Resumen ¿Cuáles son conocidos
Antecedentes
Las células T para participar en la respuesta a las células tumorales y reaccionan con la citotoxicidad y la liberación de citoquinas. Al mismo tiempo los tumores establecido mecanismos versátiles para silenciar las respuestas inmunes. La interacción está lejos de ser comprendido por completo. En este estudio se muestra contactos entre las células tumorales y linfocitos que revelan características novedosas en la interacción de las células T y las células cancerosas de una manera no descrita previamente.
Métodos /De
Los experimentos se basan en el el uso de un colorante fluorescente hidrófilo que se produce libre en el citosol y por lo tanto la transferencia de citosol fluorescente de una célula a otra se puede observar usando citometría de flujo. Las células tumorales de líneas celulares de diferente origen o de las células de carcinoma hepatocelular primario (CHC) se incubaron con linfocitos de ratones y humanos. Esta exposición provocó una absorción dependiente de contacto de citosol derivado tumor por linfocitos - incluso en CD4
+ células T y células B murinas - que no pudo ser detectado después de la incubación de los linfocitos con las células sanas. La interacción fue uno directo, que no requieren la presencia de células accesorias, pero independiente de la citotoxicidad y el compromiso de TCR.
Microscopía electrónica divulgada 100-200nm grandes lagunas en las membranas celulares de las células conectadas que se separaron viable y reveló asombrosa resultado. Mientras que los linfocitos fueron inducidas a proliferar de manera a largo plazo, las células tumorales fueron sometidos a una ruptura temporal en la división celular. El
in vitro
resultados fueron confirmados
in vivo
utilizando un modelo murino de la leucemia linfoblástica aguda (LLA). La detención de la proliferación del tumor resultó en una supervivencia prolongada significativa de los ratones expuestos.
Conclusiones
Los contactos célula-célula reportados revelan nuevas características es decir, la activación de flujo citosol entre las células, incluyendo proteínas activas biológicas que influyen en el ciclo celular y el comportamiento biológico de las células receptoras. Esto añade un aspecto completamente nuevo en el tumor de la inmunología inducida
Visto:. Hardtke-Wolenski M, L Kraus, Schmetz C, Trautewig B, F Noyan, Vondran FWR, et al. (2013) El intercambio de contenido citosólico entre las células T y las células tumorales activa las células T CD4 y el crecimiento del cáncer Impide. PLoS ONE 8 (10): e78558. doi: 10.1371 /journal.pone.0078558
Editor: R. Lee Mosley, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 30 de abril de 2013; Aceptado: 19 de septiembre de 2013; Publicado: 24 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Hardtke-Wolenski et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por Novartis Pharma GmbH y la concesión HILF de la Escuela de Medicina de Hannover. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Este trabajo está financiado por la subvención HILF de la Escuela de Medicina de Hannover y Novartis Pharma. Sin embargo, esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El cáncer es como esconder y buscar entre las células tumorales y la respuesta inmune . El sistema inmune cuando se desafió por el cáncer, sin embargo, se enfrenta con el problema de que necesitan ser controlados en su malignidad células auto-expresión de MHC. Sin embargo, el interruptor de las células normales en células tumorales está acompañada por la expresión de péptidos específicos de tumores capaces de activar las células T (revisado por [1]). La mayoría de estos péptidos descendientes de proteínas que no se producen exclusivamente por células tumorales, pero modificados en su estructura. La respuesta de células T mantiene el tumor en un estado estable o en estado latente [2,3]. Ha sido una hipótesis aceptada de que la mayor parte de las respuestas antitumorales están mediadas por células CD8
+ células T y CD4
+ células T están restringidos ya sea para ayudar a CD8
+ células T para la citotoxicidad eficaz [4, 5] o células dendríticas primos (DC) para mejorar la respuesta de las células CD8
+ células T [6,7].
En contraste con este dogma informes recientes revelaron la participación de células CD4
+ T como potentes células efectoras con capacidad de acción directa contra las células tumorales que conducen a la regresión del tumor [8-10]. Se ha demostrado que la transferencia de tumor específico de antígeno CD4
+ T células en desafiados pero los ratones inmunodeficientes pueden causar regresión completa del tumor, sin la necesidad de CD8
+ células T, células o B asistencia de células NK [10 ]. Sin embargo, la presunción para todos descrito potentes respuestas de células T es o bien una especificidad transgénico del receptor de células T (TCR) contra tumorales-antígenos o el aislamiento y la expansión de los linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) conocidos.
Así, la activación de la respuesta inmune se puede observar pero en el curso del crecimiento del tumor se produce una edición de la respuesta inmune. Esto incluye de equilibrado y de escape finalmente inmune de las células tumorales por inducción de la resistencia [11]. Esta evasión inmune eficiente de los tumores se debe a la creación de un microambiente que atrae a las células de origen mieloide supresoras y células T reguladoras. Además la citoquina y la composición de quimioquinas, así como la expresión de ciertos ligandos en las células tumorales pueden convertir células efectoras en células reguladoras o conducirlos en anergia y apoptosis (revisado por [11,12]). El conocimiento de este ir y venir del sistema inmunológico y el cáncer de
in vivo
todavía está lleno de lagunas por lo tanto cada interacción adicional de las células T con las células tumorales ayuda a entender la respuesta y mecanismos de escape.
En este estudio se informe de una interacción hasta el momento no se ha descrito entre las células tumorales y las células T, CD4
+ y CD8> + T. Esto incluye la formación de contactos con diferentes características de la sinapsis inmunológica. La formación de la sinapsis ha sido ampliamente investigado e implica varias etapas incluyendo pseudópodos, la formación de microtúbulos y co-localización de las mitocondrias y del retículo endoplásmico [13]. Todos estos atributos no están presentes en los contactos que hemos observado. En lugar de los contactos principales para el intercambio citosol entre los linfocitos y las células tumorales
in vitro
y
in vivo
inducen un descanso en la proliferación de las células tumorales. En contraste con los informes anteriores de estos contactos se producen independientemente de la presencia de células presentadoras de antígeno. Como consecuencia de estas interacciones, la división de las células T en curso se induce en los linfocitos que incorporan citosol derivado tumor. Este fenómeno específico es un nuevo aspecto de la interacción entre el sistema inmune con células tumorales.
Resultados
Contactar con la formación entre las células tumorales y las células T induce flujo de citosol no asociada con cytotoxocicity
Una breve nota: Los experimentos que se presentan en la Figura 1 muestra la interacción de las PBMC humanas con la línea de leucemia de células B porcino L23. Al principio nos preguntamos si las células de esta línea celular porcina son dianas para las células NK y T citotóxicos humanos y destinados para analizar esto en citometría de flujo como se ha realizado previamente la utilización de parásitos como dianas para las células NK [14,15]. Como una coincidencia encontramos la adaptación de la fluorescencia de las células T después de la exposición a las células L23. Resultó además que este efecto no es un fenómeno específico xenogénico, pero se puede observar con linfocitos humanos y murinos y varios tumores de diferente origen. Sin embargo, este modelo reveló los resultados más significativos y por lo tanto es el más adecuado para reflejar esta nueva interacción entre las células T y las células tumorales. Somos conscientes del sistema artificial, ya que las PBMC humanas y células tumorales porcina es improbable que se encuentran juntos en condiciones naturales. Por lo tanto, hemos limitado los datos utilizando células porcinas a la Figura 1 y posteriormente se cambió a un modelo de ratón.
(A) 2x10
6 PBMCs humanos o purificada CD4
+ células T se incubaron con 2x10
6 CMFDA-etiquetados L23 células durante 4 h, posteriormente se tiñeron para CD3, CD4 y CD8 y analizadas por citometría de flujo, respectivamente. La exposición de los linfocitos a las células L23 dio lugar a una inclusión de la fluorescencia en numerosas células T.
(B) Resumen de cuatro experimentos independientes realizados como se describió anteriormente. La frecuencia de células T fluorescente verde se relaciona con la población mayor de PBMCs.
(C) Las PBMC se pre-incubó con cloruro de estroncio 5 mM para inducir la desgranulación de antes de la exposición a L23 células. Adpation de la fluorescencia se evaluó en las células CD4
+ y CD8
+ células T.
(D) 2x10
6 células T purificadas y 2x10
6 L23 se incubaron durante 4 h junto o separados por transwells (TW), los L23 células marcadas en la parte inferior de una placa de 96 pocillos de fondo redondo y las células T se coloca en los cultivos polarizados.
células (e) purificada CD4
+ T se incubaron con células L23 durante 4 h, fijos y preparados para microscopía electrónica (EM). Escaneado (i) y EM de transmisión (ii-iv) revelaron contactos intensos. En la transmisión de flujo de EM de citosol se visualizó por el electrón denso citosol de linfocitos que distribuye desde el sitio de contactos en la célula tumoral (flechas en (ii) y (iii)). En los huecos de magnificación más altos en las membranas celulares se pudo detectar (flechas en iv). Las lagunas dehisced longitud de hasta 200 Nm permitiendo el libre flujo de los componentes de citosol y solubles, pero no de las estructuras celulares, por ejemplo, mitocondrias. Sin embargo, la agregación de las mitocondrias en el área de formación de contacto podría ser una indicación de los procesos que consumen energía.
células (F) de CD4
+ T fueron ordenados después de la incubación con marcado con CMFDA luciferasa-L23 transgeneic células en las células T-verdes fluorescentes y no fluorescentes. 5x10
4 separaron las células T se incubaron subsiguientemente en medio suplementado con 100μg /ml de luciferina en placas de 96 pocillos de fondo redondo. La luminiscencia se evaluó después de la incubación 30 min utilizando el análisis de IVIS. 5x10
4 transgeneic L23 células sirvió como control de la intensidad de la luminiscencia.
Los resultados se muestran como imágenes representativas y la dispersión de las gramos o resumiendo 4 experimentos independientes como media ± SEM.
Para el marcaje fluorescente de células se utilizó CellTracker Green (diacetato de 5-cloro-methylfluorescin [CMFDA]). CMFDA inicialmente es una molécula no fluorescente capaz de pasar la membrana celular. En las células viables CMFDA se escinde en la forma fluorescente, fuertemente hidrófila la construcción de una vaina de agua voluminoso. Esto evita su lanzamiento a través de la membrana celular intacta de células viables. CMFDA se puede utilizar como un marcador de viabilidad ya que en caso de la lisis citotóxica, las células marcadas se vuelven no fluorescente debido a la pérdida de CMFDA contienen citosol [14]. Un análisis de citometría de flujo es factible si las células efectoras y diana difieren notablemente en tamaño y por lo tanto pueden distinguirse en el delantero-lateral de dispersión (Figura S1). Sin embargo, en lugar de pérdida de fluorescencia se observó una absorción de fluorescencia por los linfocitos después de co-cultivo de las células tumorales con PBMCs que indica una transferencia de moléculas CMFDA de una célula a la otra (Figura 1A). La adaptación de la fluorescencia se limita casi exclusivamente a las células T, ya que sólo una fracción muy pequeña de CD3
- células se hicieron fluorescente. Es de destacar que la interacción observada de las células T con las células tumorales no requiere células espectadoras como se ejemplifica por la exposición de las células CD4 altamente purificada
+ células T de células L23. También esta configuración indujo una relación pronunciada de células verdes fluorescentes (Figura 1A).
A medida que la transferencia de mancha espectáculos, esta interacción se refería a un número considerable de células T: En promedio el 20% de las células CD4
+ y el 7% de las células CD8
+ T células entre PBMCs a granel se convirtió en verde fluorescente (Figura 1B). Este fenómeno sólo se explica por la absorción de citosol que contiene las moléculas CMFDA de una célula a la otra. Es notable que las células NK no reveló signos de recopilación de tumor fluorescente citosol deriva a pesar de que exhiben una fuerte actividad citotóxica contra las células tumorales L23 (Figura S2). Sin embargo, la citotoxicidad parece ser una explicación razonable para el efecto observado. Hemos probado la posibilidad de citotoxicidad ser responsable de intercambio de citosol mediante el tratamiento de las PBMC con cloruro de estroncio (SrCl
2), un reactivo que induce la exocitosis de gránulos líticos [16]. Por lo tanto, el tratamiento con SrCl
2 hojas de células citotóxicas ineficaz. Sin embargo, los linfocitos aún revelaron una absorción de CMFDA (Figura 1C). Esto da cuenta de CD4
+ y CD8 + células T
, que es una indicación de que la citotoxicidad no es el agente para el intercambio de citosol. De hecho, aunque sólo ligeramente se observó un aumento de la adaptación de fluorescencia después de SrCl
2 de tratamiento en ambas poblaciones de células T. Sin embargo, la formación de contactos era obligatorio para el efecto observado. las células T y las células tumorales se incubaron ya sea en co-cultivo o separados por cultivos polarizados. células T fluorescente verde sólo podían ser detectados después de la exposición directa a las células tumorales, pero no en las culturas transwell (Figura 1D).
Las lagunas en las membranas celulares de las células tumorales y linfocitos naive permite la transferencia de citosol incluyendo moléculas de alto peso molecular y de inducir la proliferación de las células T
más nos hemos centrado en la interacción de CD4
+ células T con las células tumorales por la visualización de la formación de contacto. Microscopía electrónica de barrido (SEM) reveló la naturaleza intensa de los contactos celulares que conducen a la polarización de los socios tumor de células de linfocitos interactúan (Figura 1E i). Además, la microscopía electrónica de transmisión (TEM) mostró, incluso a bajo aumento, un flujo de electrones densa citosol de la célula T en la célula de tumor que surgió con el máximo aumento para ser habilitado por vacíos en la membrana celular de ambos socios (Figura 1E ii-iv). Estos huecos extendidos áreas entre 100-200nm y por lo tanto debe permitir la transferencia de más de componentes de peso molecular solo bajos de el citosol, sino también moléculas con la función enzimática de alto peso molecular. En consecuencia, el paso de la luciferasa de la proteína de 30 kDa se evaluó mediante co-cultivo de PBMCs con retroviral luciferasa transducidas que expresan L23 células. Las células transducidas se marcaron con L23 células CMFDA y T se separaron después de la exposición a las células tumorales que distinguen el verde fluorescente de la no fluorescente CD4
+ células T. Las células T purificadas se incubaron posteriormente con luciferina para evaluar la actividad enzimática. De hecho, las células T con la absorción de CMFDA revelaron luminiscencia mientras que las células T no fluorescentes fueron negativos para la actividad de luciferasa (Figura 1F). Esto demostró claramente una transferencia de citosol asociado con un intercambio de moléculas que sustentaban actividad biológica en la célula receptora. Por lo tanto, es de interés para seguir las consecuencias de contactos para los socios si los componentes citosólicos mantienen su función biológica. Básicamente lo hicimos en el modelo de ratón
in vitro
y
in vivo
pero no encontró datos de apoyo también con linfocitos humanos y células tumorales porcinos.
Nos separamos y no fluorescente fluorescente CD4
+ células T después de la exposición a las células tumorales marcadas con CMFDA y células aisladas se cultivaron sin ninguna estimulación adicional en medio durante 5 días. Encontramos proliferación pronunciada de las células T con incorporación de citosol derivado tumor (Figura S3). la expansión de células T puede ser inducida por receptor de células T dependiente y vías independientes. Se ha informado de que las células T internalicen la TCR después de la exposición al anticuerpo monoclonal anti CD3 (mAb) clon OKT3 bajo ciertas condiciones [17]. Por lo tanto, se aplicó el protocolo en nuestros experimentos y verificó la desaparición de TCR de la superficie celular de las células T. Sin embargo, la absorción de la fluorescencia no fue abrogada por el tratamiento. Por otra parte, el bloqueo de las moléculas MHC II porcinos con mAb MSA-3 dejaron el resultado de la transferencia de citosol entre los linfocitos y las células tumorales virtualmente no afectados. Por último, pero no menos importante, para la captación de citosol los linfocitos no tienen que ser pre-activado. células T vírgenes revelaron la capacidad de someterse a los contactos con las células tumorales al menos en el mismo grado como IL-2 o células activadas por rayos X L23 pre-expuesto T (todos los datos que se muestran en la figura S3).
Intercambio de citosol no se limita a una determinada especie y tipo de células tumorales
conversión al modelo de ratón, se utilizó una línea de células de tumor muy agresivo BM185, aislados de ratones BALB /c que sufren de ALL [18], para validar la universalidad de los contactos observados entre las células T y las células tumorales. La expansión en el modelo de ratón ofrece, además, la posibilidad de
in vivo
verificación.
La microscopía electrónica y análisis de citometría de flujo confirmó que los contactos y la transferencia de citosol entre las células T murinas y células BM185 (Figura 2A y la Figura S4). Es de destacar que, en contraste con PBMCs humanos, entre esplenocitos murinos a granel una población bien detectable de CD3
- células revelaron la capacidad de interactuar con las células tumorales resultantes en la absorción de citosol. tinción adicional de esplenocitos con CD19 identifica la población en las células B, colocando puertas en el CD3
- células que eran casi completamente CD19
+ (Figura 2B), mientras que en línea con los resultados utilizando células humanas, células NK no eran involucrado en la transferencia de citosol (datos no mostrados).
(a) 2x10
6 esplenocitos incubados con 2x10
6 células BM185 marcadas con CMFDA de 4 h y se analizaron para la captación de fluorescencia por las células T. Del mismo modo que las PBMC humanas el modelo de ratón reveló verde fluorescente CD4
+ y CD8 + T. Además, una población verde fluorescente bien detectable que se extiende la población de células T se observó dentro de los esplenocitos.
(B) tinción de esplenocitos con CD3 y CD19 después de la exposición a las células tumorales identificados la población de células no T capaz para la absorción citosol como células B.
(C) Resumen de los cuatro experimentos de incubación independientes de esplenocitos con células de diferentes líneas celulares. células BNL no son derivados del tumor, mientras que las otras líneas son células tumorales.
(D) Análisis de la expresión de MHC II de las respectivas líneas de células BM185, KLN-205 y BNL CL.2. El nivel de expresión no se correlacionó con el resultado de la transferencia de citosol
(E) En contraste con
células no afectadas CD4 + T (CMFDA
-).,
+ células T CD4 revelando una absorción de citosol derivada del tumor (CMFDA
+) mostró signos de activación de acuerdo con el aumento de expresión de CD25 y CD69 marcador de activación temprana mientras que CD62L se redujo ligeramente. Las células se incubaron como se describe anteriormente (A) con posterior tinción de células T CD4 y los marcadores de activación. El patrón de activación era diferente a la estimulación con 2μg /ml de ConA. análisis de proliferación
(F) de 1x10
4 células T purificadas que revelan la absorción CMFDA después de 4 h de exposición de los esplenocitos a las células BM185 etiquetados. Para el control purificado CD4
+ células T de ratones ingenuos se cultivaron en medio ya que se realizó con células T clasifican para 4 días y 16 h adicionales con
timidina 3H antes szintilization.
Los resultados se muestran como representativos de dispersión-gramas o resumir al menos 3 experimentos independientes como media ± SEM.
En general, las células T murinas tenían una tendencia menos pronunciada para interferir con el tumor las células en comparación con las células T humanas. Incluso con L23 células sólo una media de 10% de CD4
+ T las células se convirtieron en verde fluorescente y esto unido a una muy alta desviación estándar. Sin embargo las células L23 indujeron la más alta absorción de CMFDA (datos no mostrados). Además, otras líneas de células murinas incluyendo los KLN-205 células de carcinoma de pulmón, células del hígado BNL CL.2 embrionarias, células mastcytoma P815, células de mieloma de células J558L B, células tumorales C1498 mieloide y las líneas celulares de tumor de hígado HEPA 1c1c7 y HEPA 1-6 se ensayaron. Con la excepción de las células BNL, se encontró variable, pero también detectable transferencia CMFDA para las diferentes células tumorales (Figura 2C). Curiosamente, a pesar dividiendo de forma permanente, las células BNL CL.2 no se consideran como células tumorales clásicos [19]. La resistencia de las células CL.2 BNL, ofrecida por el modelo de ratón la oportunidad de validar el TCR independencia y tumor especificidad del efecto. Se evaluaron los niveles de expresión de MHC II en las diferentes líneas celulares. Resultó que BM185 y BNL CL.2 expresaron alto nivel de MHC II mientras KLN-205 células fueron completamente negativas para MHC II (Figura 2D). Así, la interacción TCR /MHC parece no ser obligatorio para el intercambio de citosol. Esto también se pone de relieve por la transferencia de citosol observada entre células B y células tumorales. Además, hemos realizado experimentos utilizando la hemaglutinina (HA) de las células BM185 -transduced y compararon el resultado de la transferencia de citosol después de la exposición a la de tipo salvaje (wt) BALB /c y 6.5 ratones transgénicos. El ratón 6,5 tiene una población característica de alrededor de 20% de las células CD4 T que expresan un TCR específico de HA. Ambas cepas mostraron una tendencia de aumento de la frecuencia de células que muestran el intercambio de citosol después de la exposición a BM185-HA en comparación con células BM185. Sin embargo, los esplenocitos derivados de ratones 6,5 no mostraron aumento de la frecuencia de células que muestran el intercambio de citosol con las células BM185 HA-transgénicos (Figura S5).
Sin embargo, después de la exposición a las células tumorales células T mostraron los primeros signos de activación. La incubación de esplenocitos con BM185 resultó en la regulación de la CD25 marcadores de activación y CD69 y la alteración marginal de la expresión de CD62L en las células T que revela una absorción de citosol derivado tumor mientras que las células T sin adaptación de fluorescencia mostró niveles de expresión de marcadores de activación comparable a linfocitos incubados medianas (Figura 2E). Los niveles detectados de CD25 en medio incubaron y CMFDA
- células T se debió a la expresión de CD25 constitutiva en las células T reguladoras así los niveles aumentaron durante este fondo eran signos de activación. La activación de tasación de las células T se combina con la proliferación de los linfocitos al igual que se pudo observar con células T humanas que interactúan con L23 células (Figura 2F).
transferencia detectable de citosol in vivo
La verificación de la transferencia citosol
in vivo
es de gran interés para excluir la posibilidad de que el intercambio citosol es única debido a un
in vitro
artefacto. Por lo tanto, se inyectaron células BM185 marcadas con CMFDA por vía intravenosa (i.v.) en ratones BALB /c y los ratones se sacrificaron 6 h después. Posteriormente el bazo, los ganglios linfáticos y la médula ósea se verificaron para las células BM185 pero sólo en el bazo se pudieron detectar numerosas células tumorales (datos no mostrados) que se combinó con la aparición de verde fluorescente CD4
+ T células (Figura 3A) . En línea con el
in vitro
resultados, también
in vivo
linfocitos con la afinidad de captación citosol se podían encontrar en las poblaciones de CD8
+ células T y células B (Figura 3B ).
(A) 1x10
7 CMFDA-etiquetado BM185 se inyectaron por vía intravenosa. 6 h más tarde los ratones fueron sacrificados y se homogeneizó el bazo, los ganglios linfáticos y la médula ósea. 5x10
7 células se tiñeron para CD4 y se contaron en citometría de flujo y se evaluó la proporción de linfocitos fluorescentes verdes.
(B) Valoración del fenotipo de esplenocitos verde fluorescente 6 horas después de la administración i.v. aplicación de 1x10
7 CMFDA-etiquetado BM185. Además de CD4
+ y CD8
+ células T, también
In
las células B in vivo gratis (B220
+ células) revelaron la captación CMFDA.
Los resultados se muestran como representativos de dispersión-gramos de 3 experimentos independientes.
Las células tumorales dejan de proliferar después de la absorción de T citosol derivado de las células que conduce a la prolongación de la supervivencia de los ratones
El flujo de citosol no es un camino de una manera, pero se puede observar en ambas direcciones. Por lo tanto, las células T no sólo se convirtió verde fluorescente después de la exposición a las células tumorales marcadas con CMFDA sino también una proporción de células tumorales se convirtió en verde fluorescente después de la incubación con linfocitos marcados con CMFDA (Figura 4A). Para seguir la transferencia de células BM185 citosol de linfocitos derivados se marcaron con CellVue Maroon, un colorante que se incorpora en las regiones de lípidos de las membranas con la observación resaltada del fabricante de la transferencia no específica mínima entre células. Mediante la exposición de las células tumorales CellVue marcado a los linfocitos hemos sido capaces de detectar una fracción positiva con fluorescencia CellVue inducida en CD4
+ células T que indica una transferencia de partes de la membrana celular de las células tumorales a la superficie de linfocitos (Figura 4B ). Este es convincente validación de la impresión de la fusión de las membranas celulares como se demuestra por TEM (Figura 2 y la Figura S4).
(A) de células se marcaron con BM185 CellVue para distinguir la población de células tumorales de linfocitos marcados con CMFDA. Las células tumorales y los esplenocitos se incubaron en el mismo número para 4 h y la absorción de CMFDA se evaluó por citometría de flujo. . Más adelante, BM185 se separaron por clasificación de células en las células no fluorescentes y fluorescentes
(B) Evaluación de la transferencia de componentes de la membrana de CellVue etiquetado BM185 a los linfocitos después de la exposición de las células en una ración de 1: 1 para 4 marido. CellVue incorpora en regiones de lípidos de las membranas celulares.
(C)
3H incorporación de timidina de las células BM185 expuestos a esplenocitos marcados con CMFDA de BALB /c y posteriormente separadas por FACS de células de clasificación en las células tumorales que intercambia citosol con linfocitos de ratón (CMFDA
+) o aquellos que no se vio afectado (CMFDA
-). Las células se cultivaron durante 3 días en placas de 96 pocillos y 16 h después de la adición de timidina radiactiva.
(D) Curva de supervivencia de ratones BALB /c después de la administración i.v. inyección de 1x10
4 células BM185 (5 ratones por grupo /experimento, la curva de supervivencia representa dos experimentos independientes, por lo tanto n = 10) con o sin absorción de CMFDA después de la exposición a esplenocitos murinos marcados con CMFDA. El curso de la BM185 provocó la leucemia es altamente reproducible. La supervivencia de las células BM185 sin la absorción de citosol de linfocitos derivados corresponde por completo a esta conocida declive de viablitiy. En contraste, los ratones inyectados con BM185 incorporan esplenocitos citosol derivado sobrevivieron significativamente más largo (p ≤ 0,0042).
Los resultados se muestran como representativos de dispersión-gramas o resumir 2-4 experimentos independientes como media ± SEM.
Nos separamos células BM185 en fluorescente y no fluorescente después de la exposición a los esplenocitos murinos . Las células tumorales aisladas se cultivaron durante 4 días con la posterior evaluación de
3H-timidina. Sorprendentemente, una drástica disminución de la proliferación de las células BM185 después de la absorción de citosol de linfocitos derivados se pudo medir (Figura 4C). Esto fue sólo una interrupción temporal del ciclo celular. 7 días de cultivo revelaron así la proliferación detectable incluso de las células tumorales que se sometieron a transferencia de citosol (datos no mostrados).
La ruptura de la división de las células tumorales podría tener posibles consecuencias para la supervivencia de ratones BALB /c. Es de destacar que las células BM185 son altamente maligno que causa un curso agresivo de todos. Incluso una dosis baja de 10
4 células conduce a la muerte dentro de los 20 días. BM185 células que parecían no fluorescente después de la exposición a los esplenocitos revelaron un curso altamente reproducible de la mortalidad. En contraste, los ratones inyectados con BM185 que incluía citosol a partir de esplenocitos sobrevivieron significativamente (p ≤ 0,0042) más largo y 20% de los ratones (dos de cada diez) incluso sobrevivió al desafío con células tumorales (Figura 4D).
células T intercambian citosol específicamente con las células tumorales, pero no con las células sanas
La cuestión sigue siendo: ¿Es esta una interacción exclusiva de las células T con las células tumorales? Y si es así: ¿Es el efecto restringido a líneas celulares tumorales o hacer células tumorales primarias también inducir este fenómeno? La última cuestión es de interés ya que la transferencia citosol con células tumorales primarias confirmaría importancia clínica especial cuando se considera que el sistema inmunitario es activado por los contactos de células con células tumorales y el tumor revela una detención temporal en la división celular
.
como realizado con esplenocitos murinos, los experimentos se repitieron por exposición de diferentes líneas de células tumorales a las PBMC humanas. Elegimos células BM185 como una línea adicional xenotrasplante tumoral, células de linfoma de células B humanas y la línea celular HepG2 tumor en el hígado. En comparación con las células L23 el efecto fue menos pronunciado en todas las líneas celulares ensayadas. Sin embargo, una clara absorción de citosol por CD4 + células T
después de co-cultivo con todas las líneas de células tumorales se observó (Figura 5A). Curiosamente, las células inducidas BM185 también dentro de las PBMC humanas una adaptación de la fluorescencia en el 5% de las células CD4
+ células T de CMSP mayor al igual que con los esplenocitos singénicos murinos. Por lo tanto, el intercambio distinta de citosol con L23 células no puede explicarse únicamente por la configuración de xenogénico.
(A) La exposición de PBMC a diferentes líneas de células tumorales CMFDA marcado incluyendo el porcino xenogénico L23 células y células BM185 murinos, así como la humana B linfoma de células T5.1 y Laz, línea de células Jurkat T y la células de hepatocarcinoma HepG2. Con todas las líneas celulares tumorales ensayadas se evaluó una transferencia de citosol. Por el contrario, las PBMC humanas expuestas a PBMC sanos CMFDA marcado del mismo donante de sangre (singénico) o diferentes donantes de sangre (alogénico) no mostraron ninguna adaptación de fluorescencia.
(B) los hepatocitos primarios derivados de tejido sano o HCC y las células HepG2 se cultivaron durante 3 días en la Cámara portaobjetos para obtener una monocapa de las células sueltas. Los hepatocitos se marcaron con CMFDA y se incubaron con 5x10
5 PBMCs de 4 h. Las células se fijaron y se secaron con aire tinción subsiguiente para CD4 (rojo, y sólo HCC y HepG2) y el núcleo (azul). Microscopía reveló una absorción de fluorescencia verde por linfocitos solamente si se expone a las células tumorales. tinción adicional de CD4 confirmó que algunas de las células que participan son células CD4
+ T.
Los resultados se muestran como imágenes representativas y la dispersión de las gramos o resumiendo 3 experimentos independientes como media ± SEM (excepto para (B ) que resume al menos 6 experimentos).
por lo tanto, las células tumorales inducen el intercambio de citosol. Para controlar si este efecto era específico para las células tumorales PBMCs humanos se incubaron con PBMC alogénicas marcadas con CMFDA o PBMCs autólogas derivadas de donantes de sangre sanos. No hemos encontrado absorción de CMFDA comparable cuando se utilizaron las células tumorales (Figura 5A). Es de destacar que los esplenocitos de ratas Lewis criados en condiciones libres de patógenos específicos (SPF) no provocaron la adaptación de la fluorescencia en PBMCs humanos, también (datos no mostrados).
Para excluir la posibilidad de que este efecto se debe a líneas celulares de tumor que a menudo son inducidos y estabilizado por virus (como por L23 células, [20]) células tumorales primarias derivadas de HCC humano se cultivaron con PBMC alogénicas. Desde excluimos la posibilidad de transferencia citosol entre las células donantes alogénicos, los efectos observados se interpretan estar relacionados con las células tumorales. El uso de técnicas microscópicas una captación vigorosa de CMFDA después de la exposición de PBMC a células de HCC era visible. Como control, sanos hepatocitos humanos primarios se incubaron con PBMC que no inducen una transferencia de fluorescencia (Figura 5B).
Apoyo a la Información
Figura S1.