Extracto
Antecedentes
Kinesin miembro de la familia 4A (KIF4A), un motor de proteínas a base de microtúbulos, fue implicado en la regulación de la estructura cromosómica y los microtúbulos del cinetocoro dinámica. Teniendo en cuenta las funciones de KIF4A, se asumió que KIF4A está implicado en la progresión de los carcinomas orales de células escamosas (OSCCs) a través de la activación de la asamblea de control de huso (SAC). Sin embargo, poco se sabe acerca de la relevancia de KIF4A en el comportamiento del COCE. Investigamos el estado de la expresión KIF4A y sus mecanismos funcionales en COCE.
Métodos
Los niveles de expresión KIF4A en siete células derivadas de la CCCA se analizaron mediante la reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa-transcriptasa inversa e inmunotransferencia análisis. Utilizando un modelo de KIF4A desmontables, se evaluó la expresión de (SAC) moléculas relacionados con la PI (BUB1, MAD2, CDC20, y ciclina B1), del ciclo celular, y la proliferación celular. Además de
In
in vitro
de datos, la correlación clínica entre los niveles de expresión en KIF4A OSCCs primaria (n = 106 pacientes) y el estado clínico patológica mediante técnicas de inmunohistoquímica (IHC) también fueron evaluados.
Resultados
KIF4A ARNm y proteínas son regulados de forma significativa (
P Hotel & lt; 0,05) en siete células derivadas-CCCA en comparación con los queratinocitos orales normales humanos. En las células KIF4A una caída, se observó la activación SAC a través de una mayor expresión BUB1 en los cinetocoros, kinetochore localización apropiada de MAD2, la baja regulación de CDC20, sobre regulación de la ciclina B1, y del ciclo celular en la fase G2 arrestado /M. Los resultados mostraron que la proliferación celular de las células desmontables KIF4A disminuyó significativamente (
P
& lt; 0,05) en comparación con células de control. IHC mostró que la expresión KIF4A en OSCCs primaria fue significativamente (
P Hotel & lt; 0,05) OSCCs mayor que en las contrapartes orales normales y que KIF4A-positivos se correlacionaron estrechamente (
P Hotel & lt; 0,05) con el tamaño tumoral.
Conclusiones
Nuestros resultados propuestos para la primera vez que KIF4A controla la proliferación celular a través de la activación SAC. Por lo tanto, KIF4A podría ser un regulador clave para la progresión tumoral en OSCCs
Visto:. Minakawa Y, Kasamatsu A, Koike H, Higo M, Nakashima D, Kouzu Y, et al. (2013) miembro de la familia Kinesin 4A: un predictor potencial de progresión del cáncer oral humana. PLoS ONE 8 (12): e85951. doi: 10.1371 /journal.pone.0085951
Editor: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 6 Junio, 2013; Aceptado: December 10, 2013; Publicado: December 30, 2013
Derechos de Autor © 2013 Minakawa et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las proteínas de la superfamilia kinesin (kifs), clasifican en. 14 subfamilias, son proteínas motoras dependientes de ATP con capacidad de movimiento plus de fin dependiente de microtúbulos [1,2]. Durante la mitosis, las actividades de KIFs sobre los microtúbulos del huso se controlan con precisión para asegurar que los eventos de la mitosis son orquestados en el orden correcto en toda la mitosis [3,4]. Estas proteínas de los microtúbulos interpolares controlan un equilibrio de fuerzas externas y fuerzas hacia dentro para asegurar la captura cromosoma y el apego a los husillos y prevenir alargamiento del husillo antes de la anafase [5,6]. Entre los KIFs, KIF4A controla la organización del huso, la alineación de los cromosomas, y la dinámica de los microtúbulos del cinetocoro con un regulador de la proteína de la citocinesis 1 [4,7-13]. La desregulación de KIF4A induce la separación del huso anormal y causa aneuploidía de células hijas [14,15]. Las células afectadas por aneploidy se caracterizan por la pérdida o ganancia de material genético. Se sospecha fuertemente que se asocia con la progresión del cáncer [16]. Por lo tanto, la hipótesis de que KIF4A podría estar asociado con la progresión del cáncer.
La asamblea de control de huso (SAC) supervisa las interacciones entre los cinetocoros y los microtúbulos del huso durante la mitosis y controla metafase-anafase transición hasta que todos los cromosomas establecen biorientación. Por lo tanto, el saco tiene un papel importante en la proliferación celular a través de un mecanismo de control del ciclo celular, que es especialmente crucial para la precisión de la segregación cromosómica [17-19]. El correcto funcionamiento del SAC requiere la acción concertada de varias proteínas de control, es decir, BubR1, Bub1, Bub3, Mad1, y Mad2 [19-22]. El puesto de control activo inhibe el complejo promotor de la anafase /cyclosome (APC /C) detenido en la anafase [23-26]. La inhibición de la APC /C evita la degradación de varias proteínas mitótico clave, que debe ser degradados por la anafase para iniciar [23-28]. La presencia de cromosomas no unidas o una falta de tensión husillo que normalmente se genera por los resultados de unión cromosoma bipolares en continuo de activación puesto de control, detención de la mitosis, y la muerte celular programada con el tiempo [17-19,23-25]. Además, el SAC se ha informado que es defectuoso en un número de cánceres humanos, incluyendo oral, colorrectal, de tiroides, y cáncer de ovario, y se asocia con la progresión del cáncer [29-32].
Debido a que la relación entre el SAC y KIF4A está empezando a ser entendido, se asumió que la desregulación de KIF4A está implicado en la progresión de los carcinomas epidermoides orales (OSCCs) a través de la activación del SAC [4,5,17 33,34]. Presentamos aquí que la expresión aberrante de KIF4A en OSCCs era funcional y clínicamente relacionado con el crecimiento tumoral y que KIF4A podría ser un marcador molecular para la progresión de la OSCCs.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
el Comité de ética de la Facultad de Medicina, Universidad de Chiba aprobó el protocolo del estudio (número de autorización, 236). El estudio se realizó de acuerdo con las normas éticas de la Declaración de Helsinki. consentimiento informado
líneas celulares derivadas de CCCA y muestras de tejido
líneas celulares derivadas de CCCA humanas inmortalizadas (HSC-2, HSC-3, 4-HSC, Ca9-22 Todos los pacientes dieron por escrito. , Sa 3, HO-1-u-1, y KON) se obtuvieron a partir de la investigación de la ciencia Banco de Recursos Humanos (Osaka, Japón) o el RIKEN BRC (Ibaraki, Japón) a través del Proyecto Nacional de Bio-Recursos del Ministerio de Educación, cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT) (Tokio, Japón). short tandem repetir per fi les confirmaron la identidad celular. Todas las células derivadas de CCCA se cultivaron en medio de Eagle modificado /F-12 HAM de Dulbecco (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Sigma) y 50 unidades /ml de penicilina y estreptomicina (Sigma). queratinocitos primarios humanos normales en cultivo orales (HNOKs) se utilizaron como control normal [35-40]. Eran muestras de epitelio de la mucosa oral sana recogidas de pacientes jóvenes en el Hospital de la Universidad de Chiba. Tres HNOKs independientes fueron cultivadas primaria y mantenido en Oral de queratinocitos Medio (Laboratorios de Investigación Sciencell, Carlsbad, CA) compuesto por 5 ml de suplemento de crecimiento de queratinocitos orales (Laboratorios de Investigación Sciencell) y 5 ml de solución de penicilina /estreptomicina (Laboratorios de Investigación Sciencell).
Ciento seis muestras primarias CCCA y el epitelio normal de pacientes emparejados se obtuvieron durante las cirugías realizadas en el Hospital de la Universidad de Chiba. Los tejidos resecados fueron fijadas en solución de formaldehído tamponado al 20% para el diagnóstico patológico e inmunohistoquímica (IHC). diagnóstico histopatológico de muestras de cada CCCA se realizó de acuerdo a los criterios de la Organización Mundial de la Salud por el Departamento de Patología del Hospital de la Universidad de Chiba [41]. estadificación clínico patológica se determinó mediante la clasificación TNM de la Unión Internacional contra el Cáncer [42]. Todos los pacientes tenían OSCC que fue confirmada histológicamente, y se comprobaron las muestras tumorales para asegurar que el tejido tumoral estaba presente en más de 80% de las muestras.
Preparación de cDNA y proteína
ARN total fue aislado usando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. Se generó ADNc usando 5 g de ARN total a partir de líneas celulares derivadas de CCCA utilizando Ready-To-Go Usted-Prime de la primera cadena de los granos (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) y oligo (dT) (Hokkaido Sistema de Ciencia, Sapporo, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato fría (PBS) y se centrifugó brevemente. Los sedimentos celulares se incubaron a 4 ° C durante 30 minutos en un tampón de lisis (7 M urea, tiourea 2 M, 4% w /v de CHAPS, y Tris 10 mM de pH 7,4) con un cóctel inhibidor de proteinasa (Roche, Diagnostics). La concentración de proteínas se midió con el kit de ensayo de proteína BCA (Thermo, Rockford, IL).
Análisis de la expresión del ARNm
Se llevó a cabo la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa en tiempo real (QRT-PCR) utilizando LightCycler 480 aparato (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). Los cebadores y sondas universales fueron diseñados utilizando la biblioteca de sondas universal (Roche Diagnostics), que especi fi ca el conjunto más adecuado. Las secuencias de los cebadores utilizados para QRT-PCR fueron:
KIF4A
, hacia adelante,
5'-TCTGTTTCAGGCTGCTTTCA -3 '
; revertir,
5'-GCCCTG AAATATTTGATTGGAG -3 '
; y la sonda universal de 25, y la deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH), hacia delante, España
5'-CATCTCTGCCCCCTCTGCTGA-3 '; revertir, España
5'-GGATGACCTTGCCCACAGCCT-3 '; y la sonda universal de 60. La cantidad de transcripción
KIF4A
se estimó a partir de las respectivas curvas estándar y normalizado a
cantidad de GAPDH transcripción
determinado de muestras correspondientes. Todas las muestras se analizaron por triplicado y tres preparaciones independientes de ARN se analizaron a partir de cada línea celular.
análisis de inmunotransferencia
Los extractos de proteína (20 mg) se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sodio en 4 gel -12%, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, y se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente en el bloqueo de uno (Nacalai Tesque, Tokio, Japón). Las membranas se incubaron con anticuerpo de conejo anti-KIF4A anticuerpo policlonal (gen Tex, San Antonio, TX), anticuerpo monoclonal de ratón anti-GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anticuerpo monoclonal anti-CDC20 ratón (Santa Cruz Biotechnology), y conejo anti-ciclina B1 anticuerpo policlonal (Tecnología de Señalización celular, Danvers, MA) durante la noche a 4 ° C. Las membranas se lavaron con 0,1% de Tween-20 en solución salina tamponada con Tris, se incubaron con anticuerpo secundario y acoplado a peroxidasa de rábano conjugada anti-conejo o anti-IgG de ratón (Promega, Madison, WI) durante 1 hora a temperatura ambiente. Por último, se detectaron las membranas usando sustrato SuperSignal West Pico quimioluminiscente (Thermo), y la inmunotransferencia se visualizó mediante exposición de las membranas a ATTO Light-Capture II (ATTO, Tokio, Japón). intensidad de la señal se cuantificaron utilizando el software 3.0 versión CS Analizador (ATTO).
La transfección con el plásmido shRNA
CCCA líneas celulares (HSC-3 y Ca9-22) fueron transfectadas con shRNA KIF4A (shKIF4A vectores) o el control shRNA (shMock) (Cruz de Biotecnología de Santa) utilizando Lipofectamina LTX y Reactivos Plus (Invitrogen). Después de la transfección, los transfectantes estables se aislaron por el medio de cultivo que contiene 2 ng /ml puromicina (Invitrogen). Dos a tres semanas después de la transfección, las colonias viables se transfirieron a nuevos platos. Se utilizaron células shKIF4A y shMock para experimentos adicionales.
inmunofluorescencia
Los transfectantes se sembraron en portaobjetos de cámara (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) a 50% de confluencia, se lavaron con PBS enfriado con hielo , y se fijaron con 4% de paraformaldehído-PBS durante 20 minutos, a continuación, permeabilizadas en PBS que contenía 0,2% de Triton X-100 como se describe anteriormente [43]. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios para detectar la activación del SAC: conejo anti-KIF4A anticuerpo policlonal (Gen Tex), ratón anti-BUB1 anticuerpo monoclonal (Santa Cruz de Biotecnología), y el ratón anticuerpo anti-MAD2 (Santa Cruz Biotechnology). Las células fijadas se incubaron con una solución de bloqueo que contiene 0,5% de albúmina de suero bovino durante 1 hora a temperatura ambiente y se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C. Después de enjuagar con PBS, las células se incubaron con anticuerpos secundarios durante 1 hora a 37 ° C. Los anticuerpos secundarios fueron anticuerpo IgG anti-conejo conjugado con isotiocianato de fluoresceína (Vector Laboratories, Burlingame, CA) y Texas-Red-conjugado anticuerpo IgG anti-ratón (Vector Laboratories) se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Por último, las secciones se lavaron tres veces con PBS y se montaron utilizando medio de montaje con DAPI (Vector Laboratories). La inmunofluorescencia se realizó mediante microscopía confocal y analizados con el software Fluoview (Olympus Optical, Tokio, Japón).
Cell-ciclo de análisis
Para sincronizar las células en la fase G0 /G1 o G2 /M transición, las células fueron privados de suero durante 48 horas o se trata con 200 ng /ml nocodazole (Sigma) durante 20 horas [44,45]. Para determinar la distribución del ciclo celular, las células se recogieron, se lavaron con PBS, y se sondaron con el kit de reactivo de ADN CycleTEST Plus (Becton-Dickinson, San Jose, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. determinación de citometría de flujo del contenido de ADN se analizó por BD AccuriTM C6 citómetro de flujo (Becton-Dickinson). Las fracciones de las células en el G0-G1, fases S y G2-M fueron analizados utilizando el software FlowJo (Árbol Star, Ashland, Oregón).
crecimiento celular
Los transfectantes se sembraron en placas de seis pocillos a una densidad de 1 × 10
4 células viables por pocillo. Las células se recogieron durante 168 horas, y se contaron cada 24 horas. En los puntos de tiempo indicados, las células se trataron con tripsina y se contaron usando un hemocitómetro en muestras por triplicado.
IHC
IHC se realizó en 4 micras secciones de muestras incluidas en parafina utilizando conejo anti-KIF4A anticuerpo policlonal (gen Tex). En pocas palabras, después de la desparafinación y la hidratación, la actividad de peroxidasa endógena se inactivó mediante 30 minutos de incubación en una mezcla de solución de peróxido de hidrógeno 0,3% en metanol al 100%; las secciones se bloquearon durante 2 horas a temperatura ambiente con 1,5% de suero de bloqueo (Santa Cruz Biotechnology) en PBS antes de reaccionar con el anticuerpo anti-KIF4A a 4 ° C en una cámara húmeda durante la noche. Tras la incubación con el anticuerpo primario, las muestras se lavaron tres veces en PBS y se trataron con reactivo Envision (DAKO, Carpinteria, CA) seguido por el desarrollo de color en tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina (DAKO). Los portaobjetos entonces fueron ligeramente contraste con hematoxilina, se deshidrataron con etanol, limpiadas con xileno, y se montaron. Unión no específica de un anticuerpo a las proteínas que no sean a veces se produjo el antígeno. Como control negativo, las secciones se inmunotiñeron triplicado sin exposición a anticuerpos primarios, que confirmó la especificidad de la tinción (Figura S1A). Para cuantificar el estado de expresión de la proteína KIF4A en esos componentes, se utilizaron los sistemas de puntuación de IHC descritas anteriormente [39,40,46-49]. En resumen, los porcentajes medios de células tumorales positivas se determinaron en al menos tres campos aleatorios a 400 × magnificación en cada sección. La intensidad de la KIF4A-inmunorreacción se puntuó como sigue: 0+, ninguno; 1+, débil; 2+, moderada; y 3+, intenso. El número celular y la intensidad de la tinción se multiplicaron para producir una puntuación KIF4A IHC. Se consideró que la intensidad de la tinción de las células del músculo esquelético, que eran controles positivos para KIF4A (Figura S1B). Los casos con una puntuación superior a 95,0 KIF4A IHC (3 desviación estándar [DE] puntuación para el tejido normal) se definieron como KIF4A-positivo. El corte de ± 3-SD, que estadísticamente se espera que sólo un 0,2% de la medida salga fuera de este rango, se utilizó porque era poco probable que sea afectada por el error experimental aleatorio producido por la manipulación de la muestra [50]. Dos patólogos independientes del Hospital de la Universidad de Chiba, ninguno de los cuales tenía ningún conocimiento del estado clínico de los pacientes, emitieron estas opiniones.
El análisis estadístico
En las comparaciones de los niveles de expresión KIF4A, se evaluó la significación estadística utilizando el test U de Mann-Whitney. Las relaciones entre las puntuaciones de tinción y perfiles clínico-KIF4A-inmunohistoquímica fueron evaluados por χ
2 prueba, la prueba exacta de Fisher, y la prueba de la U de Mann-Whitney.
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado significativo. Los datos se expresan como la media ± error estándar de la media (SEM).
Resultados
líneas celulares de Evaluación de la expresión KIF4A en COCE derivados de
Para investigar el ARNm expresión de
KIF4A
, se realizó un análisis de QRT-PCR utilizando siete líneas celulares derivadas de COCE (HSC-2, HSC-3, 4-HSC, Ca9-22, Sa3, Ho-1-u-1, y KON) y HNOKs.
KIF4A
mRNA fue significativamente hasta reguladas en todas las líneas celulares derivadas de CCCA en comparación con los HNOKs (Figura 1A). Los datos se expresan como la media ± SEM de los resultados por triplicado (
P Hotel & lt; 0,05). También se realizó el análisis de inmunotransferencia para investigar KIF4A estado de expresión de la proteína en las líneas celulares derivadas de CCCA y los HNOKs (Figura 1B). Se observó un aumento significativo en la expresión de la proteína KIF4A en todas las líneas celulares en comparación con el CCCA HNOKs. El análisis de expresión indica que ambos productos de transcripción y traducción de esta molécula fueron altamente expresado en líneas celulares derivadas de OSCC
.
(A) Cuantificación de la expresión mRNA KIF4A en líneas celulares derivadas de OSCC por análisis de QRT-PCR. Importantes sobre regulación de KIF4A ARNm se ve en siete líneas celulares derivadas de CCCA en comparación con los HNOKs (
P Hotel & lt; 0,05, Mann-Whitney U test). Los datos se expresan como la media ± SEM de los resultados por triplicado. (B) Análisis de inmunotransferencia de proteínas KIF4A en las líneas celulares derivadas y HNOKs-CCCA. expresión de la proteína KIF4A está regulado en las líneas celulares derivadas de CCCA comparación con la de los HNOKs. de datos de proteínas densitométrico KIF4A se normalizan a los niveles de proteína GAPDH. Los valores se expresan como un porcentaje de los HNOKs (
P Hotel & lt; 0,05, Mann-Whitney U test).
Establecimiento de células KIF4A desmontables
Desde KIF4A expresión es regulada hasta en las líneas celulares CCCA, establecimos desmontables células KIF4A utilizando tecnologías shRNA. células HSC-3 y se transfectaron con Ca9-22 KIF4A shRNA (shKIF4A) y el control shRNA (shMock) plásmidos. Los niveles de expresión de mRNA KIF4A y proteínas en las células shKIF4A fueron significativamente más bajos que los de las células shMock (HSC-3 y transfectantes derivados de Ca9-22) (Figura 2A, B) (
P
& lt; 0,05) .
(a) QRT-PCR muestra que la expresión KIF4A mRNA en las células transfectantes (shKIF4A-y HSC-3 derivados de Ca9-22; 2 clones cada uno) es significativamente menor que en las células shMock (
P Hotel & lt; 0,05, Mann-Whitney U test). (B) Análisis de inmunotransferencia muestra que los niveles de proteína en las células transfectadas KIF4A-shKIF4A (transfectantes derivados de Ca9-22 HSC-3 y; 2 clones cada uno) también han disminuido notablemente en comparación con la de las células shMock (
P
. & lt; 0,05, Mann-Whitney U test) guía empresas
la activación del SAC
para investigar el mecanismo por el cual KIF4A está relacionado con el SAC, se realizó el análisis de inmunofluorescencia para la proteína de huso puesto de control (BUB1) y la proteína sensor de punto de control (MAD2). BUB1 se encontró en cromosomas condensados en las células shKIF4A pero no se localizó en los cinetocoros en las células shMock (Figura 3A). MAD2 se localizó en los cinetocoros en las células shKIF4A, mientras que la localización cinetocoro no se observó en las células shMock (Figura 3B). El objetivo directo de la activación de SAC es CDC20, que es el activador del complejo /cyclosome anafase de la promoción (APC /C) [23-26]. Además, la ciclina B1 es un regulador crítico de la progresión G2 /M y la transición M-G1 [27]. Para evaluar la fase de la detención M por la activación del SAC, también se realizó la inmunotransferencia de CDC20 y ciclina B1, y el análisis de citometría de flujo. Como era de esperar, mientras CDC20 fue significativamente baja regulado, la ciclina B1 fue hasta reguladas en shKIF4A células (Figura 4A). Además, el porcentaje de la fase G2 /M en las células shKIF4A fue significativamente (P & lt; 0,05) más alta que la de las células shMock (Figura 4B). Estos resultados indican que la baja regulación de KIF4A podría inducir la detención del ciclo celular o el retraso en la fase M través de la activación SAC.
La localización de BUB1 y MAD2 a los cinetocoros se compara en células shKIF4A y shMock por inmunofluorescencia. (A) BUB1 en cinetocoros aumenta en las células shKIF4A comparación con la de las células shMock (verde, KIF4A; rojo, BUB1; azul, ADN). (B) la localización adecuada de los MAD2 se observó en las células shKIF4A, mientras que la localización cinetocoro no se ve en las células shMock. (Verde, KIF4A; rojo, MAD2; azul, ADN) guía empresas
Para investigar la activación SAC y la progresión del ciclo celular, se determinó los niveles de expresión de CDC20 y ciclina B1, y el contenido de ADN en el G0-G1, S, y, las fases G2-M. shKIF4A células (A) mostraron baja regulación de CDC20 y sobre regulación de la ciclina B1 (HSC-3 y derivados de Ca9-22 transfectantes, 2 clones cada uno) en comparación con las células shMock (
P Hotel & lt; 0,05 , Mann-Whitney U test). Se realizó un análisis de citometría de (B) de flujo para investigar el ciclo celular en células shKIF4A y shMock. El porcentaje de la fase G2 /M en las células shKIF4A (transfectantes derivados de Ca9-22 HSC-3 y; 2 clones cada uno) se ha incrementado notablemente en comparación con las células shMock (
P
& lt; 0,05, Mann-Whitney de prueba de la U).
Reducción del crecimiento celular en las células KIF4A desmontables
Para evaluar el efecto de KIF4A caída en el crecimiento celular, se realizó un ensayo de proliferación celular. shKIF4A células y shMock se sembraron en placas de seis pocillos a una densidad de 1 × 10
4 células viables /pocillo que fueron contados durante 168 horas. Hubo una disminución significativa (
P
& lt; 0,05). Disminución en el crecimiento celular de las células shKIF4A en comparación con las células shMock (Figura 5)
Para determinar el efecto de shKIF4A sobre la proliferación celular, shKIF4A células y shMock se sembraron en placas de seis pocillos a una densidad de 1 × 10
4 células viables /pocillo. Ambos transfectantes se contaron durante siete días consecutivos. El crecimiento celular de las células transfectadas con shKIF4A (HSC-3 y transfectantes derivados de Cas9-22; 2 clones cada uno) fueron significativamente inhibido en comparación con las células shMock después de 7 días (168 horas). Los resultados se expresaron como la media ± SEM de los valores a partir de tres ensayos. Los asteriscos indican diferencias significativas entre las células y shKIF4A shMock (
P Hotel & lt; 0,05, Mann-Whitney U test) guía empresas
Evaluación de la expresión de la proteína en KIF4A primaria CCCA
.
Los resultados representativos de IHC para la proteína KIF4A en el tejido oral normal y COCE primaria se muestran en la Figura 6A-C. La tinción positiva se observó predominantemente en los núcleos de las muestras CCCA primarios (Figura 6A, B). Las puntuaciones KIF4A IHC en OSCCs primarios (62.3-188, mediana, 131) fueron significativamente más altos que los de los tejidos normales (26.5-103; mediana, 66,5) (Figura 6C) (
P
& lt; 0,05). Definimos los casos con una puntuación superior a 95 IHC (puntuación 3 SD para el tejido normal) como KIF4A-positivo. Las correlaciones entre las características clínico-patológicas de los pacientes con COCE y el estado de expresión de la proteína KIF4A se muestran en la Tabla 1. Entre los parámetros clínicos, la expresión KIF4A se relacionó significativamente (
P Hotel & lt; 0,05) para el tamaño primaria de los tumores CCCA. Estos resultados sugieren que KIF4A podría estar relacionado de cerca a la progresión tumoral. Resultados
Representante de IHC para la proteína en el tejido normal KIF4A oral (A) y COCE primario (B). A, B: Original ampliación, × 400. Las barras de escala, 10 m. inmunorreactividad KIF4A fuerte se detectó en OSCCs primarias; tejidos orales normales muestran inmunotinción casi negativo. C: El estado de expresión de la proteína en KIF4A OSCCs primarios (n = 106) y las contrapartes normales. Las puntuaciones KIF4A IHC se calcularon de la siguiente manera: la puntuación de IHC = 0 x (número de células no teñidas en el campo) + 1 × (número de células débilmente teñidas en el campo) + 2 x (número de células moderadamente teñidas en el campo) + 3 × (número de células teñidas intensamente en el campo). Los KIF4A IHC resultados para los tejidos orales normales y OSCCs oscilaron desde 26,5 hasta 103 (media, 66,5) y 62,3 a 188 (mediana, 131), respectivamente. KIF4A niveles de expresión de proteínas en OSCCs son significativamente (
P Hotel & lt; 0,05, prueba de Mann-Whitney). Mayor que en los tejidos orales normales
Los resultados de la inmunotinción
clasificación clínica
No. pacientes (%)
total
KIF4A- negativo
KIF4A positivo
P
valor
a
edad en la cirugía (años) & lt; 603 914 (36) 25 (64) ≧ 60, & lt; 702 212 (55) 10 (45) 0,121
b
≧ 704 510 (22) 35 (78) Género Male7529 (39) 46 (52) 0,122
T19 c
female31 7 (23) 24 (77) T-5 del tumor primario (56) 4 (44) 0,005
d
T25825 (43) 33 (57) T319 3 (16) 16 (84) T420 3 (15) 17 (85) T1 + T26730 (45) 37 (55) 0.010
c
T3 + T439 6 (15) 33 (85) N-regional de ganglios linfáticos N (-) 4515 (33) 30 (67) 0.920
c
N (+) 6121 (34) 40 (66) etapa 5 I9 (56) 4 (44) 0,121
d
II3814 (37) 24 (63) III11 4 (36) 7 (64) IV4813 (27) 35 (73) de tipo histopatológico Well6123 ( 38) 38 (62) 0,352
d
Moderately3711 (30) 26 (70) Poorly8 2 (25) 6 (75) sitio tumoral Gingiva32 9 (38) 23 (63) 0.861
d
Tongue6527 (42) 38 (58) bucal mucosa6 0 (0) 6 (100) Base 3 Oral 0 (0) 3 (100) Tabla 1. Correlación entre la expresión KIF4A y clasificación clínica en OSCCs.
a
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado significativo,
b
χ
2 test,
c
prueba exacta de Fisher,
d
prueba de la U de Mann-Whitney. Descargar CSV CSV
Discusión
Desde KIF4A se sobreexpresa frecuentemente en líneas celulares derivadas de COCE, establecimos células KIF4A desmontables para ver si es o no KIF4A tiene funciones críticas en OSCCs. shKIF4A células mostraron una disminución del crecimiento celular mediante la activación de salida que conduce a la detención del ciclo celular de la fase M. Además de la
in vitro
de datos, también se encontró que era KIF4A hasta reguladas en muestras clínicas CCCA en comparación con los tejidos normales y que los casos de COCE KIF4A-positivos fueron estrechamente relacionados con el tamaño tumoral. Estos resultados indicaron que KIF4A está vinculada a la regulación del ciclo celular en la fase M y juega un papel importante en la progresión tumoral en OSCCs.
Muchos estudios han indicado que KIFs desempeñan papeles críticos, incluyendo el desarrollo tumoral y la progresión, en los cánceres [12-14,31,32]. Entre ellos, KIF2C, KIF18A, KIF20A, y KIF20B fueron reguladas en varios tumores malignos y se asocia con la progresión tumoral [51-56]. Por el contrario, KIF1A se había reducido regulado en el carcinoma nasofaríngeo y se presenta como un potencial supresor tumoral [57]. KIF4A se sobreexpresa en los cánceres de cuello uterino y de pulmón [58,59], mientras que KIF4A se había reducido regulado en el cáncer gástrico [60]. Además de los datos actuales que KIF4A fue significativamente hasta reguladas en OSCCs, Castillo et al. informó de que la sobreexpresión de algunos kinesins de motor, incluyendo KIF4A, que generan fuerzas externas adicionales durante la mitosis, induce la separación husillo excesiva que conduce a una distribución desigual de material genético en la anafase y, finalmente, el desarrollo de células hijas afectadas por aneuploidía [61]. Por el contrario, varios estudios han informado de que la pérdida de KIF4A podría afectar a la proliferación tumoral y la carcinogénesis [34,62]. Debido a resultados contradictorios como estos, se necesitan más estudios para comprender mejor las complejas funciones KIF4A desempeña en el desarrollo y progresión del cáncer.
Los nuevos hallazgos del presente estudio son la correlación entre KIF4A caída o una perturbación de la mitosis resultante de la activación SAC. La ruta de activación del SAC está estrechamente controlada por control de las proteínas del huso, como BUB1 y MAD2 [17-22]. En respuesta a la unión apropiada de los cromosomas al husillo microtúbulos, que causan la división celular anormal, BUB1 se concentra en los cinetocoros en células mitóticas y ayuda a localizar MAD2 en cinetocoros [62-64]. MAD2 Activado localizado correctamente en los cinetocoros puede inhibir CDC20, que activa la ubiquitina ligasa conocido como APC /C [65-67]. Por lo tanto, esta evidencia indica que KIF4A caída podría causar la activación SAC a través de APC /C inactivación [23-27].
Hemos encontrado que se observaron altos niveles de ciclina B1 y detención en la fase M en las células KIF4A desmontables. Durante la inducción de la detención en la fase G2 /M después del tratamiento de células con inhibidores de microtúbulos que activan el SAC al interferir con la dinámica de los microtúbulos y la estabilidad, tales como nocodazol y paclitaxel, un marcado incremento en los niveles de proteína ciclina B1 también se observó [65-69]. Por lo tanto, la baja regulación de KIF4A induce la detención del ciclo celular de las células CCCA por funciones similares de los inhibidores de microtúbulos
proteínas KIF4A niveles de expresión en OSCCs primarias se correlacionaron con el tamaño tumoral.; esto implica firmemente que KIF4A puede jugar un papel importante en la progresión y el desarrollo OSCCs. En su conjunto, la estratificación de los pacientes con COCE basadas en el estado KIF4A puede proporcionar un enfoque más personalizado a la terapia del cáncer oral humana.
Conclusión
Los resultados mostraron actuales para el tiempo primero que se sobreexpresa frecuentemente KIF4A en OSCC, lo que sugiere interferencia en la función de las proteínas de control de huso como BUB1, MAD2, y CDC20. expresión KIF4A se correlacionó con el tamaño tumoral en los casos KIF4A-positivos, lo que sugiere que la activación SAC juega un papel importante en la proliferación celular en OSCC. KIF4A expresión es probable que sea un regulador clave de la progresión tumoral en OSCCs.
Apoyo a la Información
Figura S1. inmunológica
KIF4A en los controles negativos y positivos. Para evaluar la especificidad de anticuerpo KIF4A, se analizó la intensidad de la tinción de los controles negativos y positivos. Aumento original, × 400. Las barras de escala, 10 m. (A) Como control negativo, las muestras CCCA primarios se inmunotiñeron sin exposición a anticuerpos primarios. No hubo células teñidas. (B) tejido de músculo esquelético es un control positivo para KIF4A. inmunorreactividad KIF4A fuerte se detectó específicamente en el núcleo de las células.
doi:. 10.1371 /journal.pone.0085951.s001 gratis (TIF)
Reconocimientos
gracias a la Sra Lynda C. Cartas de Médico Internacional para la edición de este manuscrito