Extracto
Los hombres que viven en Fiji y beber kava tienen una baja incidencia de cáncer de próstata (PCA). Sin embargo, la incidencia de CaP entre los hombres de Fiji que habían emigrado a Australia, se incrementó en 5,1 veces. tanto, nuestro estudio los posibles efectos de los extractos de raíz de kava y sus componentes activos (kavalactonas y flavokawains) sobre el crecimiento de CaP y la expresión del receptor de andrógenos (AR). líneas celulares de CaP (LNCaP, LAPC-4, 22Rv1, C4-2B, DU145 y PC-3) con diferente expresión AR, y una línea celular transformada de miofibroblastos próstata (WPMY-1), fueron tratados con un extracto de kava comercial, kavalactones ( kawain, 5'6'-dehydrokawain, yangonin, metisticina) y flavokawain B. Expresión de AR y sus genes diana (
PSA
y
TMPRSS2
) fue examinado. Dos nuevos modelos de xenoinjertos de CaP pacientes derivados a partir de muestras de CaP de alto grado se establecieron mediante la implantación de los especímenes en ratones desnudos y pasando piezas tumorales a través de la inyección subcutánea en ratones desnudos, y luego tratados con extracto de kava y flavokawain B para examinar sus efectos en el crecimiento del tumor, expresión AR y los niveles de PSA en suero. El extracto de kava y flavokawain B efectivamente regulados hacia abajo la expresión tanto de la AR de larga duración y las variantes de corte y empalme AR. El extracto de kava y kavalactonas aceleran la degradación de proteínas AR, mientras que flavokawain B inhibido
AR
la transcripción del mRNA a través de la disminución de la expresión de SP1 y la unión de Sp1 en el promotor de AR. El extracto de raíz de kava y flavokawain B reducen el crecimiento del tumor, AR expresión en los tejidos tumorales y los niveles de PSA en suero en los modelos de xenoinjertos CaP derivados del paciente. Estos resultados sugieren una posible utilidad de un producto kava seguro o sus componentes activos para la prevención y el tratamiento de CaP avanzado por la orientación AR
Visto:. Li X, Z Liu, Xu X, Blair CA, Sun Z, Xie J, et al. (2012) Kava Componentes regular a la baja expresión de AR y AR variantes de empalme y reducir el crecimiento del cáncer de próstata en xenoinjertos-derivados de los pacientes en ratones. PLoS ONE 7 (2): e31213. doi: 10.1371 /journal.pone.0031213
Editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 22 Noviembre 2011; Aceptado: January 4, 2012; Publicado: 9 Febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud subvenciones CA129793 y CA122558 (http://www.cancer.gov/)and Instituto americano para la Investigación del cáncer conceder 41493 (http://www.aicr.org). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los hombres asiáticos /del Pacífico que consumen una baja en grasas y dieta basada en vegetales tienen los índices más bajos de CaP clínico en el mundo [1], [2]. Sin embargo, cuando los hombres asiáticos emigran a los EE.UU., las tasas de CaP clínico aumentan [3]. Estas observaciones implican a los factores ambientales y los hábitos alimenticios (como el consumo de bajo contenido de grasa y la dieta a base de plantas) en el desarrollo del CaP. Por lo tanto, una de las estrategias para la prevención y el tratamiento del CaP se ha centrado en el uso de componentes bioactivos de los alimentos naturales y sintéticos.
Kava (
Pipermethysticum Forst
) es una planta perenne indígena al Pacífico Islas. raíz de kava y el rizoma se utilizan para preparar una bebida no fermentada y ceremonial con efectos relajantes en las Islas del Pacífico durante miles de años [4]. Inusualmente bajas incidencias de varios tipos de cáncer, incluyendo cáncer de pulmón y cáncer de próstata, se presentan en las naciones insulares del Pacífico a pesar de un alto porcentaje de fumadores en estas poblaciones [2], [5]. Además, Steiner [6] informó de que la incidencia del cáncer estandarizada por edad para los tres países kava potable más altos (Vanuatu, Fiji y Samoa Occidental) era un cuarto o un tercio de los países no-kava potable, como Nueva Zelanda y Estados Unidos (Hawai y Los Ángeles), y los polinesios no kava potable (maoríes). Excepcionalmente, en estos tres países kava potable más hombres beben kava y el humo que las mujeres, sin embargo, hay una menor incidencia de cáncer para los hombres que para las mujeres [6]. Por otra parte, el Consejo del Cáncer de Cáncer en Nueva Gales del Sur informe (NSW) migrantes 1991-2001 encontró [7] que la incidencia de CaP en hombres que emigraron a Fiji y residiera en Nueva Gales del Sur, Australia, aumentó en 5,1 veces en comparación con los que viven en Fiji . Este informe nos ha llevado a investigar los beneficios potenciales de extractos de kava y sus componentes activos para la prevención del CaP.
Se presenta por primera vez que un extracto de kava comercial y sus componentes activos (kavalactonas y flavokawain B) abajo regular la expresión AR. El agotamiento de la proteína AR se produjo a través de dos mecanismos diferentes: 1) la degradación de proteínas mejorada AR, y 2) reduce la proteína especificidad 1 (SP1) mediada por la transcripción AR. Kava extraer y tratamiento flavokawain B de ratones con xenoinjertos derivados del paciente redujo el crecimiento tumoral y la expresión de AR y su objetivo genes en los tejidos tumorales, y los niveles séricos de PSA más bajos.
Métodos
Declaración de Ética
el uso de ratones y de su consideración de este estudio fue aprobado específicamente por la Universidad de California, Irvine Institucional cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC; número de protocolo 2007 a 2741).
las líneas celulares, compuestos y reactivos
El LNCaP, LAPC4, 22Rv1, PC3, DU145, y líneas celulares WPMY-1 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA), y la línea celular C4-2B era de Urocor Inc. (Oklahoma City, OK). Estas células se cultivaron en medio RPMI 1640 con 10% de suero bovino fetal (FBS). Todas las líneas celulares utilizadas en este estudio se encontraban dentro de 20 pases después de la recepción. Las líneas celulares fueron probados y autenticados por la ATCC o Urocor Inc. Todas las líneas de células se ensayaron también para las especies conocidas de contaminación por micoplasma utilizando un kit de Lonza Inc. (Walkersville, MD). kawain pura, 5 ', 6' dehydrokawain, yangonin, metisticina, y flavokawain B (99%) se aislaron a partir de extractos de kava por LKT Laboratories, Inc. (St. Paul, MN). Kava extracto de raíz a una concentración de 150 mg /ml kavalactones en 50% de etanol se obtuvo de Gaia Herbs (Brevard, NC). Los anticuerpos contra la AR y la tubulina eran de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Los anticuerpos de PSA y SP1 se adquirieron de Thermo Scientific (Fremont, CA). 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, bromuro de 5-difeniltetrazolio (MTT) era de Sigma. RNAzol B fue adquirido de Tel-Test (Friendswood, TX.). El kit del sistema de transcripción inversa y fue de Promega (Mandison, WI). Un kit de RT-PCR cuantitativa era de Bio-Rad (Hercules, CA).
Medición de kavalactonas y flavokawains en el extracto de la raíz de kava
El extracto de kava se diluyó 400 veces por acetonitrilo, y después se filtró con filtros de 0,45 micras resistentes a los solventes y se almacena a -80 ° C hasta su posterior análisis. La cromatografía se realizó en un Ultra Performance Liquid Chromatography Acquity (UPLC) sistema (Waters Corp., Milford, MA, EE.UU.) con un muestreador automático a 8 ° C. La separación de los compuestos se llevó a cabo a 50 ° C usando un Waters Acquity UPLC ®BEH C18 (2,1 mm × 50) columna de 1,7 m con un gradiente de elución: (A) agua: acetonitrilo: ácido acético (v /v 97.8:2:0.2 /v), y (B) acetonitrilo:. ácido acético 99.8:0.2 (v /v) como fase móvil
el programa de elución fue el siguiente: 10% de B (inicial), 90% B (1,0 min), 90% B (2,0 min), 10% B (2,05 min) y 10% (3 min). El caudal fue de 0,3 ml /min y el volumen de inyección fue de 10 mL. La UPLC se acopló a Micromass Quattro Micro cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC /MS /MS) espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (Mass Rango: 2~2000 m /z) con ionización electrospray de interfaz (ESI) en modo positivo. El instrumento se hizo funcionar en un modo de ion positivo con una tensión de ESI de 3,8 kV, y un flujo de gas de desolvatación de 700 L /h. El argón se utilizó como la colisión inducida por gas de disociación a una presión de 7,1
e-3 mbar con una transición de monitoreo de reacción seleccionada para flavokawain A de m /z 315 & gt; m /z 181, flavokawain B de 284 & gt; 181, kawain de 231 & gt; 115, 5 ', 6' dehydrokawain de 229 & gt; 131, mythysticin de 275 & gt; 159, Yangonin de 259 & gt;. 161
MTT ensayo
Las células se sembraron a una densidad de 2 × 10
4 por pocillo en placas de cultivo de 24 pocillos durante 24 horas, y después se trató como se indica en las figuras. Después del tratamiento durante 72 horas, /mL de MTT se añadió 1 mg a cada pocillo durante 2 horas, y se determinó la absorbancia a 570 nm. Las curvas de dosis-respuesta para la inhibición del crecimiento se generaron como un porcentaje de los controles tratados con vehículo.
Western blot
Se aclararon los lisados de proteínas (20-100 mg) fueron desnaturalizados y resueltas por 8-16 % SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, y se sondearon con anticuerpos indicados y se visualizaron mediante un sistema de detección de quimioluminiscencia.
RT-PCR cuantitativa
cuantitativa en tiempo real las reacciones de amplificación de PCR para
AR
, antígeno específico de próstata (
PSA
) y la proteasa transmembrana, serina 2 (
TMPRSS2
) los niveles de mRNA se llevaron a cabo utilizando el sistema MyiQ (Bio-Rad) como se ha descrito anteriormente [8], [9]. Las secuencias de los cebadores para
AR
,
PSA
y
TMPRSS2
están disponibles bajo petición. Los datos se analizaron utilizando el método comparativo Ct, donde Ct es el ciclo en el cual la fluorescencia primero supera el umbral. Los valores de Ct de cada muestra se obtuvieron restando los valores de beta-actina Ct del valor Ct del gen diana. La variación de
beta actina
valores de Ct es & lt; 0,5 entre las diferentes muestras. A diferencia de un ciclo de valor de Ct representa una diferencia de 2 veces en el nivel de mRNA. La especificidad de los productos resultantes de la PCR fue confirmada por las curvas y en gel de agarosa de fusión.
transfección, la actividad del promotor y de ensayo de luciferasa
Los plásmidos PSA-Luc y Plars-Luc son un regalo amablemente por el Dr. Wang (New York University Cancer Institute) Longgui. Sp1 humana etiquetada con HA plásmido fue proporcionado amablemente por Macus Tien Kuo (La Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center de). células C4-2B y LNCaP fueron co-transfectadas con PSA-Luc o Plars-Luc y el plásmido de luciferasa de Renilla pGL 4,71 (Promega) o con Sp1-HA plásmido mediante Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Después de 48 horas, se añadió flavokawain B, como se indica con triples repeticiones. A continuación, se recogieron las células y la actividad luciferasa se midió con el sistema Dual-Glo Luiferase de ensayo (Promega). Renilla luminiscencia se utilizó como un control interno para el número de células y la eficiencia de la transfección. La proporción relativa de la luminiscencia de promotor del gen de interés a Renilla luminiscencia se muestra en las figuras como la actividad del promotor. Para Sp1 transfección, las células se cosecha para un ensayo de inmunotransferencia.
Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) [10] Las células
LNCaP y C4-2B fueron reticuladas por el formaldehído. El complejo de proteína /ADN fue esquilada de 500-1500 pb fragmentos mediante ultrasonidos. Cantidades iguales de proteína (4 mg) se incubaron con anticuerpo Sp1, o con un anticuerpo de ratón anti-GFP. se emplearon perlas de Protein G Sepharose (Sigma) para tirar hacia abajo el complejo, seguido de lavado con alta Salt Wash Buffer, LiCl, y tampones TE). Los inmunoprecipitados ADN-proteína se eluyeron de las perlas y el ADN se extrajo y se purificó. Ampliar el sistema PCR de alta fidelidad (Roche) se utilizó para amplificar la secuencia de 248 a 487 nucleótidos de la AR región 5'-UTR, que contienen dos sitios de unión SP1. Primer secuencias están disponibles bajo petición.
Tratamiento de modelos de xenoinjertos de tumores CaP pacientes derivados de
tejidos de prostatectomía se obtuvieron a través de un protocolo aprobado por el IRB en la UCI Medical Center. Pequeños fragmentos de tumor histológicamente probado se implantaron en ratones 8 semanas de edad, macho inmunodeficiencia combinada severa (SCID) mediante una técnica xeongraft subrenal [11]. Los tumores designados como GM0308 y RC0309 a los 3 y 13 pasajes murinos, respectivamente, fueron re-implantaron en bolsillos subcutáneos de ratones SCID. Una semana más tarde, cuando los tumores crecieron hasta aproximadamente 100 mm
3, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en grupos de tratamiento. Para el tratamiento con extracto de kava, los ratones fueron alimentados con una dieta estándar suplementado con ya sea el control del vehículo o 6 g /kg de extracto de kava en la dieta. Para el tratamiento flavokawain B, los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal cada día con el control del vehículo (10% DMSO, 20% de etanol y 70% Cremophor) o 200 mg flavokawain B /kilogramo de peso corporal del ratón. Se continuó el tratamiento del día 0 al día 17 para el extracto de kava y día 27 para flavokawain B. El crecimiento tumoral se controló tanto por PSA sérico y medición del calibre del tamaño del tumor semanalmente. El peso corporal y la ingesta de alimentos se registraron durante los experimentos. Al final de los experimentos, los tejidos tumorales se pesaron y se cortaron en un medio para el aislamiento de mRNA y la tinción inmunohistoquímica, respectivamente. El volumen del tumor se calculó por la fórmula: 0,5236 x L
1 × (L
2)
2, donde L
1 es el eje largo y L
2 es el eje corto de el tumor. la concentración de PSA en suero se determinó mediante el kit de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas PSA (Bio-Quant, San Diego, CA) siguiendo las instrucciones del kit.
La inmunohistoquímica
El antígeno se recupera utilizando 0,05 M de glicina-HCl tampón, pH 3,5, que contiene 0,01% de EDTA (v /w), a 95 ° C durante 20 min y se tiñeron con anti-AR humana (1:100). La tinción se visualizó con diaminobenzadina utilizando el kit de tinción Celular y Tisular (I + amp; D Systems).
El análisis estadístico
Las comparaciones cuantitativas de RT-PCR ensayos y promotoras entre tratamiento y de control se realizaron experimentos utilizando
t de Student
. Para los experimentos de crecimiento del tumor, de medidas repetidas ANOVA se utilizó para examinar las diferencias en el tamaño del tumor entre los tratamientos, los puntos de tiempo, y las interacciones en tiempo de tratamiento. después de los ensayos adicionales se realizaron para examinar las diferencias en el tamaño del tumor entre el control, el extracto de kava, y el tratamiento flavokawain B en cada punto de tiempo utilizando el método de Bonferroni conservador. Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras.
Resultados
El extracto de kava y sus componentes activos (kavalactonas y flavokawain B) diferencialmente inhibir el crecimiento de células que expresan AR
kavalactonas y chalconas (es decir, flavokawains) son dos clases importantes de compuestos bioactivos identificados a partir de extractos de kava. El uso de la UPLC, que mide el contenido de kavalactonas y flavokawains. El extracto de kava comercial disuelto en etanol y se utiliza aquí contenía 2,7% kawain, 1,75% 5, 6-dehydrokawain, 3,08% Yangonin, 1,4% metisticina, 0,33% flavokawain B, y 0,21% flavokawain A (Figura 1). Para examinar el potencial de los componentes del extracto de kava para inhibir el crecimiento de CaP, las líneas celulares de CaP y una línea de miofibroblastos de próstata transformado fueron tratados con el extracto de kava, kavalactonas y flavokawain B. Las líneas celulares varían en su expresión de proteínas AR, así como su la dependencia de andrógenos. La Figura 2 y la Tabla 1 muestran que el extracto de raíz de kava inhibió de manera similar líneas celulares de CaP sensibles e insensibles de andrógenos. El extracto de raíz de kava era más potente que kavalactones pero menos potente que flavokawain B en la inhibición del crecimiento. Entre los kavalactones, 5, 6-dehydrokawain es el agente más potente en la inhibición del crecimiento de líneas celulares de CaP (Figura 2 y Tabla 1). Tanto el extracto de raíz de kava y 5, 6-dehydrokawain igualmente en la inhibición del crecimiento de LNCaP y su C4-2B derivado, mientras que flavokawain B era aproximadamente 4,5 veces más eficaz para reducir el crecimiento de las células C4-2B que el crecimiento de las células LNCaP . Dado que el extracto de kava tiene mucho menos flavokawain B y más 5, 6-dehydrokawain, este resultado sugiere que 5, 6-dehydrokawain o su combinación con otros componentes activos pueden desempeñar un papel dominante para el efecto inhibidor del extracto de kava en el crecimiento de líneas celulares de CaP.
las células en placas de cultivo de 24 pocillos se trataron con DMSO al 0,1%, extracto de raíz de kava, kawain, 5 ', 6' dehydrokawain, yangonin, metisticina, o flavokawain B (FKB) a las dosis indicadas. Después de 72 horas de tratamiento, las densidades de células se midieron mediante el ensayo de MTT. Cada punto es la media de los valores de cuatro placas independientes; bares, Dakota del Sur. Cada muestra se contó en duplicado. IC
50 s se estimaron mediante curvas de dosis-respuesta.
extracto de raíz de Kava y kavalactonas disminuyen la expresión de PSA y TMPRSS2 través de la aceleración de la degradación de proteínas AR
la figura 3A muestra que el extracto de kava y kavalactonas (es decir kawain, 5'6'-dehydrokawain, yangonin, y metisticina) sensiblemente regular a la baja la expresión de mRNA de los genes diana de AR (
PSA
y
TMRSS2
), pero no la expresión de mRNA de AR en las células C4-2B. La figura 3B y C muestra que tanto el extracto kava y kavalactones individuales disminuyen AR y expresión de la proteína PSA también. El efecto inhibidor del crecimiento de los kavalactonas débil correlación con sus efectos sobre la proteína AR baja regulación. C4-2B células LNCaP, un derivado andrógeno-independiente, eran más sensibles al efecto AR abajo de la regulación de los kavalactonas y el extracto de kava que las células LNCaP fueron.
(A). células C4-2B se trataron con 0,1% de DMSO, extracto de raíz de kava, dehydrokawain, kawain, yangonin y metisticina durante 8 horas. los niveles de mRNA de los genes diana de AR y AR (
PSA
y
TMPRSS2
) se determinaron por tiempo real RT-PCR. Las barras son medias ± SD de tres medidas cuantitativas independientes. Extracto de raíz de kava y kavalactonas disminuyen significativamente la expresión de mRNA de los genes diana de AR (Estudiante
t
prueba, P & lt; 0,01), pero no la de AR (P & gt; 0,05). (B) y (C). La expresión de la proteína de AR y PSA en las células LNCaP y C4-2B después indicaron tratamientos a una concentración de su IC
50 s para 16 horas se analizaron por Western blot. a-tubulina se detectó como control de carga. A blot representativo se muestra a partir de tres experimentos independientes. Y = yangonin; M = metisticina; D = 5'6; -dehydrokawain; K = kawain, KRE = extracto de raíz de kava. (RE). células C4-2B se pretrataron con 10 mg cicloheximida /ml durante 2 horas y luego complementado con extracto de raíz de kava o 5'6; -dehydrokawain a una concentración de sus IC
50 s para diferentes períodos de tiempo. Después de los tratamientos, los niveles de proteína de AR se analizaron por transferencia Western y semi-cuantificados por densitometría de medición. Una mancha representativo se muestra a partir de tres experimentos independientes.
A continuación examinó la estabilidad de la proteína AR mediante el tratamiento de las células con cicloheximida para inhibir la síntesis de proteínas nuevas. Figura 3D demuestra que la proteína de AR presenta una degradación acelerada de las células C4-2B tratados con el extracto de kava o 5'6'-dehydrokawain, si se compara con su estabilidad en las células tratadas con vehículo. A las 16 y 24 horas de los tratamientos, el extracto de kava y tratamientos 5'6'-dehydrokawain disminuyen los niveles de proteína de AR en alrededor de 80% y 70%, respectivamente, mientras que el nivel de proteína de AR en el control del vehículo solamente disminuir en alrededor de 20% y 37% , respectivamente (Figura 3D).
Flavokawain B regula a la baja la expresión de AR y sus genes diana (PSA y TMPRSS2) guía
Flavokawain B es el agente más potente para inhibir el crecimiento celular entre las componentes bioactivos examinados del extracto de kava. Por ello, investigó el efecto de flavokawain B sobre la expresión de AR. Figura 4A muestra que flavokawain B disminuyen significativamente la expresión de la proteína AR en todas las líneas celulares que expresan AR (LAPC4, C4-2B, WPMY-1, LNCaP y 22Rv1). Curiosamente, el nivel de proteína en las células AR WPMY-1 es el más sensible a flavokawain tratamiento B. Desde WPMY-1 representa una línea de miofibroblastos próstata transformado [12], este resultado sugiere que flavokawain B puede ser un nuevo agente para la orientación CaP AR estromal. Flavokawain B también disminuyó los niveles de proteína de PSA (Figura 4A). La Figura 4B muestra que flavokawain B inhibe la expresión de las proteínas de AR y PSA inducida por un análogo de andrógeno sintético, R1881. El tratamiento previo con un inhibidor del proteasoma, MG132, no se recuperó el flavokawain B abajo reguladas-AR nivel de proteína (Figura 4C). En contraste con el extracto de kava y kavalactonas tratamientos, el tratamiento de células LNCaP y C4-2B con 5 mg /ml flavokawain B para 4 y 8 horas dieron como resultado una marcada disminución en los niveles de mRNA de
AR
y su objetivo genes
(PSA y TMPRSS2) gratis (Figura 4D). Estos resultados sugieren que AR mediada por B flavokawain baja regulación es a través de su regulación transcripcional.
(A) .La expresión de la proteína de tratamientos AR y PSA después de indicados durante 16 horas o FKB 5 mg /ml de período indicado de veces que se analizó por Western blot. a-tubulina se detectó como control de carga. A blot representativo se muestra a partir de tres experimentos independientes. análisis de transferencia (B) muestra que .Western FKB disminuye tanto constitutiva y un andrógeno sintético, R1881, estimulada AR y PSA expresión en células LNCaP. células LNCaP fueron cultivadas en medio FBS tratado con carbón vegetal. FKB y R1881 a las concentraciones indicadas las células tratadas durante 16 horas. α-tubulina se detectó como control de carga. A blot representativo se muestra a partir de tres experimentos independientes. (DO). inhibidor del proteasoma, MG132, no afecta a FKB mediada baja regulación de la expresión de la proteína AR. células LNCaP se trataron con MG132 durante 2 horas y después se añadió FKB durante 16 horas adicionales. a-tubulina se detectó como control de carga. A blot representativo se muestra a partir de tres experimentos independientes. (RE). células LNCaP y C4-2B fueron tratados con 5 mg FKB /ml para 4 y 8 horas. Real-time RT-PCR se realizó para analizar la expresión de mRNA de los genes diana Ar y Ar (
PSA
y
TMPRSS2
). Bares son la media ± SD de tres experimentos independientes. FKB disminuye significativamente la expresión de mRNA de los genes diana de AR (Estudiante
t
prueba, P & lt; 0,01).
La represión transcripcional de AR por flavokawain B requiere la expresión del factor de transcripción Sp1
a continuación se investigó el potencial mecanismo de flavokawain B transcripción mediada por AR. Sp1 es un factor de transcripción putativo de regulación AR. Sp1 se une directamente a la caja de GC en el promotor AR a través de un motivo de la proteína dedo de zinc [13], [14]. Por lo tanto, un indicador de luciferasa promotor AR que contiene cuatro sitios de unión Sp1 se utilizó para la actividad promotora AR ensayo en líneas celulares de CaP. La Figura 5A muestra que los tratamientos flavokawain B disminuyen significativamente la actividad del promotor AR en una manera dependiente de la dosis. La disminución de la actividad del promotor de AR por flavokawain B se asoció con una reducción de los niveles de proteína Sp1 (Figura 5B). En consecuencia, el análisis de ChIP reveló que el tratamiento flavokawain B de las células LNCaP y C4-2B marcadamente inhibida la unión de Sp1 a las secuencias promotoras AR (Figura 5C). Para examinar si se requiere SP1 para flavokawain B-AR mediada baja regulación, las células fueron transfectadas transitoriamente C4-2B con SP1 y después se trató con flavokawain B. La figura 5D muestra que la sobreexpresión de la proteína Sp1 aumenta los niveles de AR y atenuó la inducida por B flavokawain AR baja regulación. Tomados en conjunto, nuestros resultados demuestran claramente que flavokawain B disminuye la expresión de proteína Sp1, lo que lleva a AR transcripcional baja regulación.
células .C4-2B (A) fueron co-transfectadas con PSA-Luc o Plars-Luc, junto con un plásmido de luciferasa de Renilla se midieron PGL 4,71 y luciferasa actividades. FKB disminuye significativamente las actividades promotoras de los
AR
y
PSA
genes (Estudiante
t
prueba, P & lt; 0,01). Bares son la media ± SD de tres experimentos independientes. (B) .Western secante análisis de la expresión de la proteína Sp1. A blot representativo se muestra a partir de tres experimentos independientes. α-tubulina se detectó como control de carga. (DO). Chip análisis de la unión de Sp1 a la secuencia promotora AR revela que 16 horas FKB tratamiento da como resultado una disminución significativa en la unión de Sp1 a la secuencia promotora AR que contienen dos sitios de unión SP1. IgG de ratón se usó como un control en blanco. (RE). La sobreexpresión de Sp1 en las células C4-2B atenúa FKB AR proteína inducida baja regulación. Después de 48 horas de Sp1-HA plásmido transfección, las células se trataron con C4-2B FKB durante 16 horas. SP1 y los niveles de proteína AR fueron examinados. A blot representativo se muestra a partir de tres experimentos independientes. α-tubulina se detectó como control de carga.
kavalactonas y B flavokawain combinación da como resultado un efecto inhibidor mejorado en el crecimiento de las células C4-2B y en la expresión de la proteína AR
Figura 6A y B muestran que 7,5 g /ml yangonin y 1 mg /ml flavokawain B solos inhibieron el crecimiento de células C4-2B por 15% y 20%, respectivamente, mientras que su combinación redujo el crecimiento en más de un 70%. Del mismo modo, 5'6'-dehydrokawain a una dosis de 7,5 mg /ml disminuyó la crecimiento de las células C4-2B por menos de 5%, mientras que su combinación con 1 mg /ml flavokwain B inhibió el crecimiento en aproximadamente un 60%. De acuerdo con este resultado, flavokawain B en combinación con otros kavalactones (es decir kawain y metisticina) también dio lugar a un efecto inhibidor sinérgico sobre el crecimiento de células C4-2B (Figura 6C y D). Por otra parte, la combinación de 5'6'-dehydrokawain o yagonin con tratamientos flavokawain B dio lugar a un aumento de la baja regulación de la expresión de proteínas AR tanto en las células C4-2B y 22Rv1 (Figura 6 E y F). Notablemente, 22Rv1 alberga una variante de empalme AR con un peso molecular de aproximadamente 80 KD [15]. Flavokawain B y 5'6'-dehydrokawain son más eficaces en la disminución de la expresión de la variante de empalme AR que la de la longitud completa AR (Figura 6F). Estos resultados indican que kavalactonas y actúan de forma sinérgica flavokawain B o aditiva para inhibir el crecimiento de células de CaP y regular a la baja expresión de la proteína de AR y la variante de empalme AR.
El inhibidor del crecimiento de FKB y yagonin (A), o 5'6; -dehydrokawain (B), o kawain (C), o metisticina (D) solo y en combinación sobre las células C4-2B. Cada punto es la media de cuatro experimentos independientes; bares, Dakota del Sur. Cada muestra se contó en duplicado. IC
50 s se estimaron mediante curvas de dosis-respuesta, IC
50 s de las combinaciones son significativamente inferiores a los de los tratamientos solos (Estudiante
t
prueba, P & lt; 0,01). (E) y (F) análisis de transferencia de Western de la expresión de la longitud completa AR (110 KDa), la variante de empalme AR (83 KDa) y PSA en las células C4-2B y 22Rv1, respectivamente. A blot representativo se muestra a partir de tres experimentos independientes. α-tubulina se detectó como control de carga.
extracto de kava y flavokawain B disminuir el crecimiento de xenoinjertos de CaP pacientes derivados en ratones SCID, AR expresión en los tejidos tumorales y los niveles séricos de PSA
Para determinar el
in vivo
anti-CP efecto del extracto de kava y flavokawain B, hemos desarrollado dos modelos más clínicamente relevantes, derivados de pacientes con CaP xenoinjertos, GM0308 y RC0309. El CaP derivado del paciente GM0308 xengrafts línea se derivó de un alto grado (puntuación de Gleason suma = 5 + 5) CaP pieza de prostatectomía obtenerse de un paciente que fue tratado previamente con terapia de privación de andrógenos (ADT), docetaxel y carboplatino y etopósido más cisplatino. El crecimiento del tumor de xenoinjerto se estableció inicialmente mediante el uso de una técnica de xenoinjerto subrenal, y luego pasa a través de la inyección subcutánea de piezas de tumor. La línea RC0309 se derivó de un alto grado de muestras (puntuación de Gleason suma = 5 + 4) CaP prostatectomía obtenidas de un paciente que no tenía ningún tratamiento previo. Estos xenoinjertos de cáncer humano preservan fielmente las características histopatológicas de la muestra clínica inicial. Ambas líneas secretan PSA en el suero de ratón huésped (Figura 6A). La línea GM0308 expresa un AR truncada alrededor de 80 KDa, sin mutaciones de sentido erróneo en los exones 3, 4, o 5 (datos no mostrados). Por el contrario, RC0309 mantiene la AR longitud completa (datos no mostrados).
Ratones portadores de tumores GM0308 en el paso 3 se trataron con control de vehículo o 200 mg /kg flavokawain B diariamente por inyección IP durante 28 días. La figura 6A muestra una elevación del PSA crecimiento de xenoinjerto de tumor y suero progresiva a lo largo de todo el estudio en el grupo de control del vehículo. El tratamiento flavokawain B, sin embargo, dio lugar a una disminución de la tasa de crecimiento del tumor en comparación con el grupo de control durante todo el estudio (Figura 7A). Los pesos húmedos de los tumores o PSA en suero en el control y el grupo flavokawain tratado B-registrados al final del tratamiento son 0,43 ± 0,27 g y 0,097 ± 0,048 g, o 66,6 ± 12,8 ng /ml y 18,4 ± 4,8 ng /ml, respectivamente ( media ± SD, n = 13 para el control y n = 6 para los grupos de tratamiento FKB; P & lt; 0,001, prueba de la t de Student). tratamiento Flavokawain B atenuó el crecimiento del tumor por 77,3% y la disminución de los niveles de PSA en suero de 68% al final del tratamiento.
(A) y (B). Los ratones con tumores CaP derivados del paciente se dividieron al azar en grupos de tratamiento y de control con pre-tratamiento de los niveles de PSA en suero similares en cada grupo. Los volúmenes tumorales y PSA sérico se registraron, y se presentan como media ± desviación estándar. peso húmedo de los tumores se representan como la media de los tumores de ratón individual en cada grupo. Bares, medios ± SD. Los volúmenes tumorales (medidas repetidas análisis de la varianza (ANOVA), P & lt; 0,01) y el peso de los tumores (Estudiante
t
prueba, P & lt; 0,01) de FKB y la KRE ratones tratados fueron significativamente más bajos que los de los vehículos los ratones tratados de control. (DO). tinción inmunohistología de expresión AR en tejidos tumorales. inmunotinción de control se realizó con IgG de isotipo solo; Las diapositivas se counterstained con hematoxilina y fotografiado usando un microscopio de luz. Aumento original: × 200. (RE). células positivas AR se contaron en 12 campos de cada grupo. El porcentaje de células positivas AR se calculan y presentan como media ± desviación estándar (los dos paneles de la izquierda). Los niveles de mRNA de
AR
,
PSA
y
TMPRSS2
en los tejidos tumorales tratadas con vehículo o FKB se analizaron por RT-PCR en tiempo real (el panel de la derecha). Bares, medios ± SD. Los porcentajes de células positivas AR son significativamente más bajos en el KRE y FKB grupos tratados que aquellos en los grupos tratados con el control del vehículo (Estudiante
t
prueba, P & lt; 0,01). Los niveles de mRNA de
AR
,
PSA
y
TMPRSS2
es menor en el KRE y FKB grupos tratados que los de los grupos de control (Estudiante
t
prueba, P & lt; 0,01.)
los ratones portadores de tumores RC0309 en el paso 13 se alimentaron con el alimento suplementado con control de vehículo o 6 g /kg del extracto de kava durante 18 días. Del mismo modo, la administración de suplementos de extracto de raíz de kava resultó en una disminución significativa en la tasa de crecimiento de los tumores en comparación con el control de vehículo (Figura 7B, ANOVA, P & lt; 0,01). Los pesos húmedos de los tumores fueron 1,83 ± 0,79 g en el grupo control y 0,73 ± 0,34 g en el grupo del extracto de la raíz de kava (Figura 7B; n = 5, media ± DE; P & lt; 0,05, prueba de la t de Student). (SEGUNDO). (DO).