Extracto
JAG1 es un ligando de Notch que juega un papel crítico en múltiples vías de señalización. Sin embargo, la funcionalidad de JAG1 en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) no ha sido investigado a fondo. Por comparación de los perfiles de ARN transcritos de genes en el par de líneas de células con capacidad de invasión diferencial, identificamos JAG1 como un potencial promotor de la metástasis en el cáncer de pulmón. La expresión ectópica de JAG1 en las células de cáncer de pulmón ha mejorado la migración celular y la invasión, así como metástasis
in vitro
y
in vivo
. Por el contrario, desmontables de JAG1 con siRNA en células de cáncer altamente invasivos condujo a la reducción de la migración y la invasión. En los análisis clínicos, la expresión de ARNm JAG1 fue mayor en los tumores que en los tejidos normales adyacentes en 14 de 20 pacientes con carcinoma de células escamosas (SCC). SCC pacientes con mayor transcripción JAG1 tuvieron una supervivencia global pobres que aquellos con JAG1 bajo transcrito. el análisis de microarrays indicó que la transcripción JAG1 forzada se asoció con una elevada transcripción de ARN HSPA2, que desempeñó un papel en la promoción de la migración celular y la invasión del cáncer. En conclusión, este es el primer estudio que demostró que JAG1 podría actuar como un potencial marcador pronóstico y el eje JAG1 /HSPA2 media la malignidad del cáncer de pulmón, al menos en parte,
Visto:. Chang WH, Ho aC, Hsiao YJ, Chen JS, Yeh CH, Chen HY, et al. (2016) JAG1 se asocia a peor supervivencia a través de inducción de metástasis en el cáncer de pulmón. PLoS ONE 11 (3): e0150355. doi: 10.1371 /journal.pone.0150355
Editor: P. Srikumar Chellappan, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos |
Recibido: 28 Septiembre, 2015; Aceptado: 12 de febrero de 2016; Publicado: 1 Marzo 2016
Derechos de Autor © 2016 Chang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. El microarray CEL archivos, datos normalizados e información experimental se han depositado en la Expresión génica Omnibus y están disponibles por el número de acceso GSE14995
Financiación:. Este estudio fue apoyado por las subvenciones del Ministerio de Ciencia y Tecnología, Taiwán, ROC (NSC98-2314-B-002-038-MY2 NSC101-2911-I-002-303, 103-2320-B-002 -052, 104 hasta 2320-B-002 -030). La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. La metástasis es un determinante importante que contribuye a la progresión del cáncer y la mortalidad, y de la motilidad celular y la invasión es el paso inicial [2]. En general, la mayoría de cáncer se puede atribuir a un número creciente de alteraciones genéticas, que incluyen activación de oncogenes o genes supresores de tumores inactivación [3, 4]. En nuestros estudios anteriores, hemos establecido una serie de líneas celulares de cáncer de pulmón con variada capacidad de invasión [5] y hemos identificado y validado varios oncogenes o supresores tumorales de estas líneas celulares modelo [6-8]. El descubrimiento de estas alteraciones puede beneficiar a pacientes con cáncer como marcadores de cáncer u objetivos druggable [9]. Sin embargo, la mayoría de las alternancias aún no se han dilucidado por completo.
JAG1 es uno de los ligandos para los receptores Notch canónicas. Después de la interacción de ligandos con los receptores, los receptores Notch se someten a escisiones proteolíticas, y el dominio intracelular de Notch se translocan en el núcleo y activa la expresión de genes diana Notch, lo que resulta en la diferenciación celular, la proliferación, la supervivencia y la apoptosis [10]. En la enfermedad humana, JAG1 ha informado que se asocia con el síndrome de Alagille [11, 12]. Además, JAG1 es altamente expresado en el meduloblastoma y el cáncer colorrectal [13, 14], y hace que la supervivencia global más pobre en el cáncer de mama [15]. En el cáncer de pulmón de células no pequeñas, JAG1 se ha identificado en un nueve genes de firmas que posiblemente se pueden utilizar como marcadores genéticos [16]. A pesar de estas observaciones clínicas, la contribución molecular y la funcionalidad de JAG1 en las enfermedades neoplásicas aún no se han establecido.
En este estudio, hemos explorado el impacto de JAG1 sobre la invasión del cáncer de pulmón, tanto
in vitro
y
in vivo
. Se utilizó el análisis de microarrays para investigar la posible señalización corriente abajo de JAG1. Clínicamente, se analizaron también la correlación de JAG1 transcripción y las supervivencias de NSCLC.
Se establecieron Materiales y Métodos
Cultivo de células
células
CL1-0 y CL1-5 y caracterizado como se describe anteriormente [5]. A549 y H226 se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 con suero bovino fetal al 10% y 1% de penicilina-estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA) a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2.
construcción del plásmido, transfección y clones estables
los plásmidos JAG1 y HSPA2 que expresan, pcDNA3.1-JAG1-V5 y pcDNA3.1-HSPA2-V5, se construyeron clonando el JAG1 humano de longitud completa o ADNc con HSPA2 V5 etiqueta C-terminal en el vector pcDNA3.1 (Life Technologies, Grand Island, NY), respectivamente. Dos siRNA utilizado para el ARNm JAG1 caída se adquirieron de Silenciador
® Seleccionar siRNA (Cat. S1175 y s1176) (Life Technologies, Grand Island, NY). Todos los experimentos de transfección se realizaron con Lipofectamine
® reactivo de 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. CL1-0 células fueron transfectadas con pcDNA3.1-JAG1 o vector pcDNA3.1 vacío. Después de cultivar en medio que contiene 1 mg /ml de geneticina (G418) durante 2-3 semanas, se agruparon, se aislaron clones estables. Los clones que expresan la región de codificación de cDNA JAG1 se mantuvieron en medio que contiene 0,5 mg /ml de geneticina y se usaron para análisis adicionales.
cuantitativa en tiempo real RT-PCR
RNA total se aisló por el reactivo TRIzol (Life Technologies, Grand Island, NY), y 1 g de ARN total fue utilizado en la síntesis de ADNc con cebadores hexámeros aleatorios usando transcriptasa inversa Superscript II (Life Technologies, Grand Island, NY). 20 ARNs ng o 10 ng ADNc sirvieron como molde para la detección de la expresión del ARNm por PCR en tiempo real cuantitativa con SYBER verde. El nivel de expresión de ARNm relativa del gen diana se determinó como -ΔCT = - [CT
target-CT
TBP]. La relación /mRNA TBP objetivo se calculó como 2-Ct × K, en la que K es una constante. La secuencia del cebador detalle para cada gen diana en tiempo real PCR cuantitativa se enumeran en la Tabla S1.
inmunotransferencia
La preparación de lisados de células enteras y Western blot se describe como se ha mencionado anteriormente [7 , 8]. Brevemente, los lisados celulares para inmunotransferencia se prepararon en tampón RIPA (1% NP-40, desoxicolato de sodio 0,5%, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5) que contenía 1X completa cóctel inhibidor de proteasa (Roche, Indianapolis, IN). Las muestras de proteína se separaron por 8% ~ 12% de SDS-PAGE, y se transfirieron a una membrana de poli (difluoruro de vinilideno) (Merck Millipore, Billerica, MA). Las proteínas se sondaron con anticuerpos específicos, visualizado por kit de ensayo de quimioluminiscencia (Merck Millipore, Billerica, MA) y detectado por FUJIFILM LAS-3000 sistema ECL (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Los anticuerpos primarios utilizados para la inmunotransferencia fueron los siguientes: anti-JAG1, anti-NICD-3 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-NICD-1, anti-NICD-2, anti-NICD-4 (GeneTex, Irvine , CA), anti-β-actina (Sigma, St Louis, MO), y anti-V5 (Invitrogen, Carlsbad, CA). La tinción inmunohistoquímica de fluorescencia en la biopsia del tumor de los pacientes fue descripted en S1 texto.
ensayos de migración y la invasión
in vitro se realizó
migración celular y la invasión ensayos como se describe anteriormente [ ,,,0],17] utilizando transwell cámaras (8 micras de tamaño de poro; Costar, Cambridge, MA). En ensayo de migración, 1 × 10
5 células se sembraron en la parte superior de los filtros de policarbonato y se incubaron durante 8 horas. Los filtros se tomaron muestras con un hisopo de algodón, se fijaron con metanol y después se tiñeron con una solución de Giemza (Sigma, St Louis, MO). Para el ensayo de invasión, los filtros fueron recubiertas con Matrigel (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), y 1 × 10
5 células fueron sembradas en el Matrigel y se incubaron durante 18 horas. Las células unidas a la superficie inferior del filtro se contaron con un microscopio óptico (aumento x 100).
En vivo
metástasis
El estudio en animales fue aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión de la Universidad Nacional de Taiwán con CICUAL Nº 20080239. Para el ensayo de metástasis [7], 1 × 10
6 células se lavaron y se resuspendieron en 100 l de PBS. Posteriormente, las células fueron inyectadas en la vena lateral de la cola de los ratones SCID de 6 semanas de edad (suministrado por el Centro de Animales de Laboratorio de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Taiwán, Taipei, Taiwán). Después de la implantación de 10 semanas, los pulmones de los ratones se extrajeron y se fijaron en formalina al 10% y el número de lesiones pulmonares micrometastásicas se contaron bajo un microscopio de disección. tejidos embebidos se cortaron y se tiñeron con hematoxilina-eosina para el análisis histológico.
Pacientes y muestras de tejido
Esta investigación se llevó a cabo después de la aprobación por la Junta de Revisión Institucional del Hospital Universitario Nacional de Taiwán con NTUH-REC Nº de protocolo 200812077R. Escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes. Todas las muestras de tejido tumoral eran tratamiento ingenuo porque ninguno de los pacientes habían recibido quimioterapia neoadyuvante o terapia de radiación antes de la cirugía. Los especímenes de tejido de cáncer de pulmón y la parte no tumoral de pulmón obtenido en la cirugía fueron inmediatamente se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. La clasificación histológica de estos tumores se basó en los criterios de la Organización Mundial de la Salud. El tamaño del tumor, invasión local y metástasis a los ganglios linfáticos fueron determinadas durante el examen patológico. La puesta en escena final de la enfermedad se determinó a partir de una combinación de los resultados quirúrgicos y patológicos, de acuerdo con el sistema de tumor-nódulo-metástasis actual para la estadificación del cáncer de pulmón. Los datos de seguimiento se obtuvieron a partir de las historias clínicas de los pacientes e informaron de nuestro servicio de registro de tumores. tiempo de recaída se calcula a partir de la fecha de la operación a la fecha de la detección de recidiva local o metástasis sistémica. El tiempo de supervivencia se calculó a partir de la fecha de la operación a la fecha de la muerte. Los pacientes que mueren de complicaciones postoperatorias dentro de los 30 días después de la cirugía fueron excluidos del análisis de supervivencia, con el fin de evitar el sesgo. El análisis de la expresión de mRNA en pacientes JAG1 se descripted en S1 texto.
Análisis de microarrays
Para el análisis de microarrays de ADNc, la preparación de ADNc y la gama de hibridación se llevaron a cabo de acuerdo con el Affymetrix GeneChip Expresión Análisis Técnico Manual. Brevemente, el ARN total fue 8 g inverso-transcrito en presencia de un cebador T7 (de un ciclo kit de síntesis de ADNc; Affymetrix, Santa Clara, CA). El producto de ADNc se purificó y se transcribe
in vitro
con ribonucleótidos marcados con biotina (IVT kit de marcado; Affymetrix, Santa Clara, CA). Una parte de la ARN biotinilado fue fragmentado y se hibridó durante la noche para U133 genoma humano, más 2,0 GeneChip (Affymetrix, Santa Clara, CA). El GeneChip se lavó y desarrollado por el protocolo de tinción de amplificación proporcionada por Affymetrix. El GeneChip fue escaneada por Affymetrix GeneChip escáner 3000 7G, y las imágenes se extrajeron con Affymetrix GeneChip Software operativo (GCOS) versión 1.4. Todos los experimentos de hibridación se realizaron por triplicado biológica con sondas de ADNc preparadas a partir de CL1-0 /JAG1 y control /vector CL1-0. Los datos fueron filtrados por cambios de 2 veces bajo protección (FDR
p Hotel & lt; 0,05) utilizando Genespring GX 12.6 (Silicon Genetics, Redwood City, CA). Los microarrays CEL archivos, datos normalizados e información experimental se han depositado en la Expresión Génica Omnibus, y están disponibles por el número de acceso GSE14995. El procedimiento experimental detalle y siguió a la identificación de genes abajo Jag1 se descripted en S1 texto
El análisis estadístico
Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se analizaron por ANOVA (Excel, Microsoft, Taipei, Taiwán). .
p
valor & lt; 0,05 se considera estadísticamente significativo. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar.
Resultados
JAG1 se identifica como una metástasis-promover el potencial de genes
Para identificar los nuevos genes implicados en la metástasis del cáncer de pulmón, ADNc microarrays de expresión se utilizaron para estudiar un modelo de invasión de cáncer de pulmón en nuestros estudios anteriores [18]. Después de la comparación de perfiles de expresión de ARNm de las células de baja invasivos (CL1-0) y las células altamente invasivos (CL1-5), encontramos la expresión del ARNm de JAG1 era 113 veces mayor en CL1-5 que en CL1-0 (Fig 1A, izquierda). La expresión la expresión del transcrito y de la proteína de JAG1 tanto en las líneas celulares CL1-0 y CL1-5 fueron consistentes con los resultados obtenidos del análisis de microarrays (Fig 1A, medio y derecho). Para verificar si JAG1 juega un papel crítico en la regulación de la metástasis del cáncer, se utilizó enfoques de sobreexpresión y silenciar RNAi para modular JAG1 expresión transcripcional y realizamos transwell ensayos de migración y la invasión. Como se muestra en la figura 1B y 1C, la expresión forzada de JAG1 promovió la capacidad de la migración celular y la invasión en las células invasoras CL1-0 bajos. Por el contrario, desmontables de JAG1 inhibe ambas actividades en las células CL1-5 altamente invasivos. Estos datos sugirieron que JAG1 podría actuar como un nuevo candidato implicado en la aceleración de la metástasis del cáncer de pulmón. Identificación
(A) de JAG1 en un modelo de invasión de células de cáncer de pulmón. JAG1 está regulado en células de cáncer de pulmón altamente invasivos. A la izquierda, el nivel JAG1 ARNm se evaluó mediante el análisis de microarrays de oligonucleótidos. nivel medio, ARNm JAG1 se mide por tiempo real RT-PCR cuantitativa. Los experimentos se realizaron por triplicado y los datos se representan como media ± desviación estándar. Derecha, expresión de la proteína JAG1 se evaluó mediante Western blot. β-actina se utilizó como control interno. (B) JAG1 promueve la migración celular y la invasión
in vitro
. A la izquierda, JAG1 se sobreexpresa de forma estable en células CL1-0. JAG1 mRNA se midió por cuantitativa en tiempo real RT-PCR por triplicado. Los datos se representan como media ± desviación estándar. Central y derecha, la migración y la capacidad de invasión de las células con expresión CL1-0 JAG1 constitutiva y control de las células simuladas fueron evaluados mediante el ensayo de la migración y el ensayo de invasión de Matrigel. Los datos presentados como media ± desviación estándar de tres experimentos. *:
p Hotel & lt; 0,05 en comparación con el grupo simulado. (C) Derribo de JAG1 inhibe la migración celular y la invasión
in vitro
. Izquierda, JAG1 mRNA fue derribado por siRNAs en células CL1-5 ensayadas por tiempo real RT-PCR cuantitativa por triplicado. Dos diferentes siRNAs (siJAG1-1 y siJAG1-2) se utilizaron para silenciar JAG1. NC, control negativo. Central y derecha, la migración y la capacidad de invasión de transfectantes JAG1-silenciamiento se analizaron mediante ensayos de migración e invasión de matrigel. Los datos que se muestran como media ± DE; *:
p Hotel & lt; 0,05 en comparación con el control negativo.
JAG1 promueve la malignidad NSCLC
Para confirmar si el carácter oncogénico de JAG1 es un fenómeno universal, se realizó la migración transwell y ensayos de invasión en otros dos líneas celulares. Este fenómeno se ha recapitulado en otras líneas celulares de cáncer de pulmón de células no pequeñas. Hemos encontrado que la expresión forzada de forma transitoria JAG1 promovió la migración y la capacidad invasiva
in vitro
no sólo en CL1-0 sino también en las células A549 y H226 (Figura 2A). Para confirmar si las funciones Jag1 en la promoción de la metástasis
in vivo
, las células fueron transfectadas con CL1-0 JAG1-expresión o vector vacío y se introdujeron por vía intravenosa en ratones NOD SCID mediante inyección de cola para evaluar su capacidad de metástasis. Después de diez semanas de la inyección, todos los ratones fueron sacrificados y los focos de tumor metastásico en los pulmones se examinaron y se contaron. Los ratones inyectados con transfectantes JAG1 (n = 13) desarrollado nódulos de metástasis pulmonares más que transfectantes falsos (n = 10) (Fig 2B, izquierda y centro). Las lesiones metastásicas en pulmón secciones seleccionadas al azar fueron teñidas por hematoxilina y eosina para confirmar histológicamente nódulos tumorales (Figura 2B, derecha). Estos resultados confirmaron además que JAG1 juega un papel crítico en la modulación de la metástasis del cáncer.
(A) JAG1 promueve la migración celular y la invasión
in vitro
. A la izquierda, JAG1 se sobreexpresa de manera transitoria en células A549 y H226. JAG1 mRNA se midió por cuantitativa en tiempo real RT-PCR y normalizado a TBP por triplicado. , Capacidad de migración central y derecha y la invasividad de las células con células de sobreexpresión y control JAG1 transitorios fueron evaluados por los ensayos de migración e invasión de matrigel. *:
p Hotel & lt; 0,05, en comparación con el simulacro. Los datos se representan como media ± desviación estándar por triplicado. (B) JAG1 promueve la metástasis
in vivo
. A la izquierda, número de nódulos en ratones SCID. Las células Mock CL1-0 y líneas celulares que sobreexpresan JAG1 fueron inoculadas en ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID) mediante inyección en vena de cola. Después de 10 semanas, se sacrificaron los ratones. Número de tumores derivados de transfectantes simuladas y JAG1 se midió bajo el microscopio de disección. Los datos se representan como media ± desviación estándar (n = 10 en el grupo control maqueta y n = 13 en el grupo transfectante JAG1). *:
p Hotel & lt; 0,05, en comparación con el control simulado. Derecho, las apariencias de los pulmones de los ratones inyectados con CL1-0 transfectantes simuladas y Jag1 y el representante de H & amp; E secciones de tinción de los pulmones de los ratones. puntas de flechas rojas indican los nódulos tumorales metastásicas en los pulmones. Las flechas negras indican la micrometástasis de células de cáncer de pulmón.
Asociación de JAG1 expresión de ARNm y clínicos resultados
Dada la importancia de JAG1 en la invasión del cáncer
in vitro y
in vivo
, además, examinó el impacto de JAG1 sobre el progreso de los cánceres de pulmón. En primer lugar la expresión del ARNm JAG1 se midió en 63 tejidos normales adyacentes y NSCLC emparejados por cuantitativa en tiempo real RT-PCR. Aunque el
p-valor
no alcanzó significación estadística (
p = 0,058
), el ARNm JAG1 tenía una tendencia que era abundante en el tejido del tumor en lugar de en el tejido normal adyacente emparejado (Fig 3A). A continuación, se encontró que JAG1 estaba inclinado a expresar en partes tumorales en comparación con tejidos normales adyacentes de 14 de 20 carcinoma escamoso (
p
= 0,017, Figura 3B). Además, se investigó si la expresión de ARNm JAG1 se correlaciona con la supervivencia de los pacientes. Entre los 90 pacientes con CPNM, el nivel de ARNm de JAG1 no se correlacionó con la supervivencia global de los pacientes (Fig S1,
p = 0,9710
). Sin embargo, a pesar de que sólo había 35 pacientes con carcinoma de células escamosas entre los 90 pacientes con CPNM, ARNm bajo nivel de JAG1 había demostrado una mayor supervivencia global en pacientes con carcinoma escamoso que los pacientes con ARNm nivel más alto de JAG1 mostrada por la supervivencia de Kaplan-Meier análisis de log-rank pruebas (
p = 0,042
, la figura 3C). Multivariable de Cox análisis de regresión de riesgos proporcionales demostró que JAG1 la transcripción se asocia con la supervivencia global de carcinoma escamoso (pacientes con alta versus baja el nivel de ARNm JAG1, hazard ratio [HR] = 2,87; IC del 95% = 0,99 a la 8.33;
p
= 0,05).
(a y B) expresión JAG1 mRNA en tumor y partes normales del cáncer de pulmón. JAG1 mRNA en tumores y tejidos normales adyacentes de NSCLC (A) y los pacientes de carcinoma escamoso de subtipo (B) se evaluó por cuantitativa en tiempo real RT-PCR y normalizado a TBP. (C) JAG1 nivel de ARNm y la supervivencia global de los pacientes del subtipo de carcinoma escamoso. Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras, y
p
. & Lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
HSPA2 es una novela efector aguas abajo de JAG1 en CPNM
Por último, se utilizó el análisis de microarrays de oligonucleótidos de Affymetrix para identificar los 10 genes expresados diferencialmente superiores en las células CL1-0 Jag1-tranfected en comparación con el simulacro de transfectante (S2 y S3 Tablas). En particular, no se observó ninguna diferencia significativa de Notch1 y Notch2 y sus genes abajo (ASCL1, HES1, HEY1, y SLUG) el nivel de ARNm, excepto niveles de trazas diferencia de nivel de ARN Notch3 y Notch4 en las células NSCLC (S4 y S5 tablas). Con el fin de identificar nuevas moléculas de aguas abajo potencial JAG1, que en primer lugar realizó RT-PCR para validar genes con los cambios de expresión significativos analizados por el resultado de microarrays ya sea en transfectantes JAG1 o JAG1 silenciada CL1-0, CL1-5, A549 y líneas de células H226 (S3 Mesa). Entre todos los genes, HSPA2 exhibió tendencia coherente y esperada entre estos 10 genes cuando se manipulan JAG1. HSPA2, cuyas funciones celular en el cáncer de pulmón no están claras, se expresó más alta (1,4 veces en las células A549 y 1,2 veces en H226 células) en transfectantes JAG1 comparación con las células de control (Fig 4A). Por el contrario, la expresión de mRNA de HSPA2 se redujo en las células JAG1 desmontables (Fig 4B). Además, la sobreexpresión de V5-HSPA2 en CL1-0 aumento de la migración celular y la capacidad de invasión (Fig 4C y 4D). Con el fin de excluir los efectos línea celular, se confirmó aún más este fenómeno en más líneas celulares. Entre las líneas celulares de cáncer de seis pulmonares examinados, seleccionamos los más de dos líneas de baja Jag1 celulares nivel de ARNm, H1299 y H838, para exógeno que expresan JAG1 y las dos líneas celulares nivel de ARNm alta Jag1 la mayoría, HOP62 y H322M, para el silenciamiento JAG1 (S2 figura) . En H1299 y líneas celulares H838, la expresión de ARNm de HSPA2 fue inducida por JAG1 (Fig S3). En líneas celulares HOP62 y H322M, la expresión de ARNm de HSPA2 se redujo cuando JAG1 fue silenciado (S4 figura). Además, examinó si este /eje HSPA2 JAG1 era independiente de la señalización de Notch. estado proteolítica canónica de dominio intracelular de la familia Notch (NICD), incluyendo NICD1, NICD2, NICD3, y NICD4 se analizaron en líneas celulares JAG1 manipulado (Fig 5). Además, el nivel de transcripción de DLL1 y otras moléculas NOTCH aguas abajo incluyendo CBF1, babosa, snail1, SMAD3, HES1, HES3, HES5, HEY1, hey2, y MYOD1 también se abordaron. Los resultados indicaron que todas las baterías de NiCd y el nivel de ARNm de moléculas de aguas abajo (excepto HES1) tuvieron ningún cambio significativo en JAG1 sobreexpresa CL1-0 células (Fig 5A). Los resultados similares se pueden observar en JAG1 sobreexpresa H1299 (Figura 5B y S5 figura) y H838 (Figura 5B y S6 figura) líneas de células o líneas celulares JAG1 silenciados HOP62 y H322M (Figura 5C) en comparación con los experimentos de control. Sólo HES5 ARNm se vio afectada por JAG1 en la línea celular H1299. DAPT, un inhibidor de gamma secretasa para el bloqueo de la señalización de Notch, también fue incapaz de eliminar HSPA2 transcripcional sobre regulación de JAG1 (Fig S7). Esto apoya la regulación de Notch-independiente probable al menos en estas líneas celulares. Por último, nos gustaría probar si JAG1 se colocalized con HSPA2 inmunohistoquímica y tinción fluorescente se realizó en secciones de tejido de cáncer de pulmón los pacientes. El resultado se indica JAG1 y HSPA2 se expresaron de forma heterogénea en piezas tumorales y parcialmente colocalizó (S8 figura). Estos resultados sugieren que HSPA2 era un gen aguas abajo de JAG1 y también regula la migración de células tumorales y la invasión
.
(A y B) JAG1 se sobreexpresa de manera transitoria en A549 y H226 (A) o una caída por JAG1 siRNAs en CL1 -5 (B). HSPA2 mRNA se midió por cuantitativa en tiempo real RT-PCR y normalizado a TBP. (C) la capacidad de migración de las células CL1-0 con células de sobreexpresión y de control HSPA2 transitorios se evaluó mediante el ensayo de migración. *,
p Hotel & lt; 0,05, comparado con el control simulado. Los datos se representan como la media ± SD (n = 3 por grupo). (D) invasividad de las células CL1-0 con células de sobreexpresión y de control HSPA2 transitorios como evaluó mediante el ensayo de invasión de Matrigel. *,
p Hotel & lt; 0,05, comparado con el control simulado. Los datos se representan como la media ± SD (n = 3 por grupo).
celular se sobreexpresa transitoriamente JAG1 por el plásmido de expresión o JAG1 silenciada por siRNA estrategia seguida por inmunotransferencia con NICD1, NICD2, NICD3, y NICD4 anticuerpos o PCR cuantitativa en tiempo real para el análisis de moléculas de abajo NOTCH nivel de ARNm. (A) JAG1 sobreexpresa en células CL1-0 seguido por análisis de transferencia Western para baterías de NiCd estado proteolítica o PCR cuantitativa en tiempo real para el análisis NOTCH moléculas aguas abajo nivel de ARNm. (B) JAG1 sobreexpresa en líneas celulares H1299 y H838 seguido por análisis de transferencia Western para baterías de NiCd estado proteolítica. (C) JAG1 silenciada en líneas celulares y HOP62 H322M seguido por análisis de Western blot para las baterías de NiCd estado proteolítica. DAPT es un inhibidor de la gamma secretasa y se utiliza para el control de la señalización de Notch. UD, indeterminada debido al nivel de expresión indetectable; *,
p Hotel & lt; 0,05 en comparación con el control simulado. Los datos se representan como la media ± SD (n = 3 por grupo).
Discusión
descubrimiento de los oncogenes /genes supresores de tumores y la caracterización de los mecanismos moleculares subyacentes, además de clarificar la complicada la naturaleza de la tumorigénesis y la progresión del cáncer, sino también proporcionan una base para el desarrollo de mejores estrategias en el diagnóstico de cáncer, el pronóstico, la predicción y la terapia en el futuro. Nuestros resultados demostraron el papel oncogénico de JAG1 en cáncer de pulmón, la promoción de la invasión del cáncer y la metástasis. Los datos clínicos mostraron que la expresión JAG1 mRNA se asocia con una pobre supervivencia en pacientes con carcinoma escamoso subtipo de NSCLC. En un estudio anterior, la expresión de JAG1 en los tejidos pulmonares de la fibrosis pulmonar idiopática, lo que predispone al cáncer de pulmón, fue hasta reguladas. Por otra parte, la expresión de la proteína de JAG1 de las lesiones de metaplasia escamosa es positiva en 83% de los casos ensayados por tinción inmunohistoquímica [19]. Por lo tanto, la expresión JAG1 en los cánceres de pulmón, incluyendo el carcinoma epidermoide, pueden tener un alto impacto de las implicaciones clínicas.
Las vías de señalización Notch se consideran generalmente ser inducida por ligando [10], y los receptores y ligandos son altamente co -expresada en el cáncer [15, 20]. De acuerdo con nuestros datos de microarrays, la sobreexpresión de JAG1 no resultó significativamente en vía de señalización Notch (excepto NOTCH3 con el cambio 1,67 veces) en las células CL1-0 (S4 Tabla). El resultado de la validación de RT-PCR cuantitativa en tiempo real también proporcionó conclusiones similares (S5 tabla). La expresión equívoca de NOTCHs y moléculas aguas abajo en JAG1 transfectadas CL1-0 puede resultar de la población celular heterogénea. Además, HES1 fue ligeramente hasta reguladas en JAG1 sobreexpresa CL1-0 células (Figura 5A y la Tabla S5). Por lo tanto, no podemos excluir la participación de señalización Notch en especial la señalización en CL1-0 NOTCH3. ligandos de Notch se ha informado que tiene actividad de señalización ligando intrínseca independiente de los receptores Notch. Después de las modificaciones post-traduccionales, procesamiento proteolítico, la endocitosis y el tráfico de membrana, los ligandos de Notch serían multifuncional [21]. Estos implicaban que JAG1 en partes de NSCLC puede inducir vías de señalización no canónicos. En este estudio, se analizaron plenamente la señalización Notch en JAG1 sobreexpresa líneas celulares de cáncer de pulmón mediante el examen de la situación proteolítica de moléculas de NiCd y aguas abajo de la señalización de Notch. Sólo HES5 había encontrado a reducirse en JAG1 sobreexpresa H1299 línea celular (Figura S5). Si esto tenía todavía se necesita importancia en la metástasis tumoral que ser investigado. En conjunto, nuestros resultados indicaron que JAG1 también es capaz de mediar en la migración celular, invasión y metástasis de NSCLC a través de una vía de Notch-independiente
Varios estudios han informado de que JAG1 media múltiples vías de señalización tales como:. AP-1 , MAPK, EGFR, NF-κβ, y IL-6 en diferentes células tumorales [22 a 26]. Nuestros datos de microarrays indicaron que JAG1 modula varios genes tales como la molécula de adhesión con Ig dominio 2 similar (AMIGO2), inhibina, Beta E (INHBE), choque térmico 70 kDa proteína 2 (HSPA2), proteína de esperma Asociado con el núcleo, ligada al cromosoma X , miembro de la familia (SPANX), y G receptor acoplado a proteína, Clase C, Grupo 5, el miembro B (GPRC5B). HSPA2 se ha encontrado que sobreexpresan en muchos tipos de cáncer. Además, los pacientes con mayor expresión HSPA2 tuvieron una supervivencia general más corta en comparación con los pacientes HSPA2 inferiores [27-30]. Estos son consistentes con nuestra
in vitro
datos que HSPA2 juega un papel oncogénico en líneas celulares de cáncer. Es importante destacar que proporciona una nueva representación del mecanismo de señalización HSPA2.
Aunque el mecanismo subyacente de HSPA2 en la metástasis del cáncer fue menos documentadas, su papel crítico en el crecimiento del tumor y el potencial metastásico se había asumido. Sobre la base de su participación de la formación del complejo activo B1 CDC2 /ciclina y la expresión en los tumores, se puede regular propiedades celulares de cáncer de malignidad como la migración y la invasión [31-34]. Recientemente, se informó de HSPA2 que se expresó en SCC en lugar de en el adenocarcinoma y se correlacionó con la supervivencia global pobre, el apoyo a nuestro hallazgo en SCC [29]. Era posible que HSPA2 correlaciona con escasa supervivencia en SCC debido al efecto anti-apoptosis a través de sus factores de aguas abajo tal como el factor derivado del epitelio de la lente de crecimiento (LEDGF) [35]. Recientemente, también se informó de proteína de choque térmico 70 para interactuar con el NICD1 y contribuir a Notch de señalización [36]. En este estudio, hemos destacado el papel de la señalización de Notch no canónica inducida JAG1 en el CPNM. Aunque JAG1 y HSPA2 solamente se colocalized parcialmente en la biopsia del tumor del paciente (Fig S8), la regulación de HSPA2 por JAG1 podría ser un hallazgo importante para los tumores malignos de células de cáncer de pulmón. Ya sea JAG1 puede interactuar con otros receptores que NOTCHs e inducir HSPA2 transcripcional sobre regulación necesita ser investigado más a fondo. La posibilidad de HSPA2, una proteína de choque de calor, para ser una diana terapéutica potencial puede ser previsto. En resumen, nuestros resultados son los primeros en formar la base de que JAG1 sirve como un biomarcador pronóstico y el eje JAG1 /HSPA2 contribuye a la malignidad del cáncer de pulmón.
Apoyo a la Información
S1 Fig. JAG1 expresión y la supervivencia de los pacientes con CPNM
doi:. 10.1371 /journal.pone.0150355.s001 gratis (PDF)
S2 Fig. JAG1 la expresión del ARNm endógeno en las líneas celulares de cáncer de pulmón de seis
doi:. 10.1371 /journal.pone.0150355.s002 gratis (PDF)
S3 Fig. HSPA2 expresión del ARNm es regulada por la sobreexpresión de ARNm JAG1
doi:. 10.1371 /journal.pone.0150355.s003 gratis (PDF)
S4 Fig. HSPA2 expresión del ARNm es el regulado por JAG1 ARNm silenciamiento
doi:. 10.1371 /journal.pone.0150355.s004 gratis (PDF)
S5 Fig. la expresión del ARNm de la muesca moléculas de abajo en JAG1 sobreexpresa células H1299
doi:. 10.1371 /journal.pone.0150355.s005 gratis (PDF)
S6 Fig. la expresión del ARNm de la muesca moléculas de abajo en JAG1 sobreexpresa H838 células
doi:. 10.1371 /journal.pone.0150355.s006 gratis (PDF)
S7 Fig. Sobre regulación de HSPA2 por JAG1 era independiente de la señalización de Notch
doi:. 10.1371 /journal.pone.0150355.s007 gratis (PDF)
S8 Fig. tinción inmunohistoquímica fluorescente para JAG1 y HSPA2
doi:. 10.1371 /journal.pone.0150355.s008 gratis (PDF) sobre Table S1. Primer secuencias de genes diana utilizados en SYBR verde en tiempo real RT-PCR cuantitativa
doi: 10.1371. /journal.pone.0150355.s009 gratis (PDF) sobre Table S2.