Extracto
El ácido betulínico triterpenoides naturales (BA) muestra polypharmacology pronunciada que van desde antiinflamatorio para las actividades contra la lipogénesis. La evidencia reciente sugiere que, en lugar diversos eventos de señalización celular pueden atribuirse al mismo conmutador aguas arriba común en el metabolismo celular. En este estudio hemos examinado, por tanto, los cambios metabólicos inducidos por la administración de BA (10 mM), con el foco en el metabolismo de la glucosa celular. Demostramos que BA eleva las tasas de captación de glucosa celular y la glucólisis aeróbica en fibroblastos de embriones de ratón con la consiguiente reducción de la oxidación de la glucosa. Sin provocar signos de obvio BA muerte celular conduce a la función mitocondrial comprometida, aumento de la expresión de las proteínas de desacoplamiento mitocondrial (UCP) 1 y 2, y la quinasa de hígado B1 (LKB1) activada por AMP de activación dependiente de la proteína quinasa. representa la activación de AMPK para el aumento de la captación de glucosa y la glucólisis que a su vez son indispensables para la viabilidad celular tras el tratamiento BA. En general, se muestra por primera vez un impacto significativo de BA en la bioenergética celular que puede ser un mediador central de las acciones pleiotrópicos de BA
Visto:. Heiss EH, Kramer MP, Atanasov AG, Beres H, Schachner D, Dirsch VM (2014) Cambiar glicolítica en respuesta al ácido betulínico en células no cancerosas. PLoS ONE 9 (12): e115683. doi: 10.1371 /journal.pone.0115683
Editor: Mika Jēkabsons, Universidad de Mississippi, Estados Unidos de América
Recibido: 18 Junio, 2014; Aceptado: 1 de diciembre de 2014; Publicado: December 22, 2014
Derechos de Autor © 2014 Heiss y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Fondo de Ciencias de Austria (número de concesión 23317) para sche Familienstiftung EHH Herzfelder 'a EHH. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el ácido betulínico (3-hidroxi lup 20 3β---(29) -en-28-oico; BA) es un triterpenoides pentacíclicos de origen natural con un perfil de actividad de múltiples facetas. Múltiples estudios revelados entre otros antivirales, anti-proliferativos, pro-apoptóticos, anti-inflamatorios, vasoprotective, así como anti-diabéticos y anti-lipogénesis de propiedades de BA y sus derivados tanto
in vitro
y
in vivo
[1] - [11]. En línea con la gran cantidad de actividades biológicas reportados se han propuesto varias dianas moleculares incluyendo el kappa B del factor nuclear - [12], la proteína de unión al elemento regulador de esteroles - [7], y el NO endotelial vía sintasa [5], el mitocondrial permeabilidad poro de transición (MPTP) [13], diacilglicerol aciltransferasa [14], el receptor de ácido biliar TGR5 [6], lipasas [15] o la proteína tirosina fosfatasa 1B [16].
recientemente se ha vuelto cada vez más apreciado que el programa metabólico no es un espectador pasivo, sino un modulador activa de la transducción de señales y el fenotipo de una célula [17]. Un cambio en el programa metabólico puede influir a la vez múltiple y, a primera vista vías de señalización no relacionada, por ejemplo, proporcionando o limitar sustratos fundamentales para el anabolismo, citoprotección o modificaciones posteriores a la traducción, y ser visto como un determinante central de aguas arriba del comportamiento celular [18].
hipótesis de que algunas de las actividades biológicas ejercidas por BA son una consecuencia de la bioenergética alterado nos dispusimos a investigar el impacto de BA en el metabolismo de la glucosa.
Materiales y Métodos
las células, los productos químicos y los anticuerpos
de tipo salvaje (WT) y isogénica AMPKα
1 - /- ratón fibroblastos embrionarios (MEF) y el WT y LKB1 - /- MEF fueron regalos de tipo Benoit Viollet, INSERM de París, Francia y Reuben Shaw, del Instituto Scripps, La Jolla, EE.UU., publicado en [19] y [20] , respectivamente. Murino 3T3-L1, C2C12, células RAW 264.7 fueron de LGC /ATCC (Wesel, Alemania). células endoteliales humanas primarias (HUVEC) fueron de Lonza (Braine-L'Alleud, Bélgica). El ácido betulínico (99% de pureza) se adquirió de Biosoluciones Halle GmbH (Halle, Alemania). Marcado con tritio 2-desoxiglucosa (DOG) fue proporcionado por NEN (Viena, Austria). El CellTiterGlo el CaspaseGlo- y los ensayos de citotoxicidad no radiactivos CytoTox96 procedían de Promega (Mannheim, Alemania). MitoTracker Verde y Roja MitoSOX se compraron de Invitrogen (Viena, Austria). placas de cultivo de células especiales, cartuchos, solución de calibrado, así como kits de prueba de glicólisis y el estrés mitocondrial se encargaron a Seahorse Biosciences. STO609 vino de Calbiochem. Primary anti-AMPK (# 2532), anti-pAMPK (Thr172) (# 2535), anti-PACC (Ser79) (# 3661), el anti-LKB1 (# 3047) anti-PDHE1 (# 2784), así como la anticuerpos dirigidos contra las enzimas glucolíticas (kit de toma de muestras glucólisis) vinieron de Señalización celular Tecnología (Frankfurt am Main, Alemania). Los anticuerpos anti-GLUT1 y GLUT3 vinieron de Millipore (Viena, Austria) (# CBL242;#AB1344), la UCP1 anti o 2 anticuerpos fueron ordenados de Abcam (Cambridge, Reino Unido) (# 10983, 77363), el anti-p -PDHE1 (Ser273) era de Novus Biologicals, (Cambridge, Reino Unido) (# NB11093479) y el anticuerpo anti-actina fue de mpbio (Eschwege, Alemania) (# 69100). Secundaria peroxidasa de rábano picante (HRP) -junto anticuerpos anti-conejo y anti-ratón procedían de Señalización Celular Tecnología y mpbio, respectivamente, y el anticuerpo HRP-anti-cabra era de Santa Cruz (Heidelberg, Alemania). Todos los demás productos químicos fueron de Sigma-Aldrich (Viena, Austria). Todos los compuestos de prueba o inhibidores se disolvieron en DMSO, protegido de la luz medida de lo posible, en alícuotas y se almacena a -20 ° C. Para los experimentos de células, la concentración final de DMSO se mantuvo constante en todas las muestras y nunca excedió 0,3% de DMSO.
Cultivo de células
A excepción de las células HUVEC se subcultivaron de forma rutinaria en medio esencial modificado de Dulbecco ( DMEM, 4,5 g /L de glucosa a partir de Lonza) suplementado con 10% de suero inactivado por calor de ternera fetal (Invitrogen) y glutamina 2 mM (Lonza). Las células HUVEC se cultivaron en medio de crecimiento endotelial (EGM1) y suplementos proporcionada por Lonza. Para la diferenciación de las células 3T3-L1 a adipocitos maduros y de mioblastos C2C12 a miotubos se utilizaron protocolos estándar como se describe en otra parte [21], [22]. Las células fueron probados rutinariamente como micoplasma libre y mantienen en cultivo & lt; 11 pasajes (para primaria HUVEC & lt; 5).
Determinación de la tasa de captación de glucosa celular
Determinación de la captación de glucosa celular tasa se realizó como se describe anteriormente [23]. Brevemente, se prepararon células en placas de 12 pocillos. Después del tratamiento como células indicadas se equilibraron en tampón estándar de Krebs Ringer HEPES fosfato (KRPH) que contiene 0,2% de albúmina de suero bovino (BSA) durante 20 minutos. La captación de glucosa se inició por adición de 2-perro de aguja con 2-desoxi-D- (1H3) -glucosa (concentraciones finales 0,1 mM y 0,45 Ci /ml). Después de 15 min la reacción se detuvo mediante tres lavados rápidos con PBS enfriado en hielo. La tasa de captación de glucosa se determinó por recuento de centelleo líquido (Perkin Elmer, Brunn am Gebirge, Austria) de lisados celulares (lisis por 0,05 N de NaOH en PBS), normalizado a contenido de proteína determinado por la Rotiquant ™ (Carl Roth, Karlsruhe, Alemania) ensayo de proteína y el tiempo de absorción (para obtener la radiactividad incorporada por mg de proteína y minutos) y corregido para la captación de glucosa no mediada por transportador (que no está inhibida por la co-tratamiento con citocalasina B (10 mM) durante el procedimiento de absorción). Oligomicina A (2 M, 4 h) sirvió como control positivo para el aumento de la captación de glucosa basal.
Evaluación de la citotoxicidad potencial a través de la determinación de deshidrogenasa liberada de lactato (LDH), niveles de ATP, la escisión de la caspasa y la biomasa
MEFs fueron cultivadas en placas de 96 pocillos (densidad de siembra de 2,5 x 10
4 células /pocillo). Después del tratamiento como se ha indicado se determinó la liberación de LDH (medida de la integridad de la membrana), los niveles de ATP (medida de la viabilidad celular) y la caspasa división (medida para la inducción de la apoptosis) con el Ensayo de citotoxicidad CytoTox96 no radiactivo, el CellTiterGlo luminiscentes viabilidad celular muestra y la CaspaseGlo 3/7 luminiscentes ensayo, respectivamente. Todos los kits se realizaron de acuerdo a los protocolos proporcionados. La biomasa se tiñó mediante el vertido de medio e incubación de las células unidas con solución de cristal violeta (0,5% (w /v) de violeta cristal /20% (v /v) MeOH) durante 5-10 minutos. Después de las etapas completas de lavado con agua del grifo (con el fin de deshacerse del exceso de tinte) y secar el colorante unido se solubilizó con una solución de citrato de alcohol (0,05 M de citrato /50% (v /v) EtOH) y se cuantifica por lecturas de absorbancia a 595 Nuevo Méjico. Absorbancia y luminiscencia se controlaron en un lector Tecan (Grödig, Austria) la salida del sol y la placa GeniosPro, respectivamente. Triton (1%), estaurosporina (1 M) o una combinación de oligomicina A (2 M) y el perro (10 mM) sirvieron como controles positivos para los ensayos respectivos.
factor relacionado E2-2 El factor nuclear ( Nrf2) del gen indicador dependiente de ensayo
el dependiente Nrf2-ensayo de gen indicador se basa en la expresión de luciferasa provocada por el elemento de respuesta antioxidante activado (ARE) de glutatión murino
S transferasa y realizado
como se describe anteriormente [24]. CDDO-IM, un triterpenoides sintética (100 nM), sirvió como control positivo y fue proporcionado amablemente por Michael Sporn, Escuela Geisel de Medicina de Dartmouth, Hanover, Nueva Hampshire, EE.UU..
Análisis extracelular de flujo para la determinación de glicolítica y las capacidades respiratorias
MEF se sembraron en placas apropiadas colágeno recubiertas de cultivos celulares de 24 pocillos (de Seahorse Biosciences; Copenhague, Dinamarca) densidad celular 2,7 × 10
4 células /pocillo). Después del tratamiento como células indicadas se mantuvieron en medio sin suero (DMEM más glutamina 2 mM, 0 mM de glucosa, 0 (prueba de estrés glucólisis) o 2 (prueba de esfuerzo mitocondrial) piruvato mM, pH 7,35-7,40) a 37 ° C y CO ambiente
2 durante una hora antes de que se sometieron a la glucólisis (lectura: velocidad de acidificación extracelular (ECAR) en mPH /min) y mitocondrial (lectura: tasa de consumo de oxígeno (OCR) en pmol O
2 /min) las pruebas de estrés . kits de pruebas apropiadas vinieron de Seahorse Biosciences, se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se analizaron en un 24XF Seahorse
e extracelular analizador de flujo y el software Wave (www.seahorsebio.com). Optimizado concentraciones de inhibidor para MEF eran 2 M oligomicina A, 1,5 M carbonylcyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazon (FCCP), 1 mM rotenona A, 1 M antimicina A, y 100 mM de 2-DOG. La normalización de la masa de células se llevó a cabo rutinariamente por tinción con violeta cristal tras el análisis con el fin de tener en cuenta las posibles diferencias en el número de células.
Determinación de la lactato extracelular como marcador para la glucólisis
MEFs se prepararon de placas de 24 pocillos. Después del tratamiento como células indicadas se lavaron con PBS y después se incubó con el estándar de Krebs Ringer HEPES fosfato (KRPH) tampón suplementado con 0,2% de BSA y glucosa 10 mM durante 2 horas. A continuación, se analizaron los sobrenadantes por su contenido de lactato a través de un ensayo de fluorescencia de la enzima de acoplamiento, y se lisaron las células y se determinó su contenido en proteínas. En pocas palabras, un sobrenadante volumen (normalmente diluido 1:20) se mezcló con un volumen de tampón de ensayo (tampón KRP con 10 mM Amplex Red, 1 U /ml de lactato oxidasa y 2,5 U /ml peroxidasa de rábano picante), se incubaron durante 10 minutos y luego leer en un flourimeter a una longitud de onda de excitación de 535 nm de longitud de onda y la emisión de 590 nm. El seguimiento en paralelo de soluciones con concentraciones conocidas de lactato facilitó una lectura final del mol de lactato g de proteína /* min.
determinación de citometría de flujo del contenido mitocondrial y especies reactivas de oxígeno mitocondrial (ROS) producción
MEF se cultivaron en placas de 12 ó 6- pocillos (densidad de siembra de 1,5 × 10
4 o 3 × 10
4 células por pocillo) y se trató como se ha indicado. Para la determinación de las células contenido mitocondrial se tiñeron con 50 nM MitoTracker Green (Invitrogen) durante 20 minutos y después se analizaron en el canal verde (FL1, ex 488 nm; em 530/30 nm) de la FACS Calibur (BD Biosciences, Schwechat, Austria). La media arbitraria de fluorescencia verde se tomó como medida para el contenido mitocondrial después de la corrección de la autofluorescencia [25], [26]. Valinomicina sirvió como control para el potencial de la independencia de la señal de MitoTracker verde. Para la determinación de las células de la producción de ROS mitocondrial se incubaron con 5 M MitoSOX Red (Invitrogen) durante 10 min y después se analizó por su fluorescencia roja autofluorescencia corregida (canal FL2, ex 488 nm; em 585/42 nm) en el citómetro de flujo. La media arbitraria de fluorescencia roja se tomó como lectura para mitocondrial de ROS producido. Antimicina A (2 M) sirvió como control positivo en este ensayo.
La extracción de proteínas, SDS-poliacrilamida y análisis de inmunoblot
MEF se prepararon en placas de 6 pocillos y se trataron como se indica. Se realizaron análisis por inmunotransferencia incluyendo la extracción de proteínas, marcha de gel, transferencia, inmunodetección y evaluación densitométrica como se describe en otra parte [23]. Para la detección de GLUT1 y 3 muestras no fueron hervida antes de la electroforesis con el fin de evitar la agregación y precipitación. Para la detección de proteínas de tamaño similar (por ejemplo, forma fosforilada frente a la proteína total) se prepararon dos membranas idénticas fuera de los mismos extractos de proteínas y evaluados con el fin de evitar posibles artefactos o señales ambiguas debido a la extracción incompleta.
Para los análisis estadísticos se realizaron experimentos al menos tres veces (n≥3; experimentos independientes (biológicas repeticiones)). Los gráficos de barras representan la media ± SD. Dos grupos se compararon mediante la prueba t de Student, más grupos fueron analizados por uno o ANOVA de dos vías en función del número de variables en los conjuntos de datos investigados, seguido por el test post hoc de Bonferroni de Dunnett o de. Todos los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism. Las diferencias con valores de p. & Lt; 0,05 se consideraron como significativos y se designan con *
Resultados
BA aumenta la captación de glucosa celular
En primer lugar se evaluó la tasa de captación de glucosa celular después de la tratamiento con BA en diferentes tipos de células, incluyendo las células endoteliales primarias humanas (HUVEC), inmortalizadas macrófagos murinos (RAW264.7), diferenciada myo ratón (C2C12) - y adipocitos (3T3-L1), así como fibroblastos de embriones murinos (MEF). Hemos observado consistentemente un incremento de la captación de glucosa basal en todos los tipos de células en aproximadamente 50 a 100% (Fig. 1A) con BA a una concentración a 10 mM (concentración cuasi-óptimo para todas las líneas celulares utilizadas según lo determinado por experimentos de concentración-respuesta; S1 Higo.). Oligomicina A, un inhibidor de la ATP sintasa mitocondrial, se utilizó como control positivo. Estos hallazgos sugieren un aumento independiente general y del tipo de célula de la incorporación de glucosa por BA. La adición de concentraciones saturantes de insulina a los adipocitos y miocitos diferenciados, dos de glucosa disponer tipos de células sensibles a la insulina principales, condujo a una captación de glucosa celular aumentado en la parte superior del efecto BA (Fig. 1B) que apunta a una acción de la insulina-independiente de BA.
(A) tipos de células diferentes (adipocitos diferenciados (3T3-L1), miotubos diferenciados (C2C12), células endoteliales (HUVEC), macrófagos (RAW264.7) y fibroblastos embrionarios murinos (MEF)) fueron tratados con 10 BA mu M (+) o 0,1% de DMSO (-) se determinó para 16 h antes de su tasa de captación de glucosa celular como se describe. Oligomicina A (OL, 2 M durante 4 h) sirvió como control positivo para el aumento de la captación de glucosa basal. El gráfico de barras representa las tasas de absorción de glucosa respecto a la media del respectivo control de DMSO (n = 3 (es decir, tres experimentos independientes, cada uno por triplicado); * p & lt; 0,05 vs ctrl DMSO, ANOVA). (B) los adipocitos diferenciados (izquierda) y los miocitos (derecha) se trataron con BA (10 M) durante 16 h antes de la privación de suero y estimulación de la insulina (15 min; 3T3-L1: 15 nM de insulina; C2C12: 100 nM de insulina). A continuación, se determinó la captación de glucosa celular. Los gráficos de barras muestran las tasas de absorción de glucosa respecto a la media de la respectiva control del vehículo no estimulado. (N = 3 (es decir, tres experimentos independientes, cada uno por triplicado); media ± SD; * p & lt; 0,05 frente a ctrl DMSO no estimulada, ° p & lt; 0,05 frente a ctrl DMSO estimulada por la insulina, de dos vías ANOVA, Bonferroni). Oligomicina A (OL, 2 M durante 4 h) sirvió como control positivo para el aumento de la captación de glucosa basal.
BA no induce la muerte celular en el MEF
A medida que el aumento de la captación de glucosa puede indicar estrés celular y la citotoxicidad, y BA se ha demostrado que ejercen efectos pro-apoptóticos en varios tipos de células (cáncer), el próximo fin de determinar si la captación de glucosa elevada observada está asociada con la muerte celular subsiguiente. Se han tratado MEF, el tipo de célula seleccionado para todos los estudios posteriores, con 10 M BA durante 48 h y se determinó la liberación relativa de lactato deshidrogenasa (LDH; relación de extracelular y total) como lectura para la muerte celular y la desintegración de la membrana (Fig 2A). , la activación de las caspasas como lectura para la inducción de la apoptosis (Fig. 2B), los niveles de ATP como signo de la viabilidad celular general (Fig. 2C) y la unión de cristal violeta tan simple mancha de biomasa (Fig. 2D). BA en 10 mM y 30 mM no indujo cambios significativos en comparación con las células de control tratadas con DMSO. Por lo tanto, el aumento de la captación de glucosa observado tras la exposición BA es poco probable debido a la muerte celular inminente. Además, BA no provocó activación del factor relacionado con el factor nuclear factor de transcripción E2 2 (Nrf2) como se muestra en un ensayo de gen indicador de Nrf2-dependiente. activación Nrf2 es bien conocido como indicador para una respuesta de estrés celular tras la exposición a xenobióticos (S2 Fig.). La falta de toxicidad en concentraciones de hasta 30 mM también se pudo confirmar para las células endoteliales, adipocitos y miocitos (S3 Fig.) Y apoya el concepto general de la toxicidad del cáncer selectivo de BA.
MEF se trataron con BA (10 mM y 30 mM) durante 48 h antes de que fueran sometidos a determinación de la integridad de la membrana (% de liberación de LDH) (a), el potencial de eventos proapoptóticos (activación de la caspasa 3/7) (B), de los niveles de ATP (C ) y la biomasa (D). Los gráficos de barras muestran compilación de tres experimentos independientes (expresados en forma de plegado del DMSO valor en B, C, y D significa), cada uno en cuatro (media + SD, * p & lt; 0,05, ANOVA, prueba post de Dunnett frente DMSO ctrl). Estaurosporina (Stauro, 1 M durante 6 h), Triton (1% durante 1 h) o una combinación de oligomicina A (OL; 2 M) y el perro (10 mM; 5 h) sirvieron como controles positivos en los ensayos
BA eleva la glucólisis aeróbica
a continuación estaban interesados en el destino metabólico de la glucosa ingerida. La tasa glucolítica se investigó mediante el uso de análisis de flujo extracelular. Se observó que las células Ba-tratados mostraron una tasa significativamente mayor extracelular acidificación (ECAR) tras la adición de glucosa que sus homólogos tratados con vehículo (Fig. 3A y B). En un ensayo complementario para determinar los niveles de lactato extracelular monitoreamos constantemente elevada producción de lactato por las células tratadas con BA (S4 Fig.). Estos resultados indican una tasa mayor en glicolítica BA células tratadas y excluye una influencia de un putativo membranosa V-ATPasa a la acidificación observada. La capacidad glucolítica máxima (ECAR después de la adición oligomicina y la inhibición de la producción de ATP mitocondrial) es comparable entre DMSO y células BA-tratada. En consecuencia, las células tratadas con BA poseen una significativa disminución de la capacidad de reserva glucolítica (ΔECAR
maximal- ECAR
basal) (Fig. 3B). Estos datos muestran que las células BA conduce hacia la plena explotación de su potencial glucolítico en la desaprobación de la oxidación de la glucosa (Fig. 3C). Un aumento de la fosforilación observada de la piruvato deshidrogenasa E1 (PDHE1) aludió además a un interruptor de glicólisis en el tratamiento de BA. La fosforilación hace PDHE1 menos activo e interfiere con la descarboxilación oxidativa del piruvato a acetil-CoA a favor de la reducción de piruvato a lactato (Fig. 3D). Sin embargo, serán necesarios más experimentos para evaluar de forma inequívoca a lo fosforilación medida contribuye PDHE la glucólisis cercanas al máximo en las células tratadas con BA. El nivel de expresión de varias enzimas glucolíticas investigados no se ha cambiado (S5 Fig.) Que, sin embargo, no excluye una actividad enzimática alterada debido a covalente o modificación alostérica. La expresión del transportador de glucosa GLUT1 se elevó tras el tratamiento BA durante 16 horas, mientras que los niveles de GLUT3 no fueron alterados (fig. 3E). GLUT2 /4 no eran detectables en nuestro MEF.
MEF se trataron con 10 mM de BA o DMSO (0,1%) durante 16 horas antes de que se sometieron a una prueba de esfuerzo glucólisis como se describe en "Materiales y Métodos". En (A) la tasa de acidificación extracelular (ECAR) se representa en la exposición de células sucesivamente a la glucosa (10 mM), oligomicina A (2 M) y desoxiglucosa (DOG, 100 mM) (media + SD; compilado los datos en bruto a partir de tres experimentos independientes con cuatro repeticiones técnica cada una). En (B) los datos se analizan en términos de la basal (ECAR glicolítica después de la adición de glucosa), máximo (ECAR glicolítica después oligomicina) y sobra (actividad máxima menos la basal) la actividad glucolítica (media + SD, * p & lt; 0,05, prueba t , DMSO vs. BA). La cuantificación se basa en el valor en el punto de tiempo final de cada condición de tratamiento. En (C) valores de OCR y ECAR (de DMSO y células Ba-tratado (16 h)) después de la adición de glucosa se representaron frente a la otra para visualizar el paso de la oxidación de la glucosa a glicólisis. El cambio observado tras la adición de oligomicina A se añade a la trama como una referencia. (D) MEF se trataron con DMSO (0,1%, D) y BA 10 mM para los períodos de tiempo indicados antes de lisados de células totales fueron sometidos a análisis de inmunoblot para pPDHE1 (Ser273) y PDHE1 total (peso molecular 43 kDa). se muestran manchas representativo de tres experimentos. debajo de la gráfica representa compilado valores densitométricos de pPDHE /PDHE (n = 3; media ± SD; * p & lt; 0,05; prueba t; DMSO vs BA en cada punto de tiempo). (E) MEF se trataron con BA 10 M o DMSO (0,1%) durante 16 h antes de que se sometieron a análisis de inmunotransferencia para GLUT1 (~ 50 kDa), GLUT3 (~55 kDa) y actina (42 kDa). se muestran manchas representativo de tres experimentos independientes. debajo de la gráfica representa compilado valores densitométricos de GLUT1 /actina y GLUT3 /actina, respectivamente (n = 3; media ± SD; * p & lt; 0,05; prueba t; DMSO vs BA en cada punto de tiempo) guía empresas.
BA altera la función mitocondrial
a medida que el aumento de la glucólisis aeróbica puede compensar una producción de ATP afectada por la fosforilación oxidativa próximo examinado la función mitocondrial después del tratamiento BA. Se observó una mayor producción de ROS mitocondrial (Fig. 4A) y la elevada expresión de proteínas de desacoplamiento UCP1 y UCP2 en MEF BA-tratado (Fig. 4B). El contenido total de mitocondrial no se vio afectado (Fig. 4C). la función mitocondrial alterada fue confirmada en una prueba de esfuerzo mitocondrial y análisis de flujo extracelular. Las células muestran una tasa de consumo de oxígeno basal ligeramente reducida (OCR), un acoplamiento reducido de consumo de oxígeno para la producción de ATP mitocondrial (Δ (OCR
basal-OCR
oligomicina), disminución de la respiración máxima (OCR después de la disipación del gradiente de protones por FCCP), una capacidad disponible respiratoria reducida (Δ (OCR
máxima-OCR
basal)), así como un aumento de la fuga de protones (Δ (OCR
oligomicina - OCR
a + R) ) cuando se tratan con BA durante 16 h (Figs. 4E y F). Estos datos indican que el tratamiento con BA interfiere con la función mitocondrial, sin embargo, ligeramente como ninguna disminución de la viabilidad celular se desencadena por BA (ver Fig. 2). Tiempo curso experimentos revelaron que la respiración desacoplada (evidente en la disminución de OCR utiliza para la producción de ATP en S6A Fig.) correlacionada con la inducción dependiente del tiempo de UCPs (S6B Fig.). Sin embargo, los problemas si las cuentas de inducción UCP para el desacoplamiento observado o si BA propia molécula como bastante hidrófoba con un valor de pKa de 5,5 es un desacoplador débil necesita más investigación. En particular, en incubaciones cortas con BA (1-3 h) basal OCR tiende a ser aumentado en comparación con las células de control de DMSO como se esperaba para la respiración mitocondrial desacoplado (S6A Fig.). La reducción posterior de OCR observada en las células Ba-tratada puede ser debido a todavía adaptativo difícil de alcanzar o mecanismos adicionales provocados por la triterpenoides tales como la disipación del potencial de membrana mitocondrial en el tiempo o un flujo de electrones a través de alteración de la cadena respiratoria.
(a) MEF se trataron con 10 BA mu M o 0,1% de DMSO durante 16 h antes de que se sometieron a análisis citométrico de flujo de la producción de ROS mitocondrial con el uso de MitoSOX Red y antimicina a (2 M, 1 h) como control positivo . (N = 3 (cada uno por duplicado o triplicado), con una media + SD, * p & lt; 0,05, t-test). (B) MEF se trataron con DMSO o BA 10 mM durante 16 h antes de lisados de células totales fueron sometidos a análisis de Western blot para UCP1, UCP2 (banda en ~25-35 kDa) y actina (42 kDa) como control de carga. borrones representativos de tres experimentos independientes se representan. debajo de la gráfica representa compilado valores densitométricos de UCP1 /actina y UCP2 /actina, respectivamente (n = 3; media ± SD; * p & lt; 0,05; prueba t; DMSO vs BA). (C) MEF se trataron con BA 10 M o 0,1% de DMSO durante 16 h antes de que se sometieron a análisis de citometría de flujo del contenido mitocondrial utilizando MitoTracker verde. Valinomicina (200 nM, 16 h), un disruptor conocido del potencial de membrana mitocondrial sirvió como control para la señal de potencial independiente de MitoTracker verde. MEF se trataron con BA 10 M o DMSO (0,1%) durante 16 h antes de que se sometieron a una prueba de esfuerzo mitocondrial tal como se describe en Materiales. En (D) la tasa de consumo de oxígeno media (OCR) de tres experimentos independientes se representa en las células que exponen sucesivamente a oligomicina (2 M), FCCP (1,5 M) y antimicina A + rotenona (A + R; 1 + 1 mM). En (E) los datos se analizan en términos de la tasa de consumo de oxígeno en condiciones basales, el consumo de oxígeno para la síntesis de ATP, la frecuencia respiratoria máxima, la capacidad respiratoria libre y fugas de protones (media + SD, * p & lt; 0,05, prueba t, DMSO vs . BA).
BA activa la proteína quinasa activada por AMP (AMPK)
Reducción de la función mitocondrial se ha relacionado con la activación de la AMPK (revisado en [27]), uno metabólicas centrales master hub. la activación de AMPK puede explicar, además, una absorción compensatoria aumento de la glucosa y la tasa glicolítica [28], [29]. Por lo tanto, se investigó si BA conduce a la AMPK activado. Utilizando el análisis de inmunoblot se observó un aumento transitorio de la fosforilación de AMPK en la treonina 172, indicativo de la actividad de la AMPK elevado, en BA tratados frente a las células de control (Fig. 5A). la activación de AMPK fue corroborada por el aumento de la fosforilación de la acetil-CoA carboxilasa (ACC) en la serina 79, un objetivo común aguas abajo de la AMPK. El uso de homólogos isogénicas knockout WT MEF y AMPK reveló que el aumento de la absorción de glucosa, aumento de la expresión del transportador de glucosa GLUT1 y metabolismo elevado de glucosa a través de la glucólisis eran dependientes de la presencia de AMPK (Fig. 5B, C, D). Sin embargo, BA indujo una reducción comparable de la función mitocondrial (por ejemplo reducción de la respiración máxima en aproximadamente un 40% en comparación con el control de DMSO) tanto en WT y AMPK - /- MEF. Este hallazgo coloca la disfunción mitocondrial aguas arriba de la activación de AMPK (Fig. 5E) que está en línea con la activación observada de AMPK, la inducción de GLUT1, una captación de glucosa elevada y una mayor tasa glucolítica sobre desacoplamiento FCCP-impuesta leve (S7 Fig.). Es de destacar que la AMPK - /- células mostraron una tasa de consumo de oxígeno en general inferiores a WT MEF, probablemente, en parte debido a su reducido número de mitocondrias (S8 Fig.). La comparación de WT y las células deficientes en quinasa de hígado B1 (LKB1), la AMPK quinasa sensible a una alteración del cociente AMP /ATP [30], sugiere LKB1 como el principal AMPK quinasa que participan: LKB1 - /- las células visualizan disminuyen la fosforilación de AMPK en tras el tratamiento BA (Fig. 5F).
(a) MEF se trataron con DMSO (0,1%) o BA (10 mM) para los períodos de tiempo indicados. Lisados de células totales fueron sometidos a análisis de inmunoblot para pAMPK (Thr172) y AMPK total (60 kDa) (panel izquierdo) o pAMPK (Thr172), PACC (Ser79) (~245 kDa) y actina (42 kDa) (panel derecho). borrones representativo de tres experimentos independientes se representan. Los gráficos siguientes ilustran compilan los valores densitométricos de pAMPK /AMPK o PACC /actina, respectivamente (n = 3; media ± SD; * p & lt; 0,05; prueba t; DMSO vs BA en cada punto de tiempo). WT y AMPK - /- MEF se trataron con DMSO o BA (10 M) durante 16 h. Entonces se evaluaron las tasas de captación de glucosa celular (B) (n = 3 (por triplicado), con una media + SD, * p & lt; 0,05, ANOVA, post-test de Dunnett vs DMSO ctrl), así como los niveles de expresión de GLUT1 (50 kDa), AMPK (60 kDa) y actina (42 kDa) mediante análisis de transferencia Western (C). Un representante blot se representa de tres experimentos independientes. debajo de la gráfica representa compilado valores densitométricos de GLUT1 /actina, respectivamente (n = 3; media ± SD; * p & lt; 0,05; prueba t; DMSO vs BA). En las células (D) se sometieron a determinación de la velocidad de acidificación extracelular (ECAR) como se describe en la Fig. 3. Los resultados representativos de tres experimentos independientes (con tres repeticiones técnica cada una) se muestran (media + SD, * p & lt; 0,05, t-test). (E) WT y AMPK - /- MEF se trataron con DMSO (0,1%) o BA (10 M) durante 16 h antes de que se sometieron a una prueba de esfuerzo mitocondrial y análisis de flujo extracelular. Los datos recopilados de tres experimentos independientes se representan (media + SD). (F) WT y LKB1 - /- MEF se trataron con BA (10 M) para los períodos de tiempo indicados antes de lisados de células totales fueron sometidos a análisis de inmunotransferencia para pAMPK (Thr172), AMPK (60 kDa), LKB1 (~ 50 kDa ) y actina (42 kDa). borrones representativo de tres experimentos independientes se representan. debajo de la gráfica representa compilado valores densitométricos de pAMPK /AMPK, respectivamente (n = 3; media ± SD; * p & lt; 0,05; ANOVA, Dunnett (frente a 0 h de tratamiento con BA)
Estos datos. mostró que BA leve alteración de la función mitocondrial, desencadena la activación de AMPK a través de LKB1 que a su vez provocó una mayor ingesta de glucosa y cambió el metabolismo de glucosa celular de la oxidación de la glucólisis aeróbica.
BA hace que las células adictas a la glucosa
Intrigado por el hallazgo de que BA conduce células en la actividad glucolítica mejorado próximo a prueba si las células BA rendido de glucosa en adictos. para ello se evaluó la viabilidad celular (niveles de ATP, biomasa) del MEF tratados con vehículo o BA en ausencia y presencia de glucosa durante 48 horas . para las células de glucosa-privado añadimos manitol como equilibrio osmótico. células de control tratadas con DMSO protegen bien con el agotamiento de la glucosa como es evidente por la biomasa sin alteraciones y los niveles de ATP en comparación con el "más glucosa" condición. En ausencia de glucosa esas células incluso mostró una reproducible tendencia a elevados niveles de ATP que puede explicarse por la oxidación mitocondrial forzada de sustratos (por ejemplo, ácidos grasos contenidos en el suero) con mayor rendimiento ATP que la glucosa.