Extracto
radiosensibilidad intrínseca es un factor importante que subyace a la respuesta de la radioterapia, pero no hay un método para su evaluación rutinaria en los tumores humanos. firmas de genes están siendo derivados y algunos se han generado previamente por perfiles de expresión del panel de la línea celular NCI-60. Se formuló la hipótesis de que se centra en los tipos de tumores más homogéneas sería un mejor enfoque. Dos cohortes de línea celulares se utilizaron derivan de cuello uterino [n = 16] y la cabeza y el cuello [n = 11] cánceres. Radiosensibilidad se midió como fracción de supervivencia después de la irradiación con 2 Gy (SF2) mediante el ensayo clonogénico. La expresión génica diferencial entre las líneas celulares radiosensibles y radioresistant (SF2 & lt; /& gt; mediana) se investigó el uso de Affymetrix GeneChip Exon 1.0ST (cuello uterino) o U133A Plus2 (cabeza y cuello) matrices. Hubo diferencias dentro de cohortes de líneas celulares relacionadas con tejido de origen reflejada por expresión de la p63 estratificado marcador epitelial. De 138 genes identificados como asociados con SF2, sólo 2 (1,4%) fueron congruentes entre el cuello uterino y la cabeza y las líneas celulares de carcinoma de cuello (MGST1 y TFPI), y estos no partición de las líneas de células NCI-60 publicados basados en SF2. Hubo un éxito variable en la aplicación de tres firmas radiosensibilidad publicados a nuestros cohortes. Una firma genética, originalmente formado en las líneas celulares NCI-60, hizo líneas celulares sensibles y resistentes parcialmente separadas en los tres conjuntos de datos de líneas celulares. Los resultados no confirman nuestra hipótesis, pero sugieren que una firma transcripcional común puede reflejar la radiosensibilidad de los tumores de origen heterogéneo
Visto:. Sala JS, Iype I, J Senra, Taylor J, L Armenoult, Oguejiofor K, et al. (2014) Investigación de Radiosensibilidad Gene Firmas en líneas celulares de cáncer. PLoS ONE 9 (1): e86329. doi: 10.1371 /journal.pone.0086329
Editor: Olivier Gires, Universidad Ludwig-Maximilians, Alemania |
Recibido: 29 Julio, 2013; Aceptado: 9 de diciembre de 2013; Publicado: 22 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Hall et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Investigación del Cáncer Reino Unido (C1094 /A9437, c1467 /A7286 y C147 /A6058), el Consejo de investigación médica del Reino Unido (GO801525), y ECMC (c1467 /A7286) apoya esta investigación. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Mark J O'Connor es empleado por AstraZeneca. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales. Otros autores declaran que no existen conflictos de intereses. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados que declarar.
Introducción
radiosensibilidad intrínseca es un importante factor subyacente respuesta de la radioterapia [1]. Radiosensibilidad se puede medir como la fracción de células supervivientes de una dosis única 2 Gy de radiación (SF2) con valores altos indican radioresistance. Mientras que otros métodos están disponibles para medir la radiosensibilidad celular en líneas celulares, SF2 se considera que es el estándar de oro y es apoyado por una fuerte evidencia clínica.
in vitro
mediciones de SF2 se correlacionan con
in vivo
radiorespuesta en modelos de ratón [2]. La medición de SF2 en tumores humanos primarios fue un factor pronóstico independiente en pacientes con carcinoma de cuello uterino [3] y la cabeza y el cuello [4] después de la radioterapia potencialmente curativa. A pesar de la evidencia de su importancia, ningún método está disponible para su evaluación de rutina en los pacientes, debido a los impracticalities de la medición de radiosensibilidad del tumor. La capacidad de medir la radiosensibilidad de un tumor que sería un gran avance y permitir un tratamiento individualizado para reducir la dosis y /u omitir la quimioterapia en pacientes con tumores sensibles o por el contrario para intensificar el tratamiento contra tumores resistentes. individualización del tratamiento debe aumentar la supervivencia y reducir la morbilidad. Las estimaciones sugieren un enfoque biológico individualizado al tratamiento basado en pruebas de radiosensibilidad podría aumentar las tasas de supervivencia por & gt;. 10% [5]
En consecuencia, existe interés en la obtención de una firma genética que refleja la radiosensibilidad. Varios métodos han sido exploradas: la identificación de genes inducidos después de la irradiación en las líneas celulares [6]; la identificación de la expresión diferencial entre radioresistant inducido y líneas celulares de cáncer radiosensibles parentales [7] y el perfil de la
in vitro
respuesta de los tumores del cuello uterino de la irradiación [8]. La mayoría de estudios publicados eran pequeñas y no han sido validados de forma independiente. Los estudios más exhaustivos utilizan el panel NCI-60 de las líneas celulares [9]. Un estudio identificó 22 genes que juntos discriminaban entre los valores bajo y alto SF2 en 63 líneas celulares, basado en un umbral de 0,2 (es decir, líneas de células con menos de 20% de supervivencia de colonias después de 2 Gy definido como radiosensibles) [10]. Otra serie de estudios desarrollado un clasificador predictivos de la radiosensibilidad basado en SF2 asociado perfiles de expresión génica en los NCI-60 líneas [11], [12], [13], [14]. El punto final de estos estudios fue un modelo de regresión de los genes 10-cubo, que tenía un significado pronóstico cuando se aplica a tres conjuntos de datos clínicos (recto, esófago y la cabeza & amp; cánceres de cuello) [13] y también fue predictivo de beneficio de la radioterapia en el cáncer de mama [15]. Además, un meta-análisis de los datos publicados a partir de cuatro plataformas de microarrays para las células NCI-60 identificó un gen radiosensibilidad 31 de la firma [16].
El panel NCI-60 es el más ampliamente caracterizado conjunto de líneas celulares de cáncer y una los recursos públicos que se utiliza con frecuencia como una herramienta de exploración para el descubrimiento de fármacos [9]. El panel contiene líneas de células de varios tejidos de origen pero algunos tipos de tumores radiobiologically pertinentes, tales como el cuello uterino (n = 0) o la cabeza y el cuello (n = 0), es decir, los cánceres donde la radioterapia es una parte importante del tratamiento. Es bien sabido que los tumores derivados de diferentes tejidos varían en radiosensitivities; con neoplasias hematológicas ser sensible, y glioblastoma y melanomas más resistente a la radiación [17]. Los estudios muestran que los niveles de expresión génica basal se correlacionan fuertemente con el tejido de origen, en particular entre hematológicas y tumores sólidos [10]. Como tal, la variación y el ruido considerable está presente en los datos de expresión de genes 'basal' el NCI-60, lo que podría dificultar la identificación de genes asociados con SF2. El P63 factor de transcripción es un marcador de origen de células escamosas y regula muchos genes asociados con el destino epidermoide /células escamosas. La pérdida de p63 está asociado con la sobre regulación de los genes asociados con un mayor mesenquimales /destino de las células migratorias [18].
Se formuló la hipótesis de que derivar una firma radiosensibilidad utilizando un grupo más homogéneo de líneas celulares sería una un mejor enfoque. Se obtuvieron 16 líneas celulares de carcinoma de cuello uterino, un tipo de tumor que la radioterapia es importante, pero que no está representado en el panel NCI-60. Las células se caracterizaron en condiciones basales muy controladas; parámetros medidos incluyeron SF2, la expresión de proteínas de matriz de proteínas de fase inversa (ZeptoMARK) y la expresión génica por Affymetrix exón 1.0ST. Se intentó identificar los genes que son expresados diferencialmente entre las líneas celulares SF2 altas y bajas en un solo tipo de tumor homogénea. Tuvimos acceso a un segundo carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas (HNSCC) cohorte línea celular radiobiologically relevantes independientes (n = 11) para validar nuestros resultados y los derivados de los datos públicamente disponibles NCI-60.
Materiales Métodos y
líneas celulares
Catorce líneas celulares de carcinoma de cuello uterino comercialmente disponibles se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC) o la colección japonesa de Recursos Biológicos de investigación (JCRB). Otras dos líneas celulares (778 y 808) se obtuvieron en casa [19]. Todas las líneas de células del cuello uterino se cultivaron en condiciones idénticas: 4,5 g DMEM /l de glucosa, más glutamax (Life Technologies, Paisley, Reino Unido), suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS) (Lote: A04305-0160, PAA Laboratories (Yeovil, Reino Unido )) y se mantuvo en una incubadora humidificada. de cabeza y cuello de células líneas once fueron cultivadas como se describe en la Tabla S1. Todas las líneas celulares se sometieron a la autenticación de STR y estaban libres de micoplasma.
Ensayos clonogénicos
El método se describe en otro lugar [20]. Brevemente, las células de crecimiento exponencial se tripsinizaron y se irradiaron con 0-10 Gy a temperatura ambiente usando una unidad de rayos X a una velocidad de dosis de 1,37 Gy /min. Después de chapado y el crecimiento de 2-3 semanas, las colonias formadas se tiñeron con violeta de cristal y aquellas con & gt; 50 células anotó. Cada experimento consistió en un mínimo de tres, pero por lo general seis repeticiones técnica y los experimentos se repitieron dos (n = 4) o tres (n = 21) veces. Los datos mostrados son la media de las réplicas biológicas.
VPH Genotipado
El genotipado del VPH de estas líneas celulares de carcinoma cervical se describió anteriormente [21]. Para líneas celulares de carcinoma de cabeza y cuello QRT-PCR para E2, E6 y E7 de HPV16 y HPV18 se realizó tal como se describe anteriormente [22].
Ensayo MTT
El tiempo de duplicación fue estimado para cada celda utilizando la línea de ensayo acuoso CellTiter 96 no radiactivos proliferación celular (Promega, Madison, WI, EE.UU.) según el fabricante del 'noche' protocolo. Una curva de crecimiento estándar de 7 días se llevó a cabo en placas de 96 pocillos. lecturas colorimétricas se tomaron a 570 nm y se comparan, por regresión exponencial con una curva estándar de la densidad celular conocida. Un promedio de tres repeticiones independientes en diferentes densidades se utilizó para calcular el tiempo de duplicación promedio.
La extracción de RNA
Las células se lavaron en PBS y se congelaron en nitrógeno líquido. Se extrajo el ARN y DNasa tratada usando el kit de Qiagen RNeasy (Qiagen, Reino Unido), según las instrucciones del fabricante. La integridad del ARN (RIN) y la cuantificación se midieron utilizando un Bioanalyser (Agilent Technologies Ltd, Santa Clara, CA, EE.UU.). 260/230 y 260/280 proporciones se evaluaron utilizando un espectrofotómetro Nanodrop 1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, EE.UU.).
Transferencia Western
El estado de la proteína p63 de las líneas celulares de carcinoma de cuello uterino se describió anteriormente [21]. Usando los mismos métodos de transferencia Western se realizó en las líneas de la cabeza y de la célula de cuello, utilizando los siguientes anticuerpos: p63 monoclonales de ratón (BC4A4) (Abcam, Cambridge, Reino Unido) y anticuerpo monoclonal de ratón anti-β-actina (clon AC-15) (Sigma . -Aldrich, Dorset, Reino Unido)
ZeptoMARK fase inversa arrays de proteínas
células en crecimiento exponencial se lavaron con PBS, se lisaron en 75 l de tampón de lisis CLB1 (Zeptosens: una división de Bayer ( Schweiz) AG, Suiza), raspó en tubos de microcentrífuga, sometidos a vórtice y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las muestras se centrifugaron a 15.000 rpm a temperatura ambiente, los sobrenadantes recogidos y concentraciones determinadas por el ensayo de Bradford. El procedimiento de manchado se ha descrito antes [23]. Brevemente, el cuello uterino lisados de proteínas carcinoma fueron normalizados a 2 mg /ml, de la que fueron vistos cuatro concentraciones (0,20, 0,15, 0,10 y 0,05 mg /ml), por duplicado en un chip hidrófobo ZeptoMARK (Zeptosens). Cada línea celular se cultiva y cosecha en dos ocasiones de forma independiente; en consecuencia, dos réplicas biológicas fueron avistados en la matriz. Chips se bloquearon con tampón de celya (Zeptosens), antes de la incubación con anticuerpos primarios durante 22 horas a 20 ° C. Se seleccionaron veinte y cuatro anticuerpos (Zeptosens) en función de su papel en el cáncer o resistencia a la terapia [24]. Después de la incubación el exceso de anticuerpo primario se eliminó y un anticuerpo específico de la especie marcada con fluorescencia hibridó durante 2,5 horas a 20 ° C. Después del lavado, las matrices se leyeron en un ZeptoREADER (λ
EX /λ
em = 635/670 nm). La intensidad fluorescente relativa resultante (RFI) se calculó a partir de una curva estándar construida a partir de las cuatro concentraciones (por duplicado). Esta es una medida cuantitativa de proteínas. Los valores mostrados son la media de dos réplicas biológicas (es decir, 4 curvas de calibración).
El exón matriz de hibridación
100 ng de ARN se amplificó utilizando el kit v2 NuGen WT-Ovation FFPE (Nugen Technologies, San Carlos , CA, EE.UU.). El WT-Ovation Exon Módulo V1.0 se utilizó para generar ST-cDNA y 4 g se hibridó con el exón humano 1,0 ST arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA). Otros detalles y datos en bruto (archivos CEL) están disponibles en http://bioinformatics.picr.man.ac.uk/vice (o GEO:. GSE39066 (parte de Super Series GSE39067) Los datos en bruto para HNSCC líneas celulares están disponibles en GEO :.. GSE51370
Exon Arrays Análisis de datos
Microarray datos se normalizaron mediante RMA [25] el paquete R /BioConductor
annmap
y la base de datos annmap [26] se utilizaron para eliminar probesets no exonic y de metas de rendimiento de la matriz de múltiples se midió como el porcentaje de probesets marcado como "presente" con un punto de corte conservador (Detección% por encima de fondo [% DABG]
P
. & lt; 0,01 ) y sólo aquellos probesets marcados "presente" en al menos tres muestras se conservaron. Este filtro reduce el número de probesets considerados de 1.411.399 a 353.981 probesets exonic, de las cuales 243,301 pasaron DABG filtrado. resúmenes nivel de genes se calcularon tomando la mediana de la señal de probesets filtrados mapeado en el que los símbolos de genes únicos. Cuando se resume esto dio lugar a 31,345 genes considerados. Agrupación jerárquica sin supervisión se realizó en los 1000 genes más variantes (clasificados en el coeficiente de variación) para mostrar la separación de las muestras con base en los genes más variables en los datos, y reducir al mínimo los requisitos computacionales. Generación de firma: Una firma genética se determinó que era el conjunto de genes o probesets que fueron significativamente expresados diferencialmente entre dos grupos de líneas celulares de acuerdo con cualquiera de LIMMA o Rango de Análisis del producto. El punto de corte para la significación era un valor de p corregido descubrimiento falsa de 0,01. Paquetes: R: 3.0.2, Annmap: versión 1.2.1 usando la base de datos humana construir 66, LIMMA: 03/17/26, RankProd: 2.32.0, Pheatmap: 0.7.7.
Validación de cohortes, la cartografía de la matriz y de datos análisis de datos de la matriz
línea celular de cabeza y cuello Affymetrix U133A Plus2 eran RMA normalizado usando la
affy
paquete de control en probesets R. Affymetrix ( 'AFFX' anotado) fueron retirados. Para el análisis de varianza, _x_, _a_ y _S_ probesets anotado también se extrajeron. NCI-60 - Los archivos de Affymetrix Plus2 cel fueron descargados de CellMiner (http://discover.nci.nih.gov/cellminer/) y RMA normalizado como antes. Después de la normalización, se replican arrays para cada línea celular se promediaron. Para la comparación de la matriz de datos resumidos exón a nivel de genes, probesets Plus2 fueron asignadas a los símbolos de genes utilizando
annmap
.
Radiosensibilidad Firma Mapeo
Todas las firmas se aplicaron al gen -Nivel resúmenes de los datos de cuello uterino utilizando una correlación de símbolos de genes. Para la aplicación de firmas a la CECC y NCI-60 Plus 2 Affymetrix conjuntos de datos, se utilizaron los siguientes protocolos:
ProbeSet identificaciones de los Eschrich
et al
[13] diez genes fueron tomadas de cubo Tabla 3 del primer documento del grupo [13]. establecidas líneas de células NCI-60 de prueba fueron tomadas de la Tabla 4 del segundo trabajo del grupo [12]. Doce líneas celulares se enumeran pero no hubo correspondiente matriz Plus2 para la línea celular de mama MDN.
el primer puesto cuatro genes de Torres-Roca
et al
[14] (
PRAIs , rbbp4, RGS19, ZNF208
) fueron asignadas a Affymetrix probesets Plus2 utilizando
annmap
. Los datos de expresión correspondientes para los probesets se extrajeron y se representan en una escala lineal (anti-log).
Gene símbolos para el Amundson
et al
firma genética se tomaron de la segunda tabla de la artículo original [10]. Un gen no pudo ser mapeada (Unigene ID Hs.494347) ya que no había gen símbolo correspondiente en la tabla. Los restantes 21 símbolos de genes fueron asignadas a probesets Plus2 utilizando
annmap
. Se eliminaron probesets multi-mapeo.
El Tewari
et al
firma fue tomado de la segunda tabla del artículo original [8]. Cuarenta y nueve de los 60 probesets con un símbolo único gen se extrajeron y se asigna a probesets Plus2 utilizando annmap. Se eliminaron probesets multi-mapeo.
análisis sin supervisión (clustering, PCA) de los datos de expresión génica, análisis de firmas y análisis de expresión diferencial (
LIMMA
[27],
RankProd
) se llevaron a cabo utilizando R. El umbral para la expresión diferencial utilizando Rango Análisis del producto (
RankProd
) era una tasa porcentual Falso positivo (PFP) de. & lt; 0,01
gráfica y estadísticas
los resultados muestran la media de réplicas biológicas y mediciones de precisión son el error estándar de la media a menos que se indique lo contrario. R indican los valores coeficiente del momento del producto de Pearson. Boxplots se generaron en GraphPad Prism (v6.0): parámetros de caja de bigotes: barra horizontal indica la mediana de expresión, la caja indica el rango intercuartil; bigotes representan el rango. Para la visualización de las curvas de supervivencia de radiación una ecuación cuadrática lineal se monta en R, con los parámetros derivados de radiobiológicas DRFIT [28]. El paquete R
LIMMA
, se utilizó para calcular los valores de expresión diferencial de proteínas de datos de perfiles. En su caso,
p-valores son
Benjamini y Hochberg falso descubrimiento tasa (FDR) corregida [29]. El análisis de componentes principales (PCA) reduce de datos multidimensionales (es decir, miles de genes) en puntos de datos en el espacio 2-D. Cuanto más cerca de dos puntos de datos (muestras) cuanto más similares sean las muestras. PC1 (eje x) representa la mayor parte de la varianza en un experimento, PC2 (eje y) representa el componente que representa la segunda más alta varianza.
Resultados
líneas celulares de carcinoma cervical tienen un rango de Radiosensitivities
la Tabla 1 resume las líneas celulares de carcinoma de cuello uterino. Dos líneas de células no formaban colonias y valores SF2 para las 14 líneas restantes oscilaron ,25-,75 (Figura 1). Los valores SF2 para seis de las líneas celulares fueron publicadas por otro grupo [30], y la clasificación fue idéntica en ambos estudios. En las líneas celulares 14, no hubo correlación de SF2 con chapado eficiencia (R
2 = 0,005,
p
= 0,82), el tiempo de duplicación (R
2 & lt; 0,0001,
p
= 0,99) o la expresión de ARN de TP63, un marcador de la diferenciación de células escamosas (
p
= 0,90).
curvas a) de supervivencia de radiación que muestra la fracción superviviente (log10) (y eje x) después de la irradiación con 2, 4, 6, 8 y 10 Gy de 14 líneas celulares de cáncer de cuello uterino. Los puntos de datos son la media y el error estándar de 2-3 experimentos independientes (3-6 repeticiones por experimento). Puntos de datos están equipados con la ecuación cuadrática lineal y coloreadas por debajo (azul) o superior (rojo) de la mediana SF2.
Molecular Caracterización de líneas celulares aparentemente homogéneos carcinoma cervical Muestra disparidad significativa
expresión de p63 (proteína y ARNm) se midió al discriminar entre las escamosas (p63 +) y no escamosa (p63-) tipos histológicos de cáncer de cuello uterino [21]. Siguiendo el perfil transcripcional, agrupamiento no supervisado de los más variantes de 1.000 genes (clasificadas por el coeficiente de variación) separa las líneas en tres grupos (Figura 2A) con el grupo 1 (C33A y HCSC1) siendo los valores extremos. Los otros 14 líneas celulares particionados como racimos + p63- y p63 con la excepción de SKG1 que tenía el nivel de transcripción TP63 más bajo de las líneas positivas p63. HCS2 y 778, que no formaban colonias en nuestras condiciones, no se agrupan sugiere que no hay expresión transcripcional común asociado con la capacidad de formar colonias. Estos resultados sugieren que las principales diferencias transcripcionales basales entre las líneas celulares se refieren a la expresión de p63. Curiosamente, mientras que las células HeLa fueron el único adenocarcinoma (AC) de acuerdo con la información sobre la procedencia, varias líneas de células del cuello uterino tenían perfiles de transcripción globales similares. HCSC1 es 'carcinoma de células pequeñas' derivada, en consecuencia, se exploró si la agrupación de C33A y HCSC1 se debió a un origen histológico compartida. El análisis de componentes principales (PCA), utilizando la expresión génica combinada de dos firmas de genes, formados en (i) AC y SCC [21] y (ii) el carcinoma de células pequeñas [31], mostró que HCSC1 y C33A tenían la expresión de genes histológico muy similar ( Figura 2B). La Figura 2C muestra que C33A y HCSC1 tenían niveles bajos de genes de SCC y más alto que los niveles medios de pequeñas genes de carcinoma de célula. Es interesante observar que la expresión de los genes AC fue baja en todas las líneas celulares, incluyendo células HeLa, lo que sugiere que esta firma, derivado en el material de tumor primario puede tener una aplicabilidad limitada en líneas celulares. Estos datos sugieren que C33A es histológicamente una línea celular derivada de carcinoma de células pequeñas y pone de relieve las diferencias de transcripción asociados con el tipo histológico del tejido que se encuentra en una sola cohorte relativamente homogéneo de origen.
A) Agrupación jerárquica sin supervisión de las 1000 genes calificados por el coeficiente de variación (a partir de datos exón matriz). colorear mapa de calor es por log
2 valor de la expresión. Las filas representan los genes y las columnas son las líneas celulares. dendrograma eje x (clusters) indica la similitud de las líneas celulares y el eje y dendrograma la similitud de genes. El grupo 1 representa dos muestras con los valores más bajos (TP63 p63 negativos). Cluster 2 muestra la agrupación de las otras líneas celulares p63- incluyendo el adenocarcinoma HeLa. Cluster 3 grupos de líneas celulares de p63 +, con la excepción de SKG1, que se clasifica con células negativas p63. B) Análisis de componentes principales de las 16 líneas celulares de cáncer de cuello uterino basado en SCC (n = 1062), AC (n = 155) y la expresión génica carcinoma de células pequeñas (n = 77). El eje X muestra los componentes principales 1 (PC1) que representan el 15,5% de la varianza. PC2 muestra en las cuentas del eje y el 13,7% de la variación en la expresión de genes firma histología. La coloración representa la expresión de la proteína p63. C) Gráfico que muestra el promedio de expresión (log 2) de la SCC, AC y la pequeña firma carcinoma de células. eje y es el exón serie derivada nivel medio de expresión de genes, para cada una de las tres firmas. El eje X muestra la línea celular. Las líneas celulares se clasifican en base a la expresión de TP63.
Proteína de perfiles de 'Los genes asociados con el cáncer' muestra diferencias vía clave entre las líneas celulares, pero no entre los grupos de alta y de baja SF2
Un panel de 24 proteínas fueron seleccionados de un catálogo de anticuerpos pre-validado de las proteínas implicadas en el cáncer, o resistencia a la terapia [24]. Los anticuerpos de respuesta al daño del ADN pocos estaban disponibles y por lo que la selección se limitan a proteínas bien validados asociados con el cáncer, tales como p53, Rb, EGFR, etc. Como p63 es esencial para el potencial proliferativo de las células madre en el epitelio estratificado [32], que postula que las células p63 + expresarían los niveles más altos de la proteína marcadora epitelial e-cadherina, en comparación con las células p63- y esto fue confirmado por la matriz de proteínas (
p
= & lt; 0,0001) (Figura 3A). También comparó el nivel de expresión de ARNm de E-cadherina (Exon-matriz derivada) con la abundancia de proteína se mide por la matriz (intensidad de fluorescencia relativa [RFI]; Figura 3B). Hubo una fuerte correlación (R = 0,95,
p Hotel & lt; 0,001) lo que demuestra que los niveles de proteína reflejan niveles de transcripción de la E-cadherina. También se detectó altos niveles de proteína p53 en las células C33A en comparación con todas las otras líneas de células (Figura 3C), debido a una mutación conocida en la
TP53
de genes [33] lo que resulta en la estabilización de proteínas. Estos datos nos dio una alta confianza en los datos de perfiles de proteínas. agrupamiento no supervisado de los datos de proteínas no mostró relaciones con características conocidas (Figura S1). Clasificación de las líneas de células de SF2 no mostró ninguna estructura visual claro a los datos (Figura 3C). Las 14 líneas de células se dividieron en grupos de alto y bajo radiosensibilidad usando el valor de la mediana SF2, tal como se utiliza anteriormente con muestras clínicas [3], [4]. Cuatro proteínas fueron expresados diferencialmente (
p Hotel & lt; 0,05) entre los dos grupos: mTOR, PTEN, I? B alfa, y NFkB, pero ninguno fue significativa después de la corrección de tasa de falso descubrimiento (FDR) (Figura 3D, el cuadro S2 ). mTOR estaba en el límite significativo (FDR
p = 0,09
) y hubo una tendencia a una correlación moderada entre mTOR y SF2 (R = 0,48,
p = 0,08
, la figura 3D). Estos datos ponen de manifiesto que si bien había diferencias considerables entre las células en cuanto a la expresión de la proteína y la activación de la vía, ninguna de las proteínas /vías fueron fuertemente asociada con SF2 en esta línea celular cohorte.
A) Histograma que muestra el ZeptoMARK proteína-array deriva abundancia para las 16 líneas celulares de cáncer de cuello uterino. El nivel de las pantallas del eje y la proteína E-cadherina (intensidad de fluorescencia relativa (RFI) para cada una de las líneas celulares (eje x). Las líneas celulares se clasifican en base a la expresión de TP63. La agrupación en p63 negativo y p63 líneas celulares positivas confirma la asociación de e-cadherina con p63. el valor p es la prueba T derivada comparar la diferencia en la expresión de e-cadherina entre el p63 positivos y negativos grupos, las barras de error muestran la desviación estándar de dos réplicas biológicas. B) X-y diagrama de dispersión que muestra E- cadherina expresión génica (array Exon) en el eje Y contra la expresión de la proteína E-cadherina en el eje x. La línea representa una correlación perfecta. Exón de matriz de puntos de datos representan el promedio de múltiples probesets exonic (n = 19) a partir de una única matriz de expresión Exon, donde las proteínas de datos son la media de dos repeticiones biológica. C) Mapa de calor que muestra la agrupación de proteínas con expresión similar (eje y) en la proteína ZeptoMARK de datos de perfiles. Las líneas celulares calificados por SF2. colorear mapa de calor se basa en la fila Z-score. D) diagrama xy dispersión que muestra la expresión (eje y) de los 5 mejores proteínas a partir de LIMMA contra SF2 (eje x). Tabla resume los resultados de análisis de la expresión diferencial de proteínas Limma entre los grupos de alto y bajo SF2 y Pearson correlación de expresión de la proteína (RFI) contra SF2. valores de p denotan esas proteínas con expresión diferencial (* p & lt; 0,05 o ** p & lt; 0,01) entre los grupos de baja y alta SF2 según el análisis LIMMA. Sin embargo, estos no pasan falso descubrimiento tasa de corrección.
Cabeza y líneas celulares de cáncer de cuello muestran similitudes en la expresión génica global
La Tabla 2 resume las líneas celulares 11 HNSCC, que eran todos VPH negativo (Figura S2). Aunque informado de que el carcinoma de células escamosas, tres carecido de expresión de la proteína p63 mediante transferencia Western (Figura S3), y tenía bajos niveles de transcripción detectados por microarrays. La gama SF2 (0,3-0,8) fue similar a la de las líneas de cuello uterino (Figura 4A), pero las líneas celulares eran más HNSCC radioresistant en comparación con el cuello uterino (
p
= 0,003). La mediana de SF2, se utiliza para dividir las líneas celulares fue de 0,36 para el cuello del útero y 0,61 para las líneas celulares HNSCC. Al igual que con las líneas de células del cuello uterino, no hubo diferencia en SF2 entre las líneas celulares que expresan altos en comparación con los bajos niveles de
TP63 gratis (Figura 4B) y la agrupación jerárquica sin supervisión repartió las líneas celulares CECC en tres grupos que reflejan
TP63
expresión (Figura 4C). El grupo más periférica tuvo la menor
TP63
expresión, mientras que los dos restantes grupos dividen las líneas celulares con expresión & lt; /& gt; 6,0 TP63 (log
2). Estos datos muestran que ambos carcinoma de células y líneas CECC cervicales tienen radiosensitivities similares y perfiles de transcripción globales, con la mayoría de las diferencias relacionadas con el factor de transcripción p63. Como tal, la cohorte CECC es un tejido de tipo distinto de cuello uterino, pero debe ser un buen comparador de genes asociados SF2 en líneas celulares derivadas de cuello uterino y
viceversa.
A) que muestra el gráfico la media SF2 (log10) (eje y) para cada una de las 11 líneas celulares de cáncer de cuello uterino (eje x). Las barras de error muestran el error estándar de la media de 2-3 experimentos independientes. B) Gráfico que muestra que no hay diferencia en la expresión TP63 entre los grupos de alto y bajo SF2. Barras muestra la mediana de expresión. C) Agrupación jerárquica sin supervisión de las 1000 genes clasificados según su coeficiente de variación (de matriz de datos U133). colorear mapa de calor es por log
2 valor de la expresión. Las filas representan los genes y las columnas son las líneas celulares. dendrograma eje x (clusters) indica la similitud de las líneas celulares y el eje y dendrograma la similitud de genes. El grupo 1 representa dos muestras con los valores más bajos (TP63 p63 negativos). Grupo 2 muestra la agrupación de la otra línea de células p63-, junto con líneas de baja TP63 expresar. Cluster 3 agrupa todas las líneas con HNSCC & gt; 6.0 (la expresión log 2) la expresión TP63. D) Diagrama para representar el análisis SF2 integrada de las líneas de células del cuello uterino y la CECC. análisis de rango de productos (FDR & lt; 0,05) identificaron 96 genes en la cohorte de cuello uterino expresados diferencialmente entre las líneas de alta y baja de células SF2. Un análisis idéntico en las líneas celulares HNSCC identifica 97 probesets (42 genes) expresados diferencialmente entre las líneas de alta y baja de células SF2. PCA de los genes del cuello uterino muestra que ellos son capaces de separar las líneas de células de SF2. PCA de los genes HNSCC es igualmente capaz de separar las muestras en base a SF2. El diagrama de Venn muestra que sólo 4/138 genes son comunes entre las dos cohortes y de éstos sólo 2/138 son "congruentes" y asociado a la misma direccionalidad (SF2 alta /baja SF2 tanto en CECC y el cuello uterino). PCA muestra la expresión probeset de estos dos genes "comunes" y "congruentes" (MGST1 y TFPI) en el NCI-60 conjunto de datos. El NCI-60 superior PCA muestra puntos de datos de color para SF2 mediana e inferior PCA color de 0,2, utilizado anteriormente para dividir líneas celulares radiosensibles y radioresistant en esta cohorte.
Los genes expresados diferencialmente entre los grupos de alto y bajo SF2 son sobre todo tipo celular específico y no puede estratificar el NCI-60 líneas celulares
las diferencias entre las líneas celulares particionan utilizando la mediana SF2 se exploró el uso de todo el genoma de perfiles de expresión. Sin diferencialmente expresado transcripciones fueron encontrados por
LIMMA
siguiente corrección de múltiples ensayos. Este fue también el caso para los modelos lineales que incorporan el VPH y la expresión de p63 como covariables, o en un ANOVA de 3 vías. Si bien se identificaron los genes que son expresados diferencialmente (prima p & lt; 0,05), ninguno pasó la corrección de falsos descubrimiento. Un método alternativo, Rango Análisis del producto, aplicado a las líneas de células del cuello uterino identificó 96 genes expresados diferencialmente (PFP? 0,01) (Tabla S3). Estos genes se separaron las muestras del cuello uterino en el primer componente principal, que representan el 36% de la variación (Figura 4D), pero no podían separar las líneas celulares CECC en base a SF2 (Figura S4A). Un análisis de reciprocidad en las líneas HNSCC identificó un número similar de probesets (n = 97, la cartografía de 42 símbolos únicos de genes, la APP & lt; 0,01) expresados diferencialmente entre alta y baja SF2 (Tabla S4). Estos genes se comportaron bien en la separación de las líneas celulares CECC (Figura 4D), pero no lograron separar las líneas del cuello uterino (Figura S4B).