai Genomics, Shanghai, China) se utilizó para el control de co-inmunoprecipitación positivo.
proteína GST y proteínas de fusión GST-ERK2 se expresaron y se purificaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (GE Healthcare, Londres, Reino Unido). Para el ensayo de pull-down, 1-5 mg de las proteínas GST o de fusión GST se mezclaron con 40 ml de una suspensión de 50% de perlas de glutatión-Sepharose 4B durante 2 h en tampón de unión [25 mM HEPES-NaOH (pH 7,5) , MgCl 12,5 mM
2 10% de glicerol, DTT 5 mM, 0,1% NP-40, KCl 150 mM y 20 mM ZnCl2]. Entonces 1-5 mg de 6 × Sus-TRAPPC4 proteínas de fusión, seguido de la incubación durante otras 2 h. Los sedimentos se lavaron extensamente, y se identificaron mediante transferencia de Western con 6xHis de anticuerpos (1:1000) (Abcam, Cambridge, UK).
Cultivo celular
La célula de cáncer derivado de colon SW1116 línea (adquirido en el Banco de células de Type Culture Collection de la Academia de Ciencias de china, Shanghai Instituto de Biología celular, Academia de Ciencias de china) fue mantenido por pases seriados en medio RPMI 1640 que contenía suero de ternera fetal inactivado por calor al 10% (FCS), 100 unidades /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina.