Extracto

JKA97, un análogo de bencilideno de harmina, se ha encontrado para ser un candidato a fármaco prometedor para el tratamiento del cáncer humano, aunque los mecanismos moleculares subyacentes no han sido plenamente demostrado. En este estudio se evaluaron los efectos de JKA97 sobre las células del cáncer de mama humano
in vitro
y
in vivo
. JKA97 inhibió el crecimiento y la proliferación de MCF7 (p53 de tipo salvaje), MCF7 (p53 knockdown) y MDA-MB-468 (mutante p53) células de una manera dependiente de la dosis. El tratamiento con JKA97 detenido células de cáncer de mama en fase G1 y la apoptosis inducida. JKA97 también suprimió significativamente el crecimiento de MCF7 y MDA-MB-468 tumores de xenoinjertos. Se regula los niveles de expresión de los reguladores de fase G1, como p21, p27, ciclina, y cylinD1. JKA97 activado transcripción p21, independiente de p53, pero tuvo poco efecto sobre la proteína p21 estabilidad /degradación. En resumen, nuestros resultados sugieren que JKA97 inhibe el crecimiento celular del cáncer de mama humano a través de la activación de p21, p53 independiente de, que proporciona una base para el desarrollo de este compuesto como un nuevo fármaco para el tratamiento del cáncer de mama humano

Visto:. Yang X , Wang W, Qin JJ, Wang MH, Sharma H, Buolamwini JK, et al. (2012) JKA97, un nuevo benciliden analógica de harmina, ejerce efectos anti-cáncer mediante la inducción de la detención de G1, la apoptosis y la independiente de p53 sobre regulación de p21. PLoS ONE 7 (4): e34303. doi: 10.1371 /journal.pone.0034303

Editor: Gen Sheng Wu, Wayne State University, Estados Unidos de América

Recibido: 19 Enero, 2012; Aceptado: 28 Febrero 2012; Publicado: 27 Abril 2012

Derechos de Autor © 2012 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. R.Z. fue apoyado por subvenciones del NIH R01 CA112029 y R01 CA121211 y una subvención de Susan G. Komen for the Cure (BCTR070731). M.H.W. fue apoyado por el NIH subvención R01 CA91980. J.K.B. fue apoyado por el NIH subvención R15 CA100102. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer de mama es uno de los cánceres más comúnmente diagnosticados y las principales causas de muerte por cáncer en mujeres en todo el mundo. Según los datos estadísticos de GLOBOCAN, aproximadamente 1,38 millones de nuevos pacientes fueron diagnosticados con cáncer de mama y alrededor de 458.400 en todo el mundo murieron de la enfermedad en 2008 [1]. En las últimas dos décadas, las tasas de mortalidad por cáncer de mama han disminuido debido a la detección temprana, el aumento de la conciencia y mejoradas o nuevas terapias. Sin embargo, ciertas formas de cáncer de mama son particularmente agresivos y presentan un mal pronóstico. Los pacientes con cáncer de mama en recaída en estadio avanzado o, a menudo muestran una respuesta modesta a las terapias existentes clínicamente e incluso pueden mostrar resistencia a los agentes quimioterapéuticos convencionales [2] - [4]. La escasez y la ineficacia de la terapéutica practicables hace que el tratamiento exitoso del cáncer de mama un desafío y requiere el descubrimiento de fármacos quimioterápicos alternativos con nuevos mecanismos anticancerígenos.

derivados sintéticos orientadas a los productos naturales han jugado un papel importante en la lucha contra la descubrimiento de fármacos contra el cáncer [5], [6]. Varios agentes quimioterapéuticos utilizados ampliamente como el paclitaxel y actinomicina C fueron desarrollados originalmente a partir de productos naturales. Harmina, un alcaloide de la β-carbolina obtenido de las semillas de la planta venenosa
Peganum harmala, España ha sido usada en medicina desde hace tiempo como un fármaco antihipertensivo; actúa mediante la inhibición reversible de la monoaminooxidasa A. Estudios en la última década reveló que harmina también poseía propiedades anti-proliferativas y citotóxicas potentes [7], [8].

JKA97, también conocido como metoxi-1-styryl- 9H-pirido [3,4-b] indol (MW:. 286,35; figura 1A), es un análogo de bencilideno de harmina [9], [10]. Un informe reciente mostró que JKA97 podría inducir la apoptosis de células de cáncer de hígado de colon y
in vitro
y
in vivo
por un mecanismo dependiente de Bax y p53-independiente [10]. Sin embargo, las actividades contra el cáncer de JKA97 en otros tipos de cáncer y los mecanismos moleculares precisos del compuesto no se conocen bien. En el presente estudio, hemos explorado las actividades antitumorales de JKA97 contra las células de cáncer de mama con diferentes antecedentes genéticos, y trató de aclarar aún más los posibles mecanismos de acción, proporcionando una base para el desarrollo futuro de este agente como terapia contra el cáncer de mama humano.

(A) estructura química de JKA97. (B) Las concentraciones de JKA97 inducir la inhibición del crecimiento del 50% (IC
50) en células de cáncer de mama, en relación con los controles correspondientes, basados ​​en el ensayo de MTT. células MCF7, MDA-MB-468, y MCF7 p53KD se expusieron a varias concentraciones de JKA97 durante 72 hrs. efectos (C) Anti-proliferativos de JKA97 sobre las células de cáncer de mama. Las células se expusieron a diversas concentraciones de JKA97 durante 48 horas, seguido por el ensayo de incorporación de BrdU. El índice de proliferación se calculó frente a las células de control sin tratar (* P & lt; 0,05). (D) La inducción de la apoptosis en células de cáncer de mama por JKA97. Las células se expusieron a diversas concentraciones de JKA97 durante 24 horas, seguido por la medición de la apoptosis mediante el ensayo de Anexina V. El índice apoptótico se calculó frente a las células de control sin tratar (* P & lt; 0,05). (E) Efectos de JKA97 en la distribución del ciclo celular de células de cáncer de mama. Las células se expusieron a diversas concentraciones de JKA97 durante 24 horas, seguido de medición de contenido de ADN por citometría de flujo. La distribución del ciclo celular se evaluó mediante la comparación con la de las células control (* P & lt; 0,05). Todos los ensayos se realizaron por triplicado. Los resultados fueron de al menos tres experimentos repetidos, por separado.

Resultados

JKA97 disminuye el crecimiento de células de cáncer de mama
in vitro se evaluó

JKA97 por sus efectos sobre la viabilidad celular de cáncer de mama
in vitro fotos: por el uso del ensayo MTT. Tres líneas celulares de cáncer de mama humano que representan tres fondos genéticos diferentes (MCF7 /p53 de tipo salvaje; desmontables MCF7 /p53, y MDA-MB-468 mutantes /p53) se expusieron a diversas concentraciones del compuesto de ensayo (0, 1, 2,5, se determinaron los 5, 10, 25, y 50 mM) durante 72 hrs, y los porcentajes de supervivencia celular. Como se ve en la Fig. 1B, el compuesto demostró IC
50 valores de menos de 20 M (6,6 a 19,0 m). Las células MDA-MB-468 y MCF7 p53KD parecieron ser más sensibles al compuesto de células MCF7.

JKA97 inhibe la proliferación de células de cáncer de mama
in vitro

Similar a los efectos en la supervivencia celular, JKA97 inhibió la proliferación celular de una manera dependiente de la dosis (Fig. 1C). Se observaron efectos antiproliferativos significativos en los tres tipos de células con p53 diversos orígenes. A una concentración de 20 mM, JKA97 inhibió la proliferación en aproximadamente un 35%, 35%, y 45%, en MCF7, las células MDA-MB-468, y MCF7 p53KD, respectivamente.

JKA97 induce apoptosis de mama las células cancerosas
in vitro

Además de inhibir la proliferación, la apoptosis también JKA97 inducida en células de cáncer de mama. Como se ilustra en la Fig. 1D, los tres de las líneas celulares de cáncer de mama examinados exhibió un aumento significativo (P & lt; 0,05) en la apoptosis tras la exposición a una concentración 20 mM del compuesto. En las células MCF7 p53KD MCF7, MDA-MB-468, y, a 20 M JKA97 aumentó el índice apoptótico 3,9 veces, 5 veces, y 4,2 veces, respectivamente, en comparación con la de las células de control.

JKA97 causa arresto fase G1 en células de cáncer de mama
in vitro

también se observó que JKA97 inhibe la progresión del ciclo celular, dando lugar a la detención en la fase G1 del ciclo celular en una dosis de manera dependiente en las tres líneas celulares (Fig. 1E). En las células tanto MCF7 y MCF7 p53KD, incluso a la concentración 5 mM, JKA97 condujo a una disminución significativa (P & lt; 0,05) aumento en el número de células en la fase G1. A la concentración de 20 mM, la mayoría de las células fueron detenidas en la fase G1 (P & lt; 0,05).

JKA97 reduce el crecimiento de tumores de xenoinjertos
in vivo

Para determinar si el compuesto también puede ejercer efectos anti-cáncer
in vivo
, JKA97 se administró a ratones desnudos portadores de tumores de xenoinjertos de MCF7 o MDA-MB-468. En el modelo de xenoinjerto de MCF7, la dosis alta de JKA97 (25 mg /kg) inhibió el crecimiento del tumor en aproximadamente un 60% (P & lt; 0,05) en el día 18, con la dosis baja (5 mg /kg) también conduce a la inhibición del crecimiento tumoral significativa (50%, p & lt; 0.05; Fig. 2A1). El
in vivo
actividad anticancerígena en de JKA97 se procedió a investigar en MDA-MB-468 modelo de xenoinjerto. Este modelo parecía ser ligeramente menos sensible a la droga, con la dosis baja (5 mg /kg) y dosis alta (10 mg /kg) la disminución del crecimiento tumoral en aproximadamente 45% y 52%, respectivamente (P & lt; 0.05; Fig. 2B1). Además, no hubo diferencias significativas en los pesos corporales entre los controles y los animales tratados con JKA97, o cualquier anormalidad de órganos brutos en la necropsia en ninguno de los grupos (Figs. 2A2 y B2).

JKA97 se administró mediante inyección i.p. inyección a ratones desnudos portadores de MCF7 (A1) o tumores de xenoinjertos MDA-MB-468 (B1). Para los ratones portadores de tumor de xenoinjerto de MCF7, grupos de tratamiento recibieron JKA97 a dosis de 5 mg /kg /día o 25 mg /kg /día, 5 días /semana, durante 6 semanas; para los ratones portadores de tumores de xenoinjerto de MDA-MB-468, los grupos de tratamiento recibieron dosis a 5 mg /kg /día o 10 mg /kg /día, 5 días /semana, durante 18 días. Los grupos de control recibieron sólo el vehículo. Los animales también fueron controlados por cambios en el peso corporal como un marcador sustituto para la toxicidad cuando se administró a ratones desnudos portadores de (A2) MCF7 o (B2) tumores de xenoinjertos MDA-MB-468. Al final de los experimentos, los tumores de xenoinjertos se retiraron y se toma una fotografía (A3 y B3).

JKA97 hasta regula la expresión de p21 en una forma independiente de p53

siguiente investigado el mecanismo (s) de la acción de JKA97 mediante el examen de sus efectos sobre los niveles de expresión de diversas proteínas implicadas en la progresión del ciclo celular. Las tres líneas celulares se trataron con varias concentraciones de JKA97 durante 24 horas, las células tratadas mostraron un aumento de expresión de p21 en una forma dependiente de la dosis. Además, CyclinD1, ciclina, y E2F1 disminuyeron, mientras que p27 se incrementó, muy probablemente debido a la activación de p21 (Fig. 3A). Se han tratado más las tres líneas celulares con 10 mM JKA97 durante tiempos variables, como se muestra en la Fig. 3B. Los niveles de proteína p21 se incrementaron de una manera dependiente del tiempo en todas las células de la prueba, independientemente del estado de p53.

células (A) MCF7, MDA-MB-468, y MCF7 p53KD fueron expuestas a diferentes concentraciones de JKA97 durante 24 horas, y la expresión de las proteínas p53 y p21 se determinó mediante análisis de transferencia Western. (B) Las células se expusieron a 10 mM de JKA97 durante el tiempo indicado, y la expresión de las proteínas p53 y p21 se determinó mediante análisis de transferencia Western. β-actina se utilizó como un control de igual carga de las muestras.

JKA97 tiene pocos efectos sobre la estabilidad de la proteína p21

Los efectos de JKA97 sobre la regulación de p21 se determinaron también en nivel postranscripcional. Las tres líneas celulares se expusieron a 10 mM de JKA97 o disolvente durante 24 horas seguido de la adición del inhibidor de la síntesis de proteínas, cicloheximida (CHX, 10 M). Como se muestra en la Fig. 4A, no había ninguna diferencia apreciable en la estabilidad de proteínas p21 entre las células expuestas a JKA97 y los expuestos únicamente al disolvente.

células (A1) MCF7, MDA-MB-468, y MCF7 p53KD se expusieron a diversas concentraciones de JKA97 o vehículo durante 24 horas, seguido por la exposición a la cicloheximida proteína inhibidora de la síntesis de (CHX, 10 mg /ml). expresión de la proteína p21 se detectó mediante transferencia de Western en diferentes momentos después de la exposición de CHX. (A2) La gráfica muestra la cuantificación de los datos de transferencia Western. MCF7 (B1), MDA-MB-468 (B2) y MCF7 p53KD (B3) Las células se expusieron a diversas concentraciones de JKA97 o vehículo durante 24 horas, y el ARN total se extrajeron seguido por la transcripción inversa, y el nivel de mRNA de detección de p21 por -PCR en tiempo real cuantificación y cuantificación RT-PCR, normalizado por el nivel de ARNm de GAPDH. (C) Las células fueron transfectadas con el promotor p21 de la luciferasa del plásmido reportero y un indicador de luciferasa de Renilla juntos durante 12 horas, seguido de tratamiento de 10 mM JKA97 o vehículo durante 24 horas adicionales. El reportero de la actividad se normalizó con el reportero de la luciferasa de Renilla correspondiente. El ensayo de luciferasa se realizó por triplicado. La significación estadística se determinó en comparación con el control (* P & lt; 0,05).

JKA97 induce la transcripción p21

Para determinar si la regulación al alza de p21 por JKA97 resultantes del aumento de mRNA en el nivel transcripcional, todo tres líneas celulares se trataron con varias concentraciones de JKA97 durante 24 hrs, y los niveles de expresión de ARNm de p21 se determinaron mediante PCR en tiempo real. Adicional semi-cuantificación RT-PCR se empleó para la consistencia. Como se ilustra en la Fig. 4B, la expresión de ARNm de p21 se incrementó en JKA97 de una manera dependiente de la dosis.

Para demostrar aún más cómo JKA97 afecta a la transcripción p21, una de longitud completa reportero promotor p21 humano se transfectó en las tres líneas celulares, y estas células se expusieron a JKA97 (10 M). Como se muestra en la Fig. 4C, las actividades de luciferasa del reportero de p21 fueron significativas aumentó en 7,1 veces, 13,4 veces y 6,6 veces en MCF7, MDA-MB-468, y MCF7 p53KD células, respectivamente.

Discusión

estudios previos indican que JKA97 indujo apoptosis de las células de cáncer de hígado de colon y por una vía independiente de p53 y Bax dependiente de [10]. Sin embargo, otros mecanismos posibles y el potencial del compuesto para tratar otros tipos de cáncer aún no se han aclarado completamente. A lo mejor de nuestro conocimiento, el presente estudio es el primero en investigar tanto
in vitro
y
in vivo
efectos antitumorales de la novela analógico harmina bencilideno en células de cáncer de mama humano. El estudio pone de relieve varios puntos importantes: 1) JKA97 inhibe significativamente el crecimiento de células de cáncer de mama; 2) JKA97 induce apoptosis de las células; 3) la inhibición de la proliferación celular y la progresión del ciclo celular parece ser importante mecanismo por el cual JKA97 ejerce sus efectos contra el cáncer; 4) JKA97 hasta regula la expresión de p21 en el nivel transcripcional, más que a nivel post-transcripcional, independiente de p53; y 5) JKA97 disminuye el crecimiento de tumores de xenoinjerto de cáncer de mama humano en ratones, de una manera dependiente de la dosis.

Nuestros resultados indicaron que no había diferencias notables en la supervivencia de las células después del tratamiento JKA97, según lo determinado por el MTT ensayo, con MDA-MB-468 células siendo el más sensible (Fig. 1B). ensayo de MTT representa la supervivencia total de células, que puede ser afectado por diversos factores, por lo menos incluyendo la proliferación celular, la apoptosis y la progresión del ciclo celular. Por lo tanto, se determinó adicionalmente los efectos de JKA97 sobre la proliferación celular, apoptosis, y la distribución del ciclo celular. Se utilizó la incorporación de BrdU ensayo para determinar el índice de proliferación celular. Aunque hubo efectos dependientes de la dosis sobre la proliferación celular en cada una de las líneas celulares sometidas a prueba utilizados en este estudio, no hubo diferencias notables entre MCF7 (p53 WT) y MDA-MB-468 (p53 mutante) las células, lo que indica que los JKA97 efectos sobre la proliferación celular son independiente de p53. Curiosamente, p53 KD células MCF-7 fueron más sensibles que otras dos líneas celulares (Fig. 1C). Sin embargo, se demostró que MDA-MB-468 células a ser más sensibles a la apoptosis (Fig. 1D) y el ensayo de distribución del ciclo celular (Fig. 1E). Por ejemplo, a la dosis más alta utilizada (20 mM), MCF7 y KD células MCF7 p53 aumento de la apoptosis de manera similar, pero MDA-MB-468 células fueron más sensibles. En conjunto, nuestros resultados indican que la inducción de apoptosis y detención del ciclo celular tienen más probabilidades de estar relacionada con las diferencias en el ensayo de supervivencia de células entre las tres líneas celulares. Los mecanismos detallados necesitan ser explorados en los estudios futuros.

En el presente estudio, hemos demostrado que también tenía JKA97

actividad significativa en antitumoral in vivo en dos modelos de xenoinjertos de cáncer de mama. En el nivel de dosis /kg 5 mg, hemos observado las respuestas similares a la terapia entre los dos modelos. Ya que utilizamos diferentes dosis más altas en MCF7 y MDA-MB-468 modelos, es difícil comparar las curvas de respuesta. La dosis utilizada en MDA-MB-468 modelo (10 mg /kg) fue menos de la mitad de la dosis en el modelo MCF7 (25 mg /kg), pero genera tasas de inhibición de crecimiento tumoral similares. Especulamos que MDA-MB-468 células son más sensibles. Teniendo en cuenta que hay otros factores que afectan a la
in vivo
respuesta al tratamiento JKA97, no podemos llegar a una conclusión firme en cuanto a la diferencia entre los dos modelos. Se necesitan más estudios para demostrar estas diferencias y los mecanismos subyacentes.

La obstrucción de la progresión del ciclo celular en las células cancerosas se considera como una de las estrategias más eficaces para el control del crecimiento del tumor [11]. El cambio de un estado latente fase quiescente (G0) a un estado en crecimiento activo es un requisito previo para la entrada en el ciclo celular en la mayoría de las células y un paso crucial para las células cancerosas. la progresión del ciclo celular es modulada por los reguladores conocidos como inhibidores de la quinasa dependiente de ciclina (CDK). La primera de estas proteínas para ser identificado y clonado es p21 [12] - [14]. La proteína p21, un inhibidor del ciclo celular universales, se une a los complejos ciclina-CDK y pcna, induciendo con ello la detención celular en G1 y bloqueando la entrada de células en la fase S. Teniendo esto en cuenta, se verificaron las relaciones entre la detención del ciclo celular G1 y proteínas reguladoras relacionadas incluyendo p53, p21, p27 y, después del tratamiento de drogas. Nuestros resultados revelaron que la detención de G1 mediada por JKA97 en células de cáncer de mama se vinculó con p21, independientemente del estado de p53 (de tipo salvaje, mutante, o desmontables). La sobre regulación de las proteínas p21 y p27 aumenta la formación de complejos con el G1-S CDK y ciclinas, inhibiendo de este modo sus actividades [15] - [17]. Esto se cree que es el primer informe para demostrar el mecanismo de la detención del ciclo celular G1 independiente de p53 inducida por JKA97 en células de cáncer de mama. Nuestro estudio demostró además que la sobre regulación de p21 inducida por JKA97 dependía principalmente de un mecanismo transcripcional en lugar de una alteración posterior a la traducción. Los estudios futuros deben examinar los mecanismos subyacentes relativos a la forma en JKA97 hasta regula la transcripción p21 e influye en las vías descendentes.

Muchos investigadores han sugerido que la detención del ciclo celular y la apoptosis pueden estar ligados. Moléculas que actúan sobre las células en fase G1 se cree normalmente para afectar la apoptosis; inhibidores de CDK se han sugerido para ser indirectamente implicados en la apoptosis mediante la regulación de las CDK. p21, un importante inhibidor de CDK, es inducida por ambos mecanismos dependientes de p53 y -independiente tras el estrés [18]. Además, se ha informado que la sobreexpresión de p21 resultados en una inducción de Bax y promueve la apoptosis [19]. Teniendo en cuenta que
Luo et al.
[10] han demostrado que JKA97 puede inducir la apoptosis en células de cáncer de colon de una manera dependiente de Bax, pero independiente de p53, es necesario seguir trabajando para correlacionar la relación entre la detención del ciclo celular y vías de la apoptosis regulados por el compuesto.

las observaciones de este estudio proporcionan evidencia racional para el uso de JKA97 como un agente anti-tumor de la terapia del cáncer de mama humano. Nuestros resultados, tomados en conjunto con los resultados anteriores para este compuesto, indican que la actividad anticancerígena de JKA97 está indisolublemente unida a la modulación de p21. Se necesitarían más estudios con p21 sistemas deficientes para evaluar plenamente el alcance de la participación de esta importante proteína. En el presente estudio, junto con los resultados reportados anteriores [10], sin duda va a mejorar nuestra comprensión de los mecanismos de acción de JKA97, proporcionando una base para su posterior evaluación preclínica y clínica del compuesto como un nuevo agente anti-cáncer.

Materiales y Métodos

compuesto de ensayo, productos químicos y reactivos

El JKA97 compuesto de ensayo, indol, se sintetizó metoxi-1-estiril-9H-pirido [3,4-b] y se purificó como se informó anteriormente [10], y la estructura se confirmó por UV, IR, MS y espectroscopía de RMN [10]. La pureza del compuesto de ensayo se determinó que era mayor que 95% por HPLC y MS análisis. Todos los productos químicos y disolventes utilizados fueron de grado analítico o el grado más alto disponible. suministros de cultivo celular, tales como medios de cultivo, solución salina tamponada con fosfato (PBS), suero bovino fetal (FBS), piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales, y penicilina-estreptomicina se obtuvieron de Invitrogen (Carlsbad, CA). Los anticuerpos contra p21 humano (C-19), p27 (C-19), ciclina D1 (DCS-6), ciclina E (HE12) y E2F1 (KH95) eran de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA) . El anticuerpo p53 anti-humano (Ab-6) fue de EMD Chemicals, Inc. (Gibbstown, NJ). El anticuerpo β-actina anti-humano (T5168) fue de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Líneas celulares y Cultura y
MCF7 cáncer de mama humano y MDA-MB-468 se obtuvieron células de la American Type Culture Collection (Rockville, MD). -468 MDA-MB células MCF7 y se cultivaron en medio MEM que contiene 1 mM de aminoácidos no esenciales y BSS de Earle, piruvato sódico 1 mM y 10 mg /insulina bovina L, y los medios de DMEM /F-12 Ham (DMEM /F- 12 01:01 mezcla). células MCF7 p53KD se generaron usando el método descrito anteriormente [20], [21] y se cultivaron en el mismo medio que las células MCF7, pero suplementado con 0,5 mg /ml de puromicina (Sigma; St. Louis, MO). Todos los medios de cultivo celular contenía FBS al 10% y 1% de penicilina /estreptomicina, a menos que se especifique lo contrario.

Ensayo de Supervivencia Celular

Los efectos de JKA97 sobre el crecimiento celular del cáncer de mama humano se determinaron utilizando el MTT ensayo y expresada como el porcentaje de supervivencia de las células de control [22] - [25]. Las células se cultivaron en placas de 96 pocillos, sembrando a una densidad de 4-5 x 10
3 células por pocillo, y se expusieron a diversas concentraciones del compuesto de ensayo (0 a 50 IM) durante 72 hrs. 10 l de la 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil solución de tetrazolio bromuro (MTT) (5 mg /ml; Sigma; St. Louis, MO) se añadieron a continuación. La absorbancia a 570 nm se registró usando un lector de microplacas SYNERGY Mx (BioTek, Winooski, VT). Las tasas de supervivencia celular (%) se calcularon dividiendo la OD media de los pocillos que contienen compuestos por el de los pocillos de control.

Ensayo de proliferación celular

Los efectos de JKA97 sobre la proliferación celular se determinó por el ensayo de incorporación de BrdU (Oncogene, la Jolla, CA), siguiendo el protocolo del fabricante. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (8 × 10
3 a 1,2 × 10
4 células por pocillo) y se incubaron con diversas concentraciones de JKA97 (0, 5, 10 y 20 IM) durante 48 hrs. BrdU se añadió al medio de 10 horas antes de la finalización del experimento. El BrdUrd incorporado en las células se determinó por el anticuerpo anti-BrdU, y la absorbancia se midió en dos longitudes de onda de 450/540 nm con un lector de microplacas SYNERGY Mx (BioTek, Winooski, VT).

Detección de Apoptosis

Las células en etapas tempranas y tardías de la apoptosis se detectaron utilizando un kit de detección de apoptosis Anexina V-FITC de Biovision (Mountain View, CA). En breve, 4-5 × 10
5 células por pocillo fueron expuestos al compuesto de ensayo (0, 5, 10 y 20 mM) y se incubaron durante 24 horas antes del análisis. se recogieron y se lavaron con medio libre de suero Las células, a continuación, se resuspendieron en 500 l de tampón de unión de Anexina V, seguido de la adición de 5 l de anexina V-FITC y 5 l de yoduro de propidio (PI). Las muestras se incubaron en la oscuridad durante 5 minutos a temperatura ambiente y se analizaron con un citómetro de flujo FACSCaliber (BD Biosciences, San Jose, CA).

Las mediciones del Ciclo Celular

Para determinar los efectos de JKA97 en la distribución del ciclo celular, 4-5 × 10
5 células por pocillo fueron expuestos al compuesto (0, 5, 10, y 20 IM) y se incubaron durante 24 horas antes del análisis. Las células se recogieron y se fijaron en etanol al 75% a 4 ° C durante la noche, seguido de incubación con ARNasa y tinción con yoduro de propidio (Sigma). El contenido de ADN se determinó mediante citometría de flujo como se ha indicado anteriormente.

Ratón modelo de xenoinjerto de cáncer de mama humano

El protocolo de uso de los animales y la atención fue aprobado por el Comité de Uso y Cuidado de Animales institucional de la de Texas Tech University Health Sciences Center (IACUC#10032,#A PHS Aseguramiento 3056-01, USDA registro#74-I-0050, Ref#039461). ratones desnudos libres de patógenos atímicos hembra (nu /nu, 4-6 semanas) fueron adquiridos de Río Charies Laboratories International, Inc. (Wilmington, MA). Establecer MCF7 modelo de tumor de xenoinjerto de cáncer de mama humano, cada uno de los ratones desnudos hembra se implantó por primera vez con una inyección subcutánea de pellets de 60 días de lenta liberación de estrógeno (SE-121, 1,7 mg 17β-estradiol /pastilla) obtenido a partir de Innovative Research of America (Sarasota , FL). Al día siguiente, las células MCF-7 células cosechadas a partir de cultivos en monocapa se lavaron dos veces con medio libre de suero, se volvieron a suspender en el medio, y luego inyectados s.c. (5 × 10
6 células, el volumen total 0,2 ml) a la zona inguinal izquierda de los ratones. Para el modelo de xenoinjerto de MDA-MB-468, se utilizó el mismo procedimiento que el anterior, pero sin el pellet estrógeno. Todos los animales fueron controlados para la actividad, la condición física, el peso corporal, y el crecimiento tumoral. El tamaño del tumor se determinó cada dos días por medición del calibre de dos diámetros perpendiculares del implante. masa tumoral (en g) se calculó mediante la fórmula, 1/2

×
b

2, donde "
a
" es el diámetro de largo y "
b
"es el corto diámetro (en cm).


en vivo
quimioterapia con JKA97

los animales portadores de tumores de xenoinjertos de cáncer humano se dividieron al azar en varios grupos de tratamiento y un grupo control (7-10 ratones /grupo). Los grupos de control para ambos modelos recibieron sólo el vehículo. Para el modelo de xenoinjerto de MCF7, JKA97 se disolvió en el vehículo, PEG400: etanol: solución salina (/v 57.1:14.3:28.6, v /v), y se administró mediante inyección i.p. inyección a dosis de 5 y 25 mg /kg /d, 5 días /semana durante 3 semanas. Para el modelo de xenoinjerto de MDA-MB-468, JKA97 se administró mediante inyección i.p. inyección a dosis de 5 y 10 mg /kg /d, 5 días /semana durante 6 semanas. Al final de los experimentos, se extrajeron los tumores de xenoinjertos, se pesaron, y se fotografiaron para los registros.

análisis de transferencia Western

Los niveles de proteína en los lisados ​​de células se evaluaron utilizando la transferencia Western como se describe anteriormente [20 ], [21]. En resumen, las células se expusieron a diversas concentraciones de JKA97 de 24 horas y los lisados ​​celulares se fraccionaron con cantidades idénticas de proteína por SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron a membranas de Bio-Rad trans-blot de nitrocelulosa (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) que se incubaron a continuación en tampón de bloqueo (solución salina tamponada con Tris que contenía 0,1% de Tween 20 y 5% de leche sin grasa) durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las membranas se incubaron con los anticuerpos apropiados primarios durante la noche a 4 ° C o 2 horas a temperatura ambiente, con agitación suave. Las membranas se lavaron tres veces con tampón de enjuagado (solución salina que contiene 20 Tween 0,1% tamponada con Tris) durante 15 min y después se incubó con el anticuerpo anti-ratón /anticuerpo de cabra -rabbit IgG-peroxidasa de rábano conjugada (Bio-Rad) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces, las proteínas de interés se detectaron mediante el uso de reactivos de quimioluminiscencia potenciada de PerkinElmer LAS, Inc. (Boston, MA).

La extracción de RNA y en tiempo real semi-cuantitativa y RT-PCR cuantitativa

el ARN total se extrajo usando el reactivo Trizol de Invitrogen (Carlsbad, CA). La primera cadena de ADNc se sintetizó con 1 g de extracto de ARN total usando el kit de síntesis de cDNA iScript (Bio-Rad, Hercules, CA). Las secuencias de los cebadores utilizados para la amplificación de genes fueron los siguientes: p21 adelante, 5'-AGC AGC GGA ACA AGG AGT-3 ', inversa, 5'-TGG AGA AAC AAC GGG CAG-3'; GAPDH adelante, 5'-GGA GTC CAC TGG CTT CGT CAC-3 ', inversa, 5'-GAG GCA TTG CTG ATG TTG ATC AGG-3'. Semi-RT-PCR cuantitativa se llevó a cabo con la mezcla del producto de ADNc, cebadores, dNTP y Taq ADN polimerasa (Invitrogen) usando ciclos de 95 ° C durante 30 s, 57 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 30 s, seguido de una extensión final a 72 ° C durante 5 min. PCR en tiempo real se llevó a cabo durante 40 ciclos que constaban de 95 ° C durante 20 s, 57ºC durante 20 s y 72ºC durante 20 s usando una máquina iQ5 (Bio-Rad, EE.UU.). Todas las muestras se analizaron por el ciclo umbral comparativo método (C
T) y se normalizaron con el control GAPDH ARNm.

Luciferase Assay

Las células se cotransfectaron con p21 humano vectores de promotor de longitud completa con
Renilla
indicador de luciferasa (como control interno; Promega, Madison, WI) durante 24 horas, seguido de incubación con JKA97 durante 24 hrs. La actividad de la luciferasa del reportero promotor p21 se determinó con el Dual-Luciferase reportero sistema de ensayo (Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante. El reportero de la actividad de p21 se normalizó a la correspondiente
Renilla
la actividad de luciferasa.

Análisis estadístico

Los datos de los diferentes grupos de tratamiento se presentan como medias ± error estándar. ANOVA de una vía seguido por la prueba post hoc S-N-K se utilizó para determinar la significación de las diferencias entre los grupos de tratamiento y controles. Los resultados se consideraron estadísticamente significativas cuando P. & Lt; 0,05

Reconocimientos

Agradecemos a los Dres. X. Zhang, H. Xu, X. Zhang, L. Ao, E. Rayburn, y D. Chen por su excelente asistencia técnica y la discusión útil, y el Sr. S. Voruganti y Sra. S. Nag por leer el manuscrito.