Extracto
Antecedentes
KIAA0101 es un factor asociada al antígeno nuclear de células en proliferación que se sobreexpresa en algunos tumores malignos humanos. neoplasias de la corteza suprarrenal es una de las neoplasias humanas más comunes para los cuales las causas moleculares son poco conocidos. Además, es difícil distinguir entre tumores benignos y malignos adrenocorticales localizadas. Por estas razones, se estudió la expresión, la función y el posible mecanismo de desregulación de KIAA0101 en neoplasias de la corteza suprarrenal humana.
Metodología /Principales conclusiones
ARNm KIAA0101 y niveles de expresión de proteínas se determinaron en 112 tejidos de la corteza suprarrenal se utilizaron muestras (21 corteza normales adrenal, 80 tumores suprarrenales benignos, y 11 de carcinoma adrenocortical (ACC). siRNA desmontables para determinar el papel funcional de KIAA0101 sobre la proliferación celular, el ciclo celular, la apoptosis, el crecimiento independiente del anclaje en agar blando y la invasión en el ACC . línea celular, NCI-H295R Además, hemos explorado el mecanismo de KIAA0101 desregulación examinando el estado mutacional KIAA0101 mRNA (9,7 veces) y expresión de la proteína fueron significativamente mayores en ACC (p & lt; 0,0001).. KIAA0101 tenía expresión de la proteína escasa en solamente algunas muestras normales de la corteza suprarrenal, que se limitaba a las células progenitoras de la corteza suprarrenal. KIAA0101 niveles de expresión fueron del 84% exacto para distinguir entre el CAC y muestras de tumores adrenocorticales normales y benignos. Desmontables de la expresión del gen KIAA0101 disminuyó significativamente el crecimiento independiente del anclaje en un 80% y la invasión por 60% (p = 0,001; p = 0,006). No se encontraron mutaciones en KIAA0101 en el CAC.
Conclusiones /Importancia
KIAA0101 se sobreexpresa en el CAC. Nuestros datos apoyan que KIAA0101 es un marcador de proliferación celular, promueve el crecimiento y la invasión, y es un buen marcador de diagnóstico para distinguir benigna de neoplasia maligna de la corteza suprarrenal
Visto:. Jain M, Zhang L, Patterson EE, E Kebebew (2011) KIAA0101 se sobreexpresa, y promueve el crecimiento y la invasión de cáncer adrenal. PLoS ONE 6 (11): e26866. doi: 10.1371 /journal.pone.0026866
Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Estados Unidos de América
Recibido: 10 Junio, 2011; Aceptado: 5 Octubre 2011; Publicado: 11 de noviembre 2011
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramural, Centro para la Investigación del Cáncer, Instituto Nacional del Cáncer, de los Institutos Nacionales de Salud. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
neoplasias suprarrenales son una de las neoplasias humanas más comunes, a menudo se detecta incidentalmente [1]. La mayoría de los tumores suprarrenales son benignos pero a menudo es difícil excluir un tumor maligno como el carcinoma de la corteza suprarrenal. carcinoma de la corteza suprarrenal (ACC) es una neoplasia maligna rara de la corteza adrenal con un mecanismo mal entendido de desarrollo, y un resultado deprimente paciente debido a la falta de tratamiento eficaz [2]. La incidencia anual del CAC es de aproximadamente 1-2 casos por millón [3], [4], [5]. La resección quirúrgica completa es la única terapia curativa posible, pero más de dos tercios de los pacientes se presentan con enfermedad metastásica e incluso aquellos pacientes que tienen resección completa desarrollan enfermedad recurrente en más del 50% de los casos [2], [6]. Los pacientes con enfermedad metastásica tienen una tasa de supervivencia a los cinco años de menos de 10% y los que tienen la enfermedad recurrente tienen una supervivencia a los cinco años de sólo el 50% [2], [6].
ACC puede estar asociada con síndromes hereditarios de cáncer, como el síndrome de Beckwith-Wiedemann (asociados a la línea germinal 11p15 alteraciones cromosómicas que conducen a
IGF2
sobreexpresión, OMIM#130650), el síndrome de Li-Fraumeni (
TP53
mutación, OMIM#151623) , neoplasia endocrina múltiple tipo 1 (mutaciones en el gen supresor de tumores menina, OMIM#131100), y el síndrome de Gardner (
APC
mutación, OMIM#175100). Los cambios genéticos asociados con síndromes de cáncer hereditario han proporcionado información importante acerca de los posibles mecanismos moleculares implicados en el CAC. Sin embargo, la mayoría de los casos de ACC son esporádicos, y los eventos moleculares que conducen a la iniciación y progresión de tumores suprarrenales siguen sin estar claros
.
de todo el genoma de perfiles de expresión génica proporciona información importante sobre las vías moleculares que se dysregulated en el cáncer y pueden estar implicados en la iniciación y progresión del tumor. Dado que el mecanismo molecular de la carcinogénesis adrenocortical es poco conocido, el análisis de microarrays de ADNc de tumores adrenocorticales se ha utilizado para revelar los genes cuya expresión errónea está asociada con ACC [7], [8], [9], [10], [11]. Entre los genes que se han encontrado para ser aumentada en ACC, KIAA0101 (también conocido como L5; PAF; OEATC1; NS5ATP9; OEATC-1; p15) es un marcador novedoso potencial de diagnóstico y pronóstico, y el objetivo para la terapia del CAC. KIAA0101 codifica un factor de -asociado antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) con una función desconocida. KIAA0101 se sobreexpresa en tumores malignos humanos como hepatocelular y carcinoma de páncreas [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21 ], [22]. Sin embargo, el papel de KIAA0101 en el cáncer y el mecanismo que conduce a la expresión desregulada de KIAA0101 no está claro.
En este estudio, hemos abordado estos temas y demostramos que KIAA0101 se sobreexpresa en el CAC y un marcador de proliferación celular. Por otra parte, la reducción de la expresión de KIAA0101 en el CAC dio lugar a la supresión del crecimiento y la invasión lo que sugiere que KIAA0101 juega un papel oncogénico en el CAC.
Métodos
Las muestras de tejido
La junta de revisión de Instituto Nacional del Cáncer aprobado este protocolo de investigación tras el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los participantes. tejidos suprarrenales se congelaron rápidamente en el momento de la cirugía y se almacenaron a -80 ° C. En este estudio, se analizaron 112 muestras de tejido de la corteza suprarrenal humanos incluyendo 21 tejidos normales adrenocorticales, 80 tumores suprarrenales benignos, y 11 carcinomas de la corteza suprarrenal primaria (78 de los tumores suprarrenales benignos y 11 de los carcinomas de la corteza suprarrenal primaria fueron analizados previamente) [11]. Un conjunto independiente de metástasis ACC (n = 29) y recurrencias (n = 2) también se utilizó para la validación. El diagnóstico de la ACC inequívoca y el tumor benigno de la corteza suprarrenal se confirmó en todos los casos por el examen histológico y el seguimiento clínico. El tiempo medio de seguimiento fue de 26,3 meses para los pacientes con tumores suprarrenales benignos y 44,4 meses para los pacientes con ACC.
Cultivo de células
La línea celular NCI-H295R ACC (ATCC, Rockville, MD ) se hizo crecer y se mantuvieron en DMEM suplementado con 1% ITS + Premix (BD Biosciences, San Jose, CA), 2,5% Nu-Serum I (BD Biosciences), y 10.000 U /ml de penicilina /estreptomicina en una incubadora humidificada estándar a 37 ° C en un 5% de CO
2 atmósfera. Veinticuatro horas después las células fueron sembradas en 24 y placas de 6 pocillos (4 × 10
^ 4 células en 0,5 ml y 1,6 × 10
^ 5 células en 2 ml), las células fueron transfectadas con un control negativo no específica siRNA y con un siRNA específico KIAA0101 a una concentración final de 40 y 80 nM (AM4636 y AM46235, respectivamente, Applied Biosystems, Foster City, CA). El reactivo de TransIT siQuest (Mirus Bio, LLC) se utilizó para entregar siRNA a las células de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La eficiencia caída fue similar para 40 y 80 nM. Todos los ensayos in vitro se realizaron con ambos 40 y 80 de concentración nM de siRNAs específicos KIAA0101 y el control negativo no específica.
ARN y preparación proteína
RNA se aisló usando el reactivo TRIzol siguiendo las instrucciones del fabricante ( Invitrogen Inc., Carlsbad, CA). la cantidad y la calidad del ARN se evaluó mediante el uso de NanoDrop (NanoDrop Technologies, Inc., Thermo Fischer) y Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), respectivamente.
tampón RIPA se utilizó para preparar lisados de tejido y lisado de células enteras se preparó con 1% SDS, más Tris mM [pH 7,5] 10 tampón. La concentración de proteína se determinó utilizando el ensayo de proteína BioRad RC DC (Hercules, CA).
reacción cuantitativa con transcripción inversa en cadena de polimerasa en tiempo real (RT-PCR)
El ARN total (125 ng) fue transcrito invertir utilizando el cDNA de la escritura kit de síntesis de RT (USB Corporation, Cleveland, OH). PCR en tiempo real cuantitativa se utilizó para medir los niveles de expresión de ARNm en relación con la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) la expresión de ARNm. Normalizado nivel de expresión génica = 2
- (Ct
del gen de interés - Ct
de GAPDH) x 100%, donde C
t es el umbral de ciclo de PCR. Los cebadores de PCR y sondas para KIAA0101 (Hs00207134_m1) y GAPDH (Hs99999905_m1) se obtuvieron a partir de Applied Biosystems (kit® Ensayo-on-Demand, Foster City, CA). Todas las reacciones de PCR se realizaron en un volumen final de 20 l con 1 l de molde de ADNc en un sistema ABI PRISM®7900 de detección de secuencias (Applied Biosystems). La condición termociclador PCR fue de 95 ° C durante 12 minutos seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 1 minuto. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron tres veces.
análisis de transferencia de Western
Las muestras de proteína (40 mg) se separaron en 4% a 20% de gel de SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Western Blot se realizó siguiendo los procedimientos estándar utilizando anticuerpos monoclonales de ratón primario, anti-KIAA0101 (Abcam; ab56773) a dilución 1:100 y anti-β-actina (sc-81178, Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, CA) a 1: 2000 dilución. detección de la señal se realizó usando un anticuerpo secundario conjugado con HRP y un kit de quimioluminiscencia (Amersham Pharmacia Biotech).
inmunohistoquímica (IHC) y la tinción Immuunofluoroscence
Los tejidos tumorales se fijaron en formalina, embebido en parafina, y 5 micras de espesor secciones fueron cortadas por inmunotinción. Las secciones se incubaron con el anticuerpo monoclonal de ratón anti-KIAA0101 primario a una dilución 1:300 durante la noche a 4 ° C (Abcam; ab56773) seguido de anticuerpo secundario biotinilado durante 1 hora a temperatura ambiente (1:150; Vector Laboratories, Burlingame, CA, ESTADOS UNIDOS). Las secciones fueron desarrollados usando 3,3 'diaminobencidina-DAB como cromógeno (ABC kit de élite, Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.) y hematoxilina como colorante de contraste. Las secciones fueron rehidratadas y se montaron con el montaje vectamount medio (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.). Las diapositivas fueron escaneados bajo el microscopio Olympus luz (Nikon, Tokio, Japón) y se tomaron fotografías a 20X y 40X aumentos. Un sistema de puntuación semicuantitativo se utilizó para analizar la expresión de KIAA0101; nivel de expresión se clasifica como ninguna tinción (0), & lt; 30% de las células de tinción (1), 30-50% de células (2) y & gt; 50% de las células. Dos observadores, que fueron cegados al tipo de tumor, se calificó de manera independiente cada muestra. Las puntuaciones se promediaron para obtener el resultado final expresión KIAA0101
tinción Immuunofluoroscence se realizó utilizando anticuerpo monoclonal primario anti-KIAA0101mouse en 1:300 durante la noche dilución. (Abcam; ab 56773) y de conejo anti-SF-1 (Millipore ; 07 hasta 618, 2 mg /ml) a 4 ° C. Los anticuerpos primarios se detectaron con fluoróforo conjugado con RedTX anti-IgG de conejo (Invitrogen, Carlsbad, CA) y anticuerpos secundarios IgG anti-ratón FITC (Vector Laboratories). Los portaobjetos se aclararon y se montaron con DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) de montaje solución. Las imágenes se analizaron con un microscopio Zeiss Axioskop-2 a 20x y 40x aumentos.
Purificación de ADN
ADN genómico se aisló de 1 mg de muestras tumorales y normales utilizando el QIAamp DNA Blood Mini Kit ( Qiagen, Hilden, Alemania), se eluyó en un volumen total de 200 l y se almacena a -20 ° C. Las concentraciones de ADN se midió por absorbancia UV usando NanoDrop (NanoDrop Technologies, Inc., Thermo Fisher).
región codificante Secuenciación KIAA0101
El exones KIAA0101 1, 2, 3 y 4 fueron secuenciados. PCR primers fueron diseñados para la codificación de región utilizando la UCSC genoma navegador, Primer 3 de software integrado. Las secuencias de cebadores se enumeran en la Tabla 1. Los cebadores fueron hechos por IDT, Inc. (Coralville, IA). Los exones 1, 2, 3 y 4 fueron amplificados como tres reacciones separadas en 50 l utilizando PCR master mix (Fermentas Inc. EE.UU.). Las condiciones estándar de PCR fueron desnaturalización inicial a 95 ° C durante 5 min seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 5 min, hibridación a 50 ° C durante 1 min, extensión a 72 ° C durante 1 min y extensión final a 72 ° C durante 10 min. Los productos de PCR se visualizaron en gel de agarosa al 2%. Los productos se purificaron usando I Exo-nucleasa estándar y Fastap (Fermentas Inc.). Los productos de PCR purificados se secuenciaron utilizando ABI 3730xl secuenciador con el método colorante grande (kit de secuenciación de ADN, secuenciación de ciclo terminador con colorante grande; Applied Biosystems). Las mutaciones fueron analizadas por el Programa Mutación Surveyor V 3.3 (Genética suave; www.softgenetics.com). Todos los datos de secuenciación ha sido depositado en el GenBank.
La proliferación celular
Las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos a una concentración de 5 × 10
^ 3 células por 100 l de medio de cultivo en seis repeticiones. En cada punto de tiempo, se aspiró el medio del pozo y las células se congeló inmediatamente a -80 ° C durante 24 horas. Las placas se descongelaron a temperatura ambiente, y se prepararon para la cuantificación del número de células usando el kit de ensayo CyQUANT ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA). El ensayo CyQuant se realizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante, y se analizó en un lector de microplacas fluorométrico (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) a 480 nm /520 nm.
citometría de flujo y apoptosis
analiza
se recogieron las células tratadas KIAA0101 y control negativo siRNA, fijados con etanol durante la noche a 4 ° C, y se resuspendieron en 1 x PBS hasta una concentración de 1 × 10
^ 6 células /ml. Las células se trataron con RNasa libre de DNasa (100 g /ml) durante 20 min a 37 ° C. Las células se tiñeron con yoduro de propidio a una concentración de 50 mg /ml y las muestras se almacenaron a 4 ° C. Análisis de citometría de flujo se realizó en un Becton Dickinson FACScan (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Los archivos de datos se generaron para 20.000 eventos (células) usando el software CellQuest. La fracción de la población total de células presentes en cada uno de los G1, S y fases del ciclo celular G2 /M se obtuvo de software ModFit LT (Verity Software House, Inc.). análisis de la apoptosis se realizó mediante tinción con anexina V (Kit ApoAlert® Anexina V apoptosis) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Clontech, Mountain View, CA).
Soft agar anclaje crecimiento independiente de ensayo
dos ensayos de agar blando en capas se realizaron en placas de seis pocillos. La capa inferior de agar (2 ml /pocillo) contenía 0,5% de agar (Difco Noble Agar, Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD) en medio de mantenimiento. Cinco días después de siRNA transfección, se tripsinizaron las células, se contaron, y 50.000 células se mezclaron con 1,3 ml de solución de agar superior suplementado con 10% de suero Nu-(agar 0,3% en medios de cultivo). agar solidificado se cubrió con 1 ml de medios de cultivo que contienen 10% Nu-suero. Las placas se cultivaron a 37 ° C en 5% de CO
2, y los medios de comunicación se cambió dos veces por semana. Después de 16 días de cultivo, las colonias de células se tiñeron con solución de cristal violeta 0,2% y se examinaron por microscopía. Las colonias se contaron en 5 campos diferentes por pocillo y se confirmaron mediante el software v11 TotalLab Quant (http://www.totallab.com/).
invasión de la célula de ensayo
La extensión de la invasión celular era evaluó a través de la BioCoat Matrigel ™ Cámara BD ™ Invasion (BD Biosciences, Bedford, MA), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Un total de 1 × 10
^ Se sembraron 5 células sobre los insertos (8-M de poro de membrana de policarbonato de tamaño) recubiertas con una fina capa de Matrigel membrana basal Matrix (BD Biosciences). Los insertos se colocaron en una placa de 24 pocillos con 10% medio de cultivo que contiene suero o medio sin suero. Las placas se incubaron durante 48 horas a 37 ° C. Las células que invadieron la matriz de Matrigel a la superficie inferior de la membrana fueron fijadas y teñidas con Diff Quik (Dade Behring, Newark, DE, EE.UU.) y se contaron con un microscopio óptico. Cuatro campos en cuatro cuadrantes separados de cada membrana se contaron y promediaron.
Análisis estadísticos
Los datos continuos se representan como media ± desviación estándar (S. D.). Dos colas múltiples ANOVA de comparación
t-test
se utilizó para evaluar la diferencia entre la media de expresión entre las muestras normales, benignas y malignas. prueba de correlación de Pearson se utilizaron para los datos continuos. Un
p-valor
& lt; 0,05 fue considerado como significativo. El análisis hecho por Stat View 5.0 (Cary, NC) y SPSS v 16.0 (Chicago, IL) softwares estadísticos.
Resultados
KIAA0101 ARNm y proteínas son altamente expresado en neoplasias de la corteza suprarrenal
La expresión de KIAA0101 mRNA fue significativamente mayor en ACC, en comparación con el tejido de la corteza suprarrenal normal y tumores suprarrenales benignos (12 veces mayor de lo normal y 9 veces más alta que en los tumores benignos, p & lt; 0,0001) (Figura 1A). Además, el nivel de expresión KIAA0101 mRNA fue menor en los tumores metastásicos y recurrentes en comparación con ACC primario (p & lt; 0,001)
A) expresión KIAA0101 mRNA en la corteza adrenal normal (n = 21), tumores suprarrenales benignos (N = 80), ACC (N = 10), y el CAC metastásico recurrente (n = 30) y la línea celular NCI-H295R. nivel de expresión KIAA0101 mRNA se determinó por RT-PCR cuantitativa y normalizado a la expresión de GAPDH ARNm. Las columnas representan la media ± desviación estándar de las determinaciones repetidas. diferencia significativa estadística se indica con un asterisco (*) (p & lt; 0,05, Kruskal Wallis test). ACC primaria versus normal (p & lt; 0,0001), ACC vs tumores suprarrenales benignos primarios (p & lt; 0,0001) y ACC primaria frente metástasis (p & lt; 0,0001). B) Análisis de la curva ROC para la expresión KIAA0101 mRNA. La curva característica de operación del receptor (ROC) se representa en el gráfico mediante RT PCR datos de expresión de KIAA0101 normalizado a GAPDH en la corteza adrenal normal (n = 21), tumores suprarrenales benignos (n = 80), ACC (n = 10). El área bajo la curva (AUC) fue de 0,78. Un marcador de diagnóstico perfecta sin ningún tipo de falsos negativos o falsos positivos tendría una AUC de 1. C) expresión de la proteína KIAA0101 en el CAC. los niveles de expresión de proteína KIAA0101 en la corteza adrenal normal (n = 5), benignos (n = 13), y malignos tumores adrenocorticales (n = 3) como se muestra en transferencia de Western representativa con anticuerpos específicos de control y ß-actina KIAA0101. señal de ß-actina se utilizó como control para la carga de proteínas. C = ACC, B = tumor benigno de la corteza suprarrenal, y N = corteza adrenal normal. D) Gráfico de dispersión de KIAA0101 mRNA y el nivel de expresión de la proteína en muestras de tejido adrenocorticales normales, benignas y malignas. Eje Y muestra la expresión de ARNm normalizado por RT-PCR cuantitativa y el eje X muestra el nivel de expresión de la proteína en la misma muestra basado en la medición banda densitometría normalizado a ß nivel de expresión de actina. lanceros coeficiente de correlación (r) = 0,61, p & lt; 0,001. E) La inmunohistoquímica para la expresión de la proteína KIAA0101 en el tejido de la corteza suprarrenal normales, los tumores benignos y ACC. Se muestran imágenes representativas de cada categoría de 20 aumentos. La flecha indica la tinción nuclear positiva para KIAA0101. En muestras de tejido normal, sólo la región subcupsular fue positiva. F) KIAA0101 localización celular se analizó por immunoflouroscence. Los núcleos se tiñeron por DAPI (azul), el rojo indica la expresión KIAA0101. Imágenes representativas de ACC maligno y muestras normales se muestran a 20 aumentos.
Dada la diferencia significativa en la expresión de ARNm entre tumores benignos y malignos, estábamos interesados en la evaluación de si KIAA0101 fue un predictor de diagnóstico exacto de tumor tipo. expresión KIAA0101 fue 84% exacto para distinguir entre ACC y muestras de tumores adrenocorticales normales y benignos (número de resultados positivos y negativos verdaderos dividido por el número total de la muestra usando un nivel de corte de 1,5). El área bajo la curva característica operativa del receptor (ROC) (AUC) fue de 0,78 para la expresión KIAA0101 mRNA (Figura 1B), 0,79 para el tamaño del tumor, y 0,85 para la combinación de la expresión de KIAA0101 y el tamaño del tumor.
Además de la expresión de alto mRNA, expresión de la proteína KIAA0101 también se elevó en ACC, en comparación con la corteza adrenal normal y muestras de tumores adrenocorticales benignas. Por transferencia Western, se encontró una expresión más alta en ACC (n = 3) que los tumores adrenocorticales benignos (n = 13), y en muestras normales de la corteza adrenal (n = 5) (Figura 1C). Hubo una buena correlación entre KIAA0101 mRNA y los niveles de expresión de proteínas (Figura 1D, r = 0,61, p & lt; 0,001). A fin de evaluar la expresión de KIAA0101, se realizó un análisis semicuantitativo de una matriz de tejido que contiene pequeñas secciones de tumores benignos y malignos por inmunohistoquímica para la proteína KIAA0101. Este análisis no encontró ninguna diferencia significativa en la expresión de la proteína KIAA0101 entre tumores benignos y malignos (p = 0,31). Esto no es sorprendente ya que la inmunohistoquímica es un método semicuantitativo y puede no detectar diferencias más pequeñas en la expresión de proteínas. Sin embargo, cuando la expresión de proteínas KIAA0101 se evaluó en muestras benignas y malignas individuales de la matriz, la sobreexpresión significativa se observó en comparación con las muestras normales (Figura 1E). KIAA0101 proteína estaba presente en el citoplasma y núcleo, que también fue confirmado por inmunofluorescencia (Figura 1F).
Hemos observado solamente tinción KIAA0101 escasa en algunas muestras normales de la corteza suprarrenal, que se limitó a la región de la corteza subcapsular ( Figura 2A). Para determinar si esta esfera de actividad positiva para KIAA0101 representado células progenitoras suprarrenales, que co-manchado las mismas muestras normales corteza suprarrenal con el factor 1 androgénica (SF-1) de anticuerpos, un marcador de células progenitoras suprarrenales [23]. Curiosamente, las muestras de la corteza adrenal normales mostraron co-tinción de KIAA0101 y SF-1 juntos en la región subcapsular o progenitor de la corteza suprarrenal (Figura 2B).
A) Tinción inmunohistoquímica de la corteza adrenal normal para SF-1 y KIAA0101. En el primer panel, las zonas de la corteza suprarrenal se indican a 10X, 1: Zona glomerular que contienen células progenitoras, 2: Zona fasciculata, 3: Zona reticular. panel de segundo y tercer indican el SF-1 (20X 40X con recuadro) y la inmunotinción positiva KIAA0101 en la Zona glomerular de 20 aumentos. Las flechas rojas indican las áreas positivas para SF-1 y KIAA0101 tinción. B) Immunofluoroscence para SF-1 y KIAA0101 en la corteza suprarrenal normal. Los núcleos se tiñeron por DAPI (azul), el rojo indica la expresión KIAA0101 y el color verde indica SF-1 de expresión. Imágenes fusionadas (color amarillo) a 40X espectáculo colocalización de las dos proteínas, SF-1 y KIAA0101 en células progenitoras de la corteza adrenal normal.
Mecanismo de KIAA0101 sobreexpresión en ACC
Para determinar si la sobreexpresión KIAA0101 fue una consecuencia de variaciones en la secuencia del gen, se realizó un análisis de la mutación en el KIAA0101. Encontramos uno de
novo
G & gt; Una transición mutación en la posición 186 que cae en la región de KIAA0101 no codificante en una muestra benigna. También se observó un polimorfismo en el 5 'UTR en el exón 1-2 (88T & gt; C). Acerca de 6,6% de benigna eran heterocigotos y 12,5% en el normal, pero ninguno en las muestras malignas (Tabla 2). Teniendo en cuenta estos resultados, es poco probable que la sobreexpresión KIAA0101 es resultado de una mutación.
El efecto funcional de desmontables de gen KIAA0101 en una línea celular ACC
Dada la sobreexpresión significativa de KIAA0101 en ACC (Figura 1) y la observación de que la expresión de KIAA0101 se limita a la proliferación de células adrenales progentitor (Figura 2B), la hipótesis de que KIAA0101 juega un papel en el crecimiento de células de la corteza suprarrenal. Para abordar esta cuestión, hemos utilizado siRNA desmontables expresión de KIAA0101 en la línea celular ACC, NCI-H295R. La transfección transitoria de KIAA0101 siRNA resultó en una caída de 10 veces en 24 horas y este efecto se mantiene durante hasta 6 días en el mRNA y 80% de reducción en los niveles de proteína en comparación con una no la orientación siRNA (control negativo siRNA) ( Figura 3). knockdown KIAA0101 resultó en modesto aumento en la proliferación celular con un aumento en el número de células de hasta 25% (p = 0,005) (Figura 4A). Además, la tasa de tiempo y crecimiento de la línea celular de duplicación fueron diferentes para siRNA desmontables en comparación con el control negativo (tiempo promedio de 4,7 y la tasa de crecimiento de 0,14 duplicar en comparación con el tiempo medio de duplicación de 3,5 y la tasa de crecimiento de 0,19 a partir del día 1 a 5 , respectivamente). Análisis del ciclo celular reveló un aumento moderado en el número de células en fase G1 (p = 0,013) (Figura 4B). Teniendo en cuenta estos resultados contradictorios, también se evaluó la expresión de ARNm de las proteínas reguladoras del ciclo celular G1 a la fase G1 después de KIAA0101 caída. desmontables KIAA0101 no alteró significativamente la expresión del ARNm de p21 y ciclina D1, proteínas reguladoras del ciclo celular, en una línea celular ACC. Además, KIAA0101 gen desmontables no tuvo ningún efecto significativo en el número de células en apoptosis (datos no presentados).
A) las células se transfectaron con H295R KIAA0101 siRNA y el control negativo y se analizaron para la expresión KIAA0101 mRNA después de 48 horas del tratamiento. Las columnas representan KIAA0101 mRNA porcentaje expresión respecto al control negativo ± desviación estándar de cuatro experimentos. B) Representante de transferencia de Western que demuestra la expresión de proteínas de KIAA0101 después de 6 días de siRNA y el control negativo. C) La intensidad relativa de Western blot utilizando el software Image J. Columnas indican la relación de las mediciones de intensidad KIAA0101 y GAPDH. NC40 = control negativo a 40 nM; SI40 = siRNA en 40 nM; NC80 = control negativo a 80 nm; SI80 = siRNA a 80 nM.
A) El número de células de la KIAA0101 siRNA tratados y de control negativo tratado grupos se muestran en los puntos de tiempo indicados (valores significativos se indican con asterisco (*) (p = 0,005;. respecto al control negativo) Las barras de error representan ± error estándar de la media y son representativos de cuatro experimentos NC80 = control negativo a 80 nm;. SI80 = siRNA a 80 nM B) desmontables gen KIAA0101 y el análisis del ciclo celular se indica. en diferentes puntos temporales. imagen representativa del perfil del ciclo celular de siRNA y los grupos de tratamiento de control negativos. C) Cada columna indica la distribución de la población G0 /G1 de las células en cada grupo a varios tiempos. Las barras de error representan ± error estándar de la media y son representativos de cuatro experimentos * Día 3 y 5, p & lt;. 0,05; respecto al control negativo.
Teniendo en cuenta los efectos paradójicos, un modesto aumento en la proliferación celular y la detención de G1, hemos utilizado los ensayos funcionales adicionales para comprender mejor los cambios fenotípicos asociados con la caída KIAA0101. Específicamente se evaluaron tumorigenicidad y el potencial metastático. knockdown KIAA0101 en células NCI-H295R redujo el número de colonias que fueron capaces de crecer en agar blando en casi un 80% (p = 0,001) a los 16 días de cultivo (Figuras 5A y 5B) con un 60% de reducción en la invasión de células en el la línea celular NCI-H295R (p = 0,006) (Figuras 5C y 5D).
a) las células se cultivaron durante 15 días en presencia de las concentraciones indicadas de siRNA y control negativo. Se muestran imágenes representativas a 12X y 40X aumentos. B) La distribución y el número de colonias en el grupo tratado con KIAA0101 siRNA y el grupo de control negativo a 80 nM (p = 0,001; respecto al control negativo; NC80 = control negativo a 80 nM; SI80 = siRNA a 80 nM). Las barras de error representan ± error estándar de la media y son representativos de cuatro experimentos. C) células invasoras se tiñeron con 0,2% de cristal violeta y se visualizaron por microscopía. Imágenes representativas de 20X siguientes ensayo de invasión. D) La distribución del número de células en KIAA0101 siRNA y grupo de control negativo. Las columnas representan la media ± desviación estándar (DE) de tres experimentos independientes realizados por triplicado. * P & lt; 0,05 vs. KIAA0101 siRNA control negativo. H295R células fueron transfectadas con el control negativo o KIAA0101 siRNA a 80 nM durante 120 h, seguido de un ensayo de invasión durante 48 h.
Discusión
En este estudio, hemos examinado la expresión de KIAA0101 y la función en el CAC. Nuestros resultados indican que KIAA0101 se sobreexpresa en el CAC, es un buen marcador diagnóstico de la ACC, y es un marcador de proliferación celular. La supresión de la expresión de KIAA0101 en células de carcinoma de la corteza suprarrenal resultó en la supresión del crecimiento y la invasión, lo que sugiere que juega un papel en la promoción del crecimiento del CAC.
Los estudios anteriores han demostrado alteraciones en la expresión de KIAA0101 en tumores malignos humanos y la expresión ausente o baja en condiciones normales tejidos [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22]. Sin embargo, se han obtenido resultados contradictorios para la expresión KIAA0101 en el carcinoma hepatocelular (HCC). En un estudio, se encontró que la expresión KIAA0101 ser downregulated en HCC [13]. Por el contrario, en un estudio separado, en una gran cohorte de pacientes con HCC, KIAA0101 se upregulated [18]. Nuestro estudio también demostró la sobreexpresión KIAA0101 en el CAC primaria, pero, curiosamente, la expresión de mRNA de KIAA0101 fue menor en los tumores de una cohorte de pacientes con metástasis y recurrentes ACC que respondieron a la quimioterapia sistémica y resección fue sometido. Estos resultados sugieren que la expresión KIAA0101 puede variar como resultado del tratamiento y, posiblemente, podría ser utilizado como un biomarcador para la respuesta al tratamiento en ACC y otros tipos de cáncer.
Aunque hemos encontrado que la expresión de la proteína KIAA0101 fue mayor en los tumores malignos y benignos en comparación con las muestras normales, hicimos detectar la expresión de KIAA0101 en un subconjunto de muestras normales. Su expresión se limita a la región subcapular de la corteza suprarrenal y se superponen las células de tinción positiva SF-1. En esta región, SF-1 células positivas son la hipótesis de que las células progenitoras suprarrenales [24]. Las células progenitoras poseen alta capacidad proliferativa. KIAA0101 y SF-1 co-expresión en la región progenitor de la corteza adrenal normal sugiere que KIAA0101 puede ser un marcador de la proliferación en células adrenocorticales. Consistente con esto, un estudio realizado por Simpson et al., Ha demostrado la localización de KIAA0101 en la capa de células basales de la piel y la zona de proliferación en las criptas del colon [15].
Poco se sabe acerca de la función del gen KIAA0101 en la biología de las células tumorales. Anteriormente, los estudios han sugerido que KIAA0101 está implicado en la regulación de la replicación del ADN, ciclo celular, la apoptosis y la proliferación celular [13], [14], [15], [18], [25], [26].