Extracto
Hemos llevado a cabo el primer estudio para determinar el potencial diagnóstico de los monocitos + CD14 ++ intermedios CD16 en comparación con el subconjunto pro-angiogénicos de CD14 + CD16 ++ + Tie2 monocitos expresan TIE2 (TEM ) en el cáncer. Estas poblaciones de monocitos fueron investigados por citometría de flujo en voluntarios sanos (N = 32) y en pacientes con carcinoma colorrectal con enfermedad localizada (N = 24) o metastásico (N = 37). Se determinó aún más los niveles en sangre de citoquinas asociadas con la regulación de los monocitos. Los resultados revelaron el subconjunto de monocitos intermedia a ser significativamente elevados en pacientes con cáncer colorrectal y para mostrar las frecuencias más altas de la enfermedad localizada. El análisis de regresión multivariante identificó monocitos intermedios como una variable independiente significativa en la predicción del cáncer. Con un valor de corte en 0,37% (monocitos intermedios de leucocitos totales) la sensibilidad y especificidad de diagnóstico varió en un 69% y 81%, respectivamente. En contraste, los niveles de TEM fueron elevados en el cáncer localizado, pero no difirieron significativamente entre los grupos y ninguna de las citocinas se correlacionaron con subpoblaciones de monocitos. De interés,
in vitro
análisis apoya la observación de que los monocitos intermedios fueron inducidos de forma más potente de primaria en comparación con las células cancerosas metastásicas que pueden estar relacionadas con el medio inmunosupresor establecido en la etapa avanzada de la enfermedad metastásica. En conclusión, los monocitos intermedios en comparación con TIE2-expresión de los monocitos son un indicador de diagnóstico más sensibles de cáncer colorrectal
Visto:. Schauer D, Starlinger P, C Reiter, Jahn N, P Zajc, Buchberger E, et al . (2012) Los monocitos intermedios pero no TIE2-expresión de los monocitos son un indicador sensible de diagnóstico para el cáncer colorrectal. PLoS ONE 7 (9): e44450. doi: 10.1371 /journal.pone.0044450
Editor: Isaac Yang, UCLA, Estados Unidos de América
Recibido: 25 Febrero, 2012; Aceptado: August 7, 2012; De publicación: septiembre 4, 2012
Copyright: © Schauer et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Ciencia médica del alcalde de la Ciudad de Viena (http://www.wien.gv.at/gesundheit/einrichtungen/med-wiss-fonds/) de ninguna concesión. 8064, concedida a T. Gruenberger. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los monocitos son considerados actores clave en la inmunidad innata ; que representan aproximadamente el 8-10% de los leucocitos humanos y se caracterizan por la expresión de la CD14 co-receptor para el receptor de tipo toll 4 (TLR4) [1]. Un pequeño subconjunto de monocitos de sangre periférica humanos que co-expresa CD16 (receptor Fc gamma III) ha sido identificado en 1988 [2] y se encontró que representan aproximadamente el 10% de los monocitos de sangre total de [3]. La heterogeneidad dentro de este CD16 + población fue posteriormente reconocida [4]. La existencia de 3 subpoblaciones de monocitos en base a la expresión diferencial de CD14 y CD16 ha sido recientemente implementado en la nueva nomenclatura de los monocitos, que distingue entre el CD14 CD16 ++ "clásico", el CD14 + CD16 ++ "intermedia" y el CD14 + CD16 ++ "no clásica" subconjunto de monocitos [5]
los estudios recientes sobre el gen de perfiles de expresión apuntan a una relación de desarrollo entre los tres subgrupos con cambios graduales en los marcadores de la superficie durante la maduración [6] -. [7]. En comparación,
in vitro
cultura y la maduración de los resultados de los monocitos de sangre en un incremento gradual en la expresión de CD16 [8] - [9] que se activa por citoquinas tales como MCP-1 (proteína quimioatrayente de monocitos 1), TGF -β (factor de crecimiento transformante beta), o M-CSF (factor estimulante de colonias de macrófagos) [10] - [12]. Además, las tres subpoblaciones exhiben diferencias funcionales distintas, con monocitos clásicos que muestran el mayor potencial fagocitosis [6]. Por el contrario, los monocitos no clásicos tienen una baja capacidad para la fagocitosis, muestran un comportamiento de patrullaje a lo largo de las paredes del vaso y reaccionan fuertemente contra ácidos nucleicos y virus [13]. El perfil de expresión génica de los monocitos intermedios les ha unido al antígeno de procesamiento y presentación, con respuestas inflamatorias a patógenos bacterianos y lipopolisacárido (LPS) [6], [14]. De interés, marcadores pro-angiogénicos, tales como endoglina, factor de crecimiento vascular endotelial receptor 2 (VEGFR-2) y el receptor de la angiopoyetina TIE2 se sobreexpresan de manera selectiva en el subconjunto de monocitos intermedio [6], [15].
TEM (monocitos que expresan TIE2) inicialmente se han descrito en ratones para comprender una población de monocitos pro-angiogénico que puede mejorar el crecimiento del tumor por la secreción paracrina de factores angiogénicos tales como VEGF y el factor de crecimiento de fibroblastos básico [16]. TEM circulantes se detectan en la sangre periférica de seres humanos sanos y pacientes con cáncer, y se encuentran predominantemente en el intermedio subconjunto de monocitos [15], [17]. Responden a angiopoyetina-2 (ANG-2), una proteína altamente expresada en los tumores, a través del receptor de superficie TIE2 y su co-receptor TIE1 que puede promover la señalización por el derramamiento de un fragmento soluble TIE1 [18] - [19]. Por lo tanto, los TEM preferentemente acumulan en los sitios tumorales incluyendo el carcinoma colorrectal, pero parecen estar ausentes del tejido normal [17].
subconjuntos de monocitos han sido controlados en la sangre humana en el contexto de las enfermedades. Sin embargo, la mayoría de los estudios no discriminaba entre los monocitos no clásicos e intermedios, pero se centró en la distinción entre CD16 subpoblaciones positivos y negativos. Los niveles elevados de monocitos circulantes CD16 + se han reportado para condiciones patológicas tales como la sepsis [20], de la hepatitis B crónica [21], enfermedad de la arteria coronaria [22], y el cáncer [23]. Por lo tanto, los monocitos CD16 + han mostrado potencial diagnóstico y pronóstico en la enfermedad inflamatoria y malignos. Las investigaciones más recientes demuestran que la distinción entre los monocitos no clásicos e intermedias puede ofrecer una mejor información. En particular, se mostró a ser elevados de forma selectiva en pacientes asmáticos graves [24] y para predecir los resultados adversos en pacientes con alto riesgo cardiovascular [25] monocitos intermedios en comparación con los monocitos no clásicos. análisis comparables en pacientes con cáncer faltan hasta la fecha.
Dada la novela visión de las distintas propiedades de los monocitos intermedios y el fenotipo pro-angiogénicos (pro-tumoral) de TEM hipótesis de que estas poblaciones de monocitos pueden poseer potencial de diagnóstico en el cáncer colorrectal (CRC). Esperábamos TEM y monocitos intermedios a ser significativamente elevados en la sangre periférica de pacientes con CCR y para aumentar aún más en la enfermedad avanzada. Para abordar este tema se realizó un estudio exploratorio en 93 participantes, entre los voluntarios sanos, pacientes con CCR en estadio I-III (localizada de cáncer colorrectal) y pacientes en estadio IV (cáncer colorrectal con metástasis, CCRm) CRC. Hemos caracterizado las subpoblaciones de monocitos intermedios y TEM en la sangre periférica en relación con los parámetros clínicos, así como a las citoquinas monocitos asociado incluyendo MCP-1, Ang-2, TIE1 soluble (sTIE1), y factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF-A ). Se encontró que el subconjunto de monocitos intermedia en comparación con los TEM ser inducida preferentemente en las etapas tempranas de la enfermedad y para constituir una novela, marcador sensible para el cáncer colorrectal.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Esto no intervencionista, la investigación clínica se llevó a cabo de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki. El análisis de las muestras de sangre fue aprobado por el "Comité de Ética de la Universidad de Medicina de Viena" institucional (# 331/2010 y ° 791/2010); todos los pacientes y voluntarios sanos dieron su consentimiento informado por escrito
colectivo de pacientes
Las muestras de sangre se obtuvieron de tres grupos de sujetos:. voluntarios sanos (n = 32), pacientes con cáncer colorrectal localizado (N = 24 ) y los pacientes con cáncer colorrectal metastatizado (N = 37). La mayoría de los pacientes con CCRm tenía su tumor primario resecado y presenta con metástasis hepáticas secundarias a cáncer colorrectal. Se extrajo sangre antes del tratamiento del paciente, es decir, generalmente un día antes de la cirugía o inmediatamente antes de la quimioterapia neoadyuvante. Se determinó el estadio de la enfermedad según la Unión Internacional contra el Cáncer (UICC) para todos los pacientes con CRC siguientes tomografía computarizada y la resección del tumor. Los voluntarios sanos fueron aparentemente libre de enfermedades crónicas e inflamatorias.
Análisis de monocitos Poblaciones
tetra-acético de etileno diamina (EDTA) tratados sangre entera se procesó a temperatura ambiente. La expresión superficial de CD14, CD16 y TIE2 se evaluó la aplicación de la tinción de inmunofluorescencia directa seguido de un procedimiento Lyse-no-lavado. En resumen, 100 l de sangre entera se incubaron con los siguientes anticuerpos en concentraciones de saturación durante 20 minutos: CD14-FITC (Becton-Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.), CD16-PC5 (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE.UU.) y TIE2-PE (R & amp; D Systems, Inc., Minneapolis, MN, EE.UU.). Para eliminar los eritrocitos, se añadió solución Versa Lyse (Beckman Coulter) durante 20 minutos. La citometría de flujo se realizó inmediatamente con un citómetro FC500 y el software CXP (Beckman Coulter). parámetros de fluorescencia de compuerta se establecieron utilizando controles de isotipo de anticuerpos, y los valores por encima del umbral de tinción negativa del 99% se consideraron positivos. Se analizaron un total de 300.000 leucocitos. monocitos intermedios (CD14 + CD16 ++) fueron identificados por la expresión de alto nivel de CD14 y se distingue además de los monocitos clásicos (CD14 CD16 ++) por la co-expresión de CD16. TEM fueron identificados dentro del subconjunto intermedio mediante la expresión concomitante TIE2 (CD14 ++ CD16 + TIE2 + células). las estrategias de compuerta están documentados en la figura S1. Los datos se dan en la frecuencia% de los leucocitos de la sangre y la intensidad de fluorescencia (IMF) significan. La conversión a los recuentos absolutos de células por ml de sangre se basa en las concentraciones de leucocitos establecidos con un contador de células sanguíneas automatizado (Sysmex Corporation, Kobe, Japón).
Análisis de los parámetros de la sangre Soluble
Para la preparación de plasma , se extrajo sangre en tubos pre-refrigerados que contienen citrato, teofilina, adenosina y dipiridamol, y se procesó en hielo dentro de los 30 minutos como se describe anteriormente [26]. Las muestras de suero se mantuvieron a temperatura ambiente durante 2 h para permitir la coagulación de la sangre eficiente, seguido de centrifugación. Las muestras de plasma y suero se almacenaron en alícuotas a -80 ° C para su posterior análisis. Para la medición de la ANG-2, sTIE1, MCP-1 (amp I +; D Sytems, Inc., Minneapolis, MN, EE.UU.) y VEGF-A (Invitrogen Corp., Camarillo, CA, EE.UU.) comercialmente disponibles kits de ELISA se aplican de acuerdo con Instrucciones del fabricante. Las muestras se analizaron por duplicado con un lector de microplacas Varioskan (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EE.UU.).
Tumor Cell Cultura y
líneas de células tumorales SW480, SW620 y HT-29 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (LGC Standards, Bury, Reino Unido). Las células se sembraron a una densidad de 4x10
5 por cm
2 en medio de crecimiento con suero de ternera fetal 10% (FCS). Después de 24 horas, el medio se cambió a medio basal endotelial 2 (Lonza, Walkersville, MD) con albúmina de suero bovino 0,1% (BSA), y los sobrenadantes de células tumorales se recogieron después de otras 24 horas en cultivo. Los sobrenadantes se centrifugaron para eliminar los restos celulares y se almacenaron en alícuotas a -20 ° C.
in vitro
La estimulación de PBMCs
La sangre de voluntarios sanos se introduce en tubos con EDTA y células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se aislaron con Ficoll Paque (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). PBMCs se lavaron extensivamente para permitir un mínimo de contaminación de las plaquetas. 2x10
6 PBMCs se sembraron en cada pocillo de una placa de 12 pocillos (Corning Inc., Corning, NY, EE.UU.) y las células fueron expuestas a sobrenadante de cultivo de tumor. Dado que los factores derivados del suero disparan la inducción de la expresión de CD16 en monocitos en cultivo, la adición de FCS se mantuvo a un mínimo de 1% mantenimiento de la supervivencia de monocitos. Después de 24 horas de incubación, la fracción de células no adherentes se eliminó y las células adheridas se recogieron por raspado. Las células fueron teñidas con CD14 y CD16 y se fijaron en formaldehído para el análisis de citometría de flujo.
Análisis estadístico
Los cálculos estadísticos se basan en pruebas no paramétricas utilizando el software SPSS versión 17 (SPSS Inc., Chicago , IL, EE.UU.). Las diferencias entre los tres grupos de estudio se evaluaron mediante la aplicación de la prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney-U. Las correlaciones entre los parámetros investigados fueron determinados por el coeficiente de correlación de rango de Spearman. la predicción del cáncer de variables independientes se evaluó en el análisis univariante y multivariante mediante regresión logística binaria. Una característica de funcionamiento del receptor (ROC) curva sirve para definir el valor de corte para el diagnóstico de CCR. El p-valores reportados son los resultados de dos pruebas parciales. P-valores ≤0.5 son considerados estadísticamente significativos. Se representan los diagramas de caja y sin valores extremos para mejorar la resolución.
Resultados
Intermedio Los monocitos se incrementan significativamente en pacientes de CRC
Se aplicaron citometría de flujo para investigar la frecuencia de las subpoblaciones de monocitos en sana individuos y pacientes de cáncer colorrectal. Los tres colectivos de sujetos sanos (n = 32), pacientes con enfermedad localizada de las etapas I a III (N = 24) y pacientes con enfermedad metastásica en el estadio IV (N = 37) mostró la distribución por sexos similar, pero las diferencias en su rango de edad ( Tabla 1).
la población predominante de monocitos CD14 ++ clásicos (CD16) y el total (CD14 recuento) de monocitos positivos no difirió entre los grupos (Fig. 1). En contraste, el intermedio (CD14 ++ CD16 +) monocitos eran 2,6 veces mayor en pacientes con CRC localizada en comparación con voluntarios sanos (P & lt; 0,001) que van en un nivel medio de 0,66% frente a 0,25% de los leucocitos de sangre total, respectivamente. En la enfermedad avanzada, los monocitos intermedios disminuyeron de nuevo lo que resulta en una frecuencia mediana de 0,40% en los pacientes de CRC metastásicos, pero los niveles se mantuvieron significativamente mayor que en los controles sanos (p = 0,003). Al evaluar los monocitos intermedios en los recuentos de células por ml de sangre periférica o en porcentaje de monocitos totales, se obtuvieron resultados comparables (datos no mostrados).
subpoblaciones de monocitos se determinaron por citometría de flujo y se dan en% de los recuentos de leucocitos totales en individuos sanos, los pacientes con CRC localizada y pacientes con cáncer colorrectal metastásico. La frecuencia de monocitos (CD14 positivas) Total (A) se comparó con los monocitos CD14 ++ clásicos CD16 (B), CD14 intermedio ++ CD16 + monocitos (C), y CD14 ++ CD16 + TIE2 + TEM (D).
del mismo modo, el (CD14 + CD16 ++ TIE2 +) TEM subconjunto de monocitos mostró una tendencia no significativa a aumentar en local de la enfermedad (p = 0,055), con una frecuencia media de 0,05%, 0,07%, y 0,05% en el total de leucocitos de sangre sanos para colectivos CRC y CCRm, locales, respectivamente. Evaluación de TEM basado en la co-expresión de CD14 + TIE2 + en comparación con el triple gating para CD14 ++ CD16 + TIE2 + no alteró los resultados (datos no presentados).
niveles en sangre de Intermedio monocitos son un indicador de diagnóstico de CRC
además, evaluó el desempeño de los monocitos intermedios en el diagnóstico CRC independientemente del estadio de la enfermedad. Se aplicó el análisis ROC para determinar la potencia de diagnóstico por el área bajo la curva (AUC = 0,785, p & lt; 0,001) y establecer un umbral para la detección del cáncer (Fig. 2). Con un valor de corte de 0,37% de monocitos intermedios de leucocitos totales de la sensibilidad y especificidad diagnóstica se extendieron al 69% y 81%, respectivamente
.
El saldo de la sensibilidad y especificidad diagnóstica de los niveles intermedios de monocitos se evaluó por la República de China gráfico y el área bajo la curva.
los monocitos de CRC pacientes muestran niveles de expresión alterados de CD14 y CD16
la intensidad media de fluorescencia (MFI) de las mediciones de citometría de flujo refleja el promedio de expresión nivel de las moléculas de superficie en las células investigadas y está vinculada a la función de monocitos. Mientras que la expresión CD14 se correlaciona con la capacidad de respuesta de los monocitos y la secreción de citoquinas [27], sus niveles de CD16 se asocian con su capacidad para la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos [28].
Hemos encontrado que los monocitos totales mostraron una pérdida significativa de CD14 en la etapa avanzada de CCR metastásico (Fig. 3). También se observó Esta reducción CD14 cuando se evaluó por separado para los monocitos clásicos e intermedios. Dentro de la subpoblación de los TEM más altos niveles de expresión de CD14 se registraron en la enfermedad local. monocitos intermedios y TEM revelaron adicionalmente mejoradas significativamente los niveles de expresión de CD16 en pacientes con cáncer en comparación con voluntarios sanos (Fig. 4), mientras que los niveles de expresión de Tie2 de TEM no fueron alterados en la enfermedad.
niveles de expresión de CD14 en individuos sanos, en pacientes con CRC localizada o mCRC fueron evaluados por intensidad media de fluorescencia (MFI) de la tinción de CD14-FITC en total (CD14 positivas) los monocitos (a) o en los subconjuntos de monocitos CD14 ++ clásicos CD16 (B), CD14 + intermedia + CD16 + monocitos (C), y CD14 + CD16 ++ TIE2 + TEM (D).
El nivel de expresión de CD16 y TIE2 sobre subconjuntos de monocitos se determinó para los individuos sanos y pacientes con cáncer colorrectal metastásico localizada o cáncer. la intensidad de fluorescencia (MFI) de la tinción de CD16-PC5 media se evaluó para CD14 intermedio ++ CD16 + monocitos (A), y CD14 ++ CD16 + TIE2 + TEM (B). los niveles de expresión de Tie2 son reflejadas por las IFM de anticuerpo TIE2-PE unido a los TEM (C).
Intermedio Los monocitos son un predictor independiente de cáncer colorrectal
Para evaluar si los cambios relacionados con el cáncer en subpoblaciones de monocitos pueden estar asociados con factores conocidos para regular el reclutamiento y la activación de los monocitos intermedios y TEM, se determinó los niveles en sangre de MCP-1, Ang-2, sTIE1 y VEGF-a en voluntarios sanos y pacientes con CRC. El análisis de los parámetros soluble en el plasma mostró un fuerte incremento de VEGF-A (p & lt; 0,001) y Ang-2 (p = 0,004) en pacientes con enfermedad de metástasis (Fig. 5) mientras que los niveles tie1 solubles no fue significativamente diferente entre los grupos ( datos no mostrados). las concentraciones de MCP-1 se determinaron en plasma (Fig. 5) y en un subconjunto de muestras de suero (datos no presentados), pero no dió ningún diferencias significativas entre los tres colectivos investigados. Para la comparación, se evaluó el CEA marcador tumoral (como se estableció por análisis de rutina del hospital) en pacientes y reveló un aumento significativo de los niveles en sangre de CEA en CCRm en comparación con cáncer localizado documentar así la etapa avanzada de la enfermedad. Es de destacar que ninguno de los parámetros del plasma investigados mostró una correlación significativa con subpoblaciones de monocitos.
parámetros solubles incluyendo VEGF-A (A), MCP-1 (B) y Ang-2 (C) se midieron en el plasma muestras de individuos sanos, pacientes con CCR localizado o cáncer colorrectal metastásico. Las concentraciones en sangre del marcador tumoral CEA (D) estaban disponibles a partir del análisis de rutina del hospital de pacientes con cáncer, pero no se determinaron (ND) para el colectivo de control sano.
El análisis de regresión logística se realizó para evaluar aún más la significado de los parámetros disponibles en la predicción de cáncer. Tabla 2 especifica los respectivos niveles de significación y los odds ratios con intervalos de confianza del 95%. El análisis univariante reveló la edad, el plasma, el VEGF-A y los niveles en sangre de CD14 + CD16 ++ monocitos intermedios (p = 0,004, OR = 22) como predictores para el cáncer colorrectal. En el análisis multivariado, la edad del paciente y monocitos intermedios (p = 0,024, OR = 83) se impuso como variables independientes significativas en la predicción del cáncer.
Expresión de CD16 en monocitos es inducida por las células del cáncer de colon
in vitro
Dado que ninguno de los parámetros del plasma investigados correlacionados con la inducción de monocitos intermedios en los pacientes con cáncer, que tuvo como objetivo examinar por
in vitro
experimentos si los estímulos derivados del tumor puede de hecho desencadenar la expresión de CD16 en monocitos de sangre y aumentar la frecuencia del subconjunto intermedio. PBMCs se aislaron de voluntarios sanos y se analizaron para CD14 y la expresión de CD16 después de 24 h de incubación con sobrenadantes de células tumorales. Se comparó la estimulación con sobrenadantes derivados de primaria (SW480 y HT-29) metastásico (SW620) líneas de cáncer de colon y. Al inicio del estudio, los monocitos intermedios constituidos 22% de las células CD14 ++ (Fig. 6). Después de 24 horas de
in vitro
incubación con sobrenadante de las células de CRC de origen primario (SW480 y HT-29), la frecuencia de los monocitos CD14 ++ intermedio CD16 + fue significativamente mayor a 71-87%. Curiosamente, la incubación de PBMC con el sobrenadante de la línea de cáncer de colon metastásico SW620 resultó en un aumento de moderado a 37% de monocitos intermedios entre CD14 ++ células después de 24 h.
PBMCs se aislaron de voluntarios sanos y se incubaron durante 24 horas con sobrenadante de tumor cultivos de células derivadas de líneas de CRC HT-29, SW480 y SW620. se recogieron y se tiñeron con anticuerpos CD14-FITC y CD16-PC5 células adherentes; mIgG
1-PC5 se utiliza para el control de isotipo. datos de citometría de flujo de un experimento representativo se ilustran para el control de isotipo (A) frente a la tinción CD16-PC5 de SW480 (B), y SW620 (C) estimularon cultivos de PBMC. La media y la desviación estándar de tres experimentos independientes con diferentes donantes de sangre se presentan en un diagrama de barras (D) que ilustra el porcentaje de CD16 + (intermedio) frente a las células CD16 (clásico) dentro de la CD14 ++ población de monocitos.
Discusión
el seguimiento de las subpoblaciones de monocitos en sangre periférica originalmente se ha basado en la simple detección de CD14 y CD16 marcadores de superficie [10], [23], [29]. Esto ha llevado a la conclusión de que los monocitos CD16 + constituyen aproximadamente el 10% de los monocitos de la sangre totales y cantidad de 50 células por microlitro de sangre entera [30]. Un aumento de dos veces en este subconjunto de monocitos inflamatoria se observó durante las infecciones sistémicas, se correlaciona con la gravedad de la enfermedad y se restablece en el tratamiento del paciente y la recuperación de [31] - [33]
Un protocolo avanzado para la evaluación de los monocitos. subconjuntos fue lanzado en 2010 [34] basado en la detección simultánea de HLA-DR, CD14, CD16 y para evitar la interferencia de granulocitos y poblaciones de células asesinas naturales. En nuestro estudio, se optó por centrarse en el intermedio CD14 ++ CD16 + y los TIE2 que expresan las poblaciones de monocitos con la combinación de marcadores de CD14, CD16, y TIE2. Cabe señalar que este enfoque de detección no permite la detección inequívoca de los monocitos no clásicas que pueden ser "contaminado" por las células asesinas naturales y por lo tanto que se han omitido de este análisis. Una estrategia de tinción comparable ha sido previamente informado para la detección TEM éxito dentro de los monocitos subconjunto intermedio [35]. Se evaluó la concentración de estas poblaciones de monocitos en la sangre de voluntarios sanos y se detectó un nivel de mediana de 16 (rango intercuartil 11-30) intermedio CD14 ++ CD16 + monocitos y 3 (rango intercuartil 2-6) TEM por microlitro de sangre periférica. Cuando se calcula en porcentaje, los subconjuntos intermedios y TEM ascendieron a 0,25% y el 0,05% de los leucocitos de la sangre total y de 3,39% y 0,63% de monocitos, respectivamente.
El objetivo de nuestro estudio fue determinar si estos monocitos subpoblaciones están elevados en pacientes con carcinoma colorrectal y tienen un potencial marcador diagnóstico. Encontramos el subconjunto de monocitos intermedios a ser 2,2 veces elevado en la enfermedad a un nivel promedio de 0,55% de los leucocitos de la sangre en pacientes con CCR (0,66% en la enfermedad localizada y 0,40% en la enfermedad metastásica). análisis ROC condujo a la selección de un punto de corte en 0,37%, lo que dio lugar a una sensibilidad de diagnóstico de 69% y especificidad del 81%. El valor predictivo de este subconjunto de monocitos se confirmó mediante análisis de regresión multivariante incluyendo todos los parámetros disponibles. Aparte de la edad del paciente, los monocitos intermedios eran la única variable independiente significativa para la predicción de cáncer. En este contexto, cabe señalar, que los colectivos reclutados de individuos sanos y pacientes con cáncer diferían en edad media (56 y 68 años, respectivamente) - un sesgo que se explica en el análisis multivariante
La limitación de. poblaciones de monocitos en el diagnóstico del cáncer está dado por el hecho de que las fluctuaciones de los recuentos de monocitos en la sangre se observan también para otras condiciones, en las enfermedades inflamatorias particulares [20], [22]. Por tanto, el perfil de la sangre de subconjuntos de monocitos podría reflejar un epifenómeno sin relación con el tumor. Para abordar esta cuestión, hemos comparado los recuentos de leucocitos entre los grupos de estudio, ya que un aumento en la concentración de leucocitos es comúnmente asociada con las enfermedades infecciosas e inflamatorias. No hubo diferencia significativa entre los individuos sanos y pacientes con cáncer colorrectal investigados en nuestro estudio (Fig. S2). Además, los niveles en sangre de la proteína de marcador inflamatorio C-reactiva (CRP) estaban disponibles a partir del análisis de rutina del hospital de los pacientes con cáncer. Si bien los niveles de PCR se correlacionaron significativamente con el número de leucocitos (P & lt; 0,001; k = 0,474), no hubo correlación entre los niveles de PCR o concentraciones de leucocitos monocitos cuenta con intermedios. Estos hallazgos apoyan la idea de que el aumento del nivel de los monocitos intermedios en los pacientes con cáncer no fue inducida por las condiciones inflamatorias sin descubrir en nuestro estudio.
análisis publicados anteriormente de pacientes de cáncer se han centrado en la sencilla discriminación entre CD16 monocitos positivos o negativos , es decir, fueron la combinación de las poblaciones de células no clásicos e intermedios en su estrategia de detección. Se informó que el subconjunto CD16 + monocitos ser significativamente elevados en pacientes con enfermedad maligna [36]. En particular, un estudio reciente sobre el cáncer de mama mostró que CD16 + monocitos eran 1,7 veces mayor en los pacientes en comparación con los controles sanos. Los autores observaron que los niveles fueron más altos en el estadio I de la enfermedad en estadio II-IV [10]. Comparativamente, encontramos el CD14 + CD16 ++ intermedia monocitos subconjunto ser significativamente elevados en pacientes con cáncer colorrectal, sino para mostrar los números más altos en el local que la enfermedad metastásica. Además de la frecuencia de los monocitos intermedios, su media la expresión de CD16 aumentó, mejorando potencialmente su capacidad para la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos [28].
La expresión de CD16 en monocitos puede ser inducida por citoquinas tales como MCP -1 [10], TGF-β [37], o M-CSF [11]. Por el contrario, este efecto puede ser bloqueado por citocinas de tipo Th2 como IL-4 [12] y por GM-CSF [37]. Por lo tanto, es concebible que el aumento de los monocitos intermedios (CD14 ++ CD16 +) se activa de forma más activa por el tumor primario, mientras que la progresión del tumor en los resultados de la enfermedad metastásica en un entorno de citoquinas de tipo Th2 con efectos contrapuestos. Cuando se controlen nuestros colectivos de pacientes para MCP-1 en los niveles sanguíneos no detectamos cualquier aumento o correlación con la frecuencia de los monocitos intermedios. Sin embargo, otros factores derivados del tumor pueden explicar el mayor número de monocitos intermedios (CD14 ++ CD16 +) observados en pacientes con cáncer. En línea, nuestro
in vitro
análisis mostraron que la incubación de PBMC con sobrenadantes de cultivos de células tumorales da como resultado la rápida inducción de monocitos CD14 + CD16 ++. Sorprendentemente, este aumento fue menos pronunciado en respuesta al sobrenadante del cultivo de la línea celular SW620 metastásica derivada del mismo paciente de la línea celular de carcinoma primario SW480 o la línea primaria no relacionada CRC HT-29. Si bien estos
in vitro
experimentos no identifican el origen de CD14 + CD16 ++ monocitos inducción
in vivo
, apoyan la noción de que los monocitos intermedios pueden ser inducidas con mayor eficacia en las etapas tempranas de la enfermedad.
CD16 + monocitos son los informes, la principal población de monocitos en la respuesta anti-cáncer y secretan altos niveles de TNF-α e IL-12 tras la interacción de las células tumorales [38]. Sin embargo, la distinción funcional entre los monocitos no clásicos e intermedios no se encuentra en este contexto. El hecho de que los monocitos pueden expresar intermedios factores pro-angiogénicos (y por lo tanto potencialmente pro-tumorales) como TIE2, endoglina o VEGFR-2 nos ha llevado a investigar un determinado subconjunto de monocitos intermedios, el CD14 + CD16 ++ Tie2 + TEM. Mientras que los efectos potentes promotores de tumores se han demostrado para TEM en experimentos con ratones [16], [39], estudios clínicos sobre su potencial marcador en pacientes con cáncer son en gran parte faltante [17]. De acuerdo con un informe muy reciente sobre las frecuencias de TEM en el carcinoma colorrectal [40], se encontró que los TEM no fueron significativamente elevados en la sangre de pacientes con cáncer colorrectal y no mostró correlación con la angiogénesis que circula factores de ANG-2, sTIE1 y VEGF-A que regula el reclutamiento o la actividad [18] TEM. Aunque no detectamos una diferencia significativa en TEM cuenta entre individuos sanos y pacientes con cáncer, se observó una tendencia a niveles más altos de TEM en la enfermedad localizada. La conclusión de que los TEM circulantes constituyen un marcador de diagnóstico pobres para el cáncer colorrectal, por lo tanto puede ser debido a un menor aumento en los niveles de TEM, en comparación con los recuentos de monocitos intermedios en la enfermedad. Sería necesario un colectivo mayor de participantes en el estudio para determinar si esta diferencia es de significación estadística.
En resumen, al comparar intermedio CD14 + CD16 ++ monocitos CD14 y CD16 ++ + + TIE2 TEM en la sangre de 32 sana temas y 61 pacientes con CRC, se encontró que los monocitos intermedios en comparación con los TEM fueron significativamente elevados en la enfermedad. La mayor frecuencia de los recuentos de células CD14 ++ CD16 + fue, curiosamente, grabado para localizada en oposición a la enfermedad metastásica que puede reflejar la inducción preferencial de los monocitos intermedios en las primeras etapas de cáncer - un concepto que fue apoyada por
in vitro
estudios. Se encontró que la frecuencia de los monocitos intermedios para ser un predictor independiente de cáncer colorrectal. Al tiempo que toma en consideración que los monocitos intermedios también pueden ser elevados en otras condiciones inflamatorias, este parámetro puede resultar una valiosa adición a los marcadores de diagnóstico de CRC establecidos por reflejo de la respuesta inmune temprana contra el tumor. Representa una opción menos invasiva de detección, que aún debe ser evaluado en un colectivo de pacientes más grande en apoyo de las pruebas de diagnóstico de la colonoscopia y otros, en especial para detectar las primeras etapas de la enfermedad.
Apoyo a la Información
Figura S1.