Extracto
La hipoxia-inducible factor 1 (HIF-1) y su más importante subunidad, HIF-1α, juega un papel central en la progresión tumoral mediante la regulación de genes implicados en la supervivencia de células de cáncer, la proliferación y la metástasis. la actividad de HIF-1α se asocia con la acumulación nuclear del factor de transcripción y regulada por varios mecanismos incluyendo la modulación de la estabilidad de la proteína y la degradación. Entre los avances recientes son los descubrimientos de que las citoquinas inducidos por la inflamación y factores de crecimiento afectan a la acumulación de proteína de HIF-1α en condiciones de normoxia. TNF, una citoquina proinflamatoria importante que promueve la tumorigénesis es conocido como un estimulador de la actividad de HIF-1α. Para mejorar nuestra comprensión de la regulación de TNF mediada por la acumulación nuclear de HIF-1α que exhibió una biblioteca siRNA-quinasa específica utilizando un ensayo indicador quimera HIF-1α-eGFP a base de imágenes de células. Curiosamente, este análisis sistemático determinado que el agotamiento de quinasas implicadas en la señalización de TNF convencional (IKK /NFkB y las vías de JNK) no tiene ningún efecto perjudicial sobre la acumulación de HIF-1α. Por otro lado, el agotamiento de PRKAR2B, ADCK2, TRPM7, y Trib2 disminuye significativamente el efecto de TNF sobre la estabilidad de HIF-1α en líneas celulares de cáncer de osteosarcoma y de próstata. Estos reguladores recién descubiertos transmitieron su actividad a través de una NFkB dependido-RELB vía no convencional y la regulación de la actividad superóxido señalización. Tomados en conjunto nuestros datos nos permiten concluir que el TNFa utiliza un mecanismo de señalización distinta y compleja para inducir la acumulación de HIF-1α en las células cancerosas. En resumen, nuestros resultados iluminan un nuevo mecanismo a través del cual la iniciación y progresión del cáncer pueden ser promovidos por las citoquinas inflamatorias, destacando nuevas vías potenciales para la lucha contra esta enfermedad
Visto:. Schoolmeesters A, Brown DD, Fedorov Y (2012) kinome-ancha Genómica funcional de la pantalla revela un nuevo mecanismo de TNFa inducida por la acumulación nuclear del factor de transcripción HIF-1α en las células cancerosas. PLoS ONE 7 (2): e31270. doi: 10.1371 /journal.pone.0031270
Editor: Ying Xu, de la Universidad de Georgia, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Septiembre, 2011; Aceptado: January 5, 2012; Publicado: 15 Febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Schoolmeesters et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por Thermo Fisher Scientific. No hay fuentes externas de financiación actuales para este estudio
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y tienen el siguiente interés en competencia: Todos los autores son empleados por Thermo Fisher Scientific. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores de todos los PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
La inflamación es un proceso principal defensa contra varios extracelular estímulos, tales como virus, patógenos, los alimentos y los contaminantes ambientales. Varios estudios han demostrado que la tumorigénesis en muchos tipos de cáncer está estrechamente asociado con la inflamación crónica. alteraciones celulares anormales que acompañan a la inflamación crónica, tales como el estrés oxidativo, la mutación de genes, cambio epigenético, y liberación de citoquinas inflamatorias se comparten con los procesos carcinógenos, que forman una reticulación crítica entre la inflamación crónica y la carcinogénesis. Casi el 25% de los cánceres se informó de que se produzca a través de procesos crónicos relacionados con la inflamación [1], [2]. Los reguladores pro-inflamatorias tales como sus redes de receptores TNF y otras citocinas y parecen desempeñar funciones cruciales en la tumorigénesis [3].
La hipoxia-inducible factor 1 (HIF-1) y su subunidad más importante, HIF -1α, desempeña un papel central en la progresión tumoral mediante la regulación de genes implicados en la supervivencia de células de cáncer, la proliferación y la metástasis [4]. HIF-1 es un componente principal del sistema de sensores de oxígeno que regula las respuestas celulares a la disminución de la disponibilidad de oxígeno. La hipoxia factor de transcripción inducible HIF-1 es un heterodímero compuesto de la hélice-bucle-hélice-Per-Arnt-Sim (bHLH-PAS) las proteínas HIF-1α y translocador nuclear de aril hidrocarburos (ARNT) también conocido como HIF-1β. Transactivación de HIF-1 transmite una señal hipóxica en una multitud de respuestas fisiopatológicas de regulación de numerosos genes diana [4], [5].
Además de la hipoxia, la evidencia más reciente sugiere que HIF-1 puede ser acumulada y activado durante normoxia por factores de crecimiento, citoquinas y otros factores asociados con la inflamación [5]. Varios informes han indicado un papel importante en la regulación de TNF de la estabilidad y la actividad de HIF-1α [6] - [8]. Sin embargo, los detalles de la regulación de HIF-1 por TNFa siguen sin estar claros.
A continuación, se describen los mecanismos que incitan a la acumulación de HIF-1α en respuesta a TNF señalización. Para mejorar nuestra comprensión de HIF-1 regulación por parte de la citoquina, que exhibió una biblioteca-quinasa específica pequeños ARN de interferencia (siRNA) usando un ensayo de indicador quimera HIF-1α-eGFP bajo tratamiento TNFa. En esta pantalla se determinó que el agotamiento de los
ADCK2
,
PRKAR2B
,
Trib2
y
TRPM7
regula a la baja más significativa acumulación nuclear de HIF-1α en respuesta a la tratamiento de células de osteosarcoma. Además, nuestros resultados sugieren que esta vía también está presente en células de cáncer de próstata. Sorprendentemente, el mecanismo de regulación de la acumulación de HIF-1α TNF-suscitó se asoció con una vía de señalización NFkB no convencional y el alivio de la actividad superóxido. Tomados en conjunto nuestros datos nos permiten concluir que el TNFa utiliza un mecanismo de señalización distinta y compleja para inducir la acumulación de HIF-1α.
Resultados
TNF es una citoquina inflamatoria importante notificado a ser un potente inductor acumulación nuclear de HIF-1α [5] - [8]. Se examinaron varias líneas celulares de cáncer para la acumulación de HIF-1α en tratamiento TNFa. En nuestros experimentos, TNF produjo un aumento significativo en la acumulación nuclear de HIF-1α en varios cancelar líneas celulares (Fig. 1a). Del mismo modo, TNF induce la acumulación nuclear de una proteína HIF-1α-eGFP quimera (Fig. S1a, Fig. 1b, c) en el ensayo de Redistribución HIF-1α_U2OS basado en una línea celular de osteosarcoma. El efecto observado fue de la concentración y dependiente del tiempo (Fig. 1b, c). 24 horas de incubación con TNF a 10 ng /ml fue seleccionado para todos los experimentos de detección para proporcionar una ventana adecuada para estudiar arriba y abajo de la regulación de la acumulación de HIF-1α.
(A) TNFa induce la acumulación nuclear de HIF -1α en LNCaP, DU145, MCF10A y líneas de células cancerosas MDA MB231. Expresión y acumulación nuclear de HIF-1α se determinó por inmunocitoquímica de formación de imágenes como se describe en Materiales y Métodos. (B) la estimulación TNF inducida de la acumulación nuclear HIF-1α-eGFP en U2OS osteosarcoma de una manera dependiente de la concentración. (C) TNFa estimula la acumulación nuclear HIF-1α-eGFP en células U2OS en una manera dependiente del tiempo. Todos los datos (Mediana +/- MAD) normalizaron a las células no tratadas. Para cada panel, los datos son representativos de dos experimentos independientes realizados por triplicado *, **:. T-test p-valor de Student entre las células tratadas y grupo de control correspondiente, * - p & lt; 0,01, ** - P & lt; 0,05
Hay dos receptores descritos para TNF, es decir, receptor de TNF 1 (TNFR1, receptor p55) y TNF receptor 2 (TNFR2, receptor p75). TNFR1 se expresa de forma ubicua, mientras que TNFR2 se expresa principalmente en células del sistema inmune [9]. Aunque ambos receptores se unen TNF, el principal receptor de la mediación de los efectos celulares en la mayoría de tipos de células es TNFR1. En nuestros experimentos, desmontables de la TNFR1 disminuye efectivamente la acumulación nuclear TNFa dependiente de HIF-1α (Fig S1b). TNF es conocida por activar múltiples vías aguas abajo de TNFR1 [9]. Para explorar el papel de las quinasas en la regulación de la acumulación de HIF-1α en tratamiento TNFa, que agotados quinasas en células HIF-1α-U2OS utilizando una biblioteca de siRNA quinasa de orientación 788 quinasas y después se analizó la acumulación celular de HIF-1α-eGFP tras la incubación con TNF ( Fig. 2a). Para reducir al mínimo la actividad siRNA fuera del objetivo se utilizó en-blanco
más
versión de la colección de quinasas humana de SMART
animales
reactivos siRNA [10]. La misma biblioteca quinasa se proyectó en una línea celular de control que sólo expresa eGFP restar posibles efectos no específicos. los datos de detección de HIF-1α-EGFP fueron sometidos a la prueba t-Student análisis p-valor, Benjamini-Hochberg corrección de comparaciones múltiples [11], y el ranking de desempeño, seguido de la comparación entre dos experimentos independientes de detección con un umbral de cambio de 1,5 veces. datos resultantes se comparó además con los datos del contador de pantalla con las células que expresan eGFP única (1,2 veces el cambio de umbral para EGFP solamente, la figura S2) y la superposición de los accesos despedidos. Entre los 788 quinasas seleccionados por siRNA mediada por silenciamiento, el agotamiento de los 77 genes incrementa la acumulación de HIF-1α-eGFP por encima de 2 veces (Tabla S1) y el agotamiento de otros siete genes diana disminución de la acumulación bajo tratamiento TNF (Fig. 2a). Los genes que demuestran una disminución mediada por siRNA de la acumulación de HIF-1α eran de particular interés debido a que estos potencialmente podrían representar miembros de TNFa vías de señalización. Estos incluyen
PRKAR2B, ADCK2, TRPM7, RIOK2, TRIO, ADRA1B y Trib2
. Para confirmar que la disminución en la acumulación de HIF-1α TNFa inducida en las células siRNA transfectadas estaba directamente relacionado con el agotamiento de los objetivos seleccionados se repitió este experimento utilizando piscinas siRNA de nueva síntesis (Fig. 2b). Sólo uno de cada siete candidatos seleccionados de golpe no se confirmó:. SiRNA dirigidos a
ADRA1B gratis (datos no mostrados), que fue omitido posteriormente de un análisis más
(A) Los datos representativos de un conjunto kinome de ancho de pantalla de 788 siRNAs. Los datos (Mediana +/- MAD) son representativos de tres transfecciones individuales y están normalizados para el control de siRNA. (B) seleccionada siRNA golpeado candidatos fueron probadas en experimentos separados. siRNAs dirigidos
ADCK2, RIOK2, PRKAR2B, Trib2, TRIO y TRPM7
fueron confirmados como candidatos de golpe y se sometió a un análisis más detallado. Todos los datos se normalizaron a las células transfectadas con ARNsi de control NTC1. (C) Efecto de siRNA seleccionado golpeado candidatos sobre la acumulación de HIF-1α en la línea celular de cáncer de próstata LNCaP. Datos (mediana de +/- MAD) son representativos de tres experimentos independientes realizados por triplicado. Todos los datos se normalizaron a las células tratadas con TNF. *, **:.-Test de la t de p-valor de Student entre las células tratadas y correspondiente grupo de control, * - P & lt; 0,01, ** - P & lt; 0,05
Un enfoque de análisis de contenidos de alta permite la adquisición simultánea de múltiples flujos de datos desde el mismo conjunto de muestras. Hemos utilizado este enfoque para analizar más a fondo los datos del cribado. Los datos recogidos (número de células por campo) sugirieron que ninguno de los siRNAs seleccionados (
PRKAR2B, ADCK2, TRPM7, RIOK2, TRIO, y Trib2)
produjo ningún efecto sobre la viabilidad celular (Figura S3). Además del control de la estabilidad de la proteína, la función de HIF-1α puede ser regulada por los procesos que influyen en su localización subcelular, por ejemplo citoplasmática vs. nuclear. La medición simultánea de la acumulación de HIF-1α en los núcleos y citoplasma reveló que ninguno de los objetivos de siRNA seleccionados para una disminución en la acumulación nuclear produjo un aumento en la retención citoplásmica de HIF-1α (datos no mostrados).
Para examinar si accesos candidatos seleccionados pueden influir en la acumulación de TNF mediada por HIF-1α en otros tipos de células se determinó la acumulación nuclear HIF-1α en líneas celulares de cáncer de próstata. se encontró acumulación de HIF-1α en células LNCaP y DU145 a ser sensibles a TNF mientras PC3, una línea celular de próstata con significativo potencial invasivo [12], no demostró tal sensibilidad (Fig. 1a,). El agotamiento de los
PRKAR2B
,
ADCK2
,
TRPM7
y
Trib2 de
disminuyó significativamente la acumulación de HIF-1α en LNCaP, una célula de adenocarcinoma de próstata humano sensible a andrógenos consonancia con bajo potencial invasivo (Fig. 2c). Datos similares a U2OS y LNCaP También se obtuvieron a partir MCF10A, un no tumorigénicos mamaria línea de células epiteliales (Fig S4a). En las células DU145, una línea celular de cáncer de próstata con potencial invasivo moderado, solamente
Trib2
agotamiento fue eficaz en la derogación de la acumulación de HIF-1α TNFa inducida (Fig S4b). Con base en los resultados anteriores
PRKAR2B, ADCK2, TRPM7 y Trib2
fueron seleccionados para su posterior análisis. piscinas siRNA dirigidos a estos genes producen efectos dependientes de la concentración sobre la acumulación de TNF estimulada por HIF-1α en células de osteosarcoma U2OS (Fig. 3a)
(A) siRNAs seleccionados disminuyen la acumulación de HIF-1α TNF mediada en un dependiente de la concentración maner. (B) piscinas siRNA y las moléculas de siRNA individuales producidos efectos comparables sobre la acumulación de HIF-1α. (C) piscinas siRNA y las moléculas de siRNA individuales para los candidatos seleccionados de golpe proporcionan el agotamiento gen diana eficaz. células U2OS se incubaron con TNF de 24 hr. Todos los datos se normalizaron a las células transfectadas con ARNsi de control NTC1. Los datos son representativos de dos experimentos independientes, tres (A, B, mediana +/- MAD) o dos (C, media +/- DESVEST) transfecciones individuales cada uno.
En todos nuestros experimentos que emplean estrategias que son conocidos para disminuir siRNA fuera de objetivo efectos: aplicación de las moléculas de siRNA modificados químicamente y el uso de una estrategia de mezcla de siRNA. Para confirmar aún más que la disminución en la acumulación de HIF-1α TNFa inducida en las células siRNA transfectadas estaba directamente relacionada con los efectos sobre la diana de la siRNA, repetimos este experimento utilizando piscinas siRNA recién sintetizadas y cuatro dúplex de siRNA separados (que componen cada piscina ) para agotar los cuatro objetivos celulares. Estos experimentos produjeron resultados similares a los datos de detección - para las cuatro piscinas objetivos siRNA y cuatro dúplex de siRNA individuales producido disminución significativa en la acumulación de HIF-1α (& gt; 2 veces, Fig. 3b). Eficacia de la meta gen desmontables para los golpes siRNA seleccionados se determinó usando sondas Q-PCR y Solaris. agotamiento del gen diana se correlaciona con el ensayo fenotípico HIF-1α - para las cuatro piscinas objetivos siRNA usadas en la campaña de cribado y cuatro dúplex de siRNA individuales demostraron potente desmontables (& gt; 60%, figura 3c.). TRPM7 está pobremente expresado en células U2OS y la aplicación de cualquier reactivo RNAi eliminado efectivamente la expresión de este objetivo a un nivel indetectable (Fig. 3c).
TNFa es conocido para regular la expresión de las proteínas dentro de sus propias cascadas de señalización. Hemos encontrado que la expresión de ADCK2 y Trib2 ARNm está regulada por TNFa en células de cáncer U2OS (Figura S5). Estadísticamente no se detectaron cambios significativos para PRKAR2B y TRPM7.
Informes recientes indican que la estabilidad y la actividad de HIF-1α pueden ser reguladas a través de vías sensibles al estrés oxidativo [6], [13], [14]. Tales vías son también reguladores de TNF conocidos de señalización [6], [15]. Para examinar un posible papel de los mecanismos de estrés oxidativo en la acumulación de HIF-1α TNF estimulada se investigaron los efectos de peróxido de hidrógeno exógeno. Si bien el peróxido de hidrógeno solo produjo un aumento significativo en la acumulación de HIF-1α, se observó un efecto opuesto en las células TNF-pretratado (Fig. 4a). Este resultado sugiere una posible regulación negativa de la acumulación de HIF-1α por dismutasa, la principal fuente de peróxido intracelular [16]. La hipótesis de que los reguladores positivos recién descubiertos de la acumulación de HIF-1α pueden controlar bien la producción de superóxido o una conversión de peróxido. En las células U2OS, TNFa aumentó fuertemente la expresión de MnSOD, una de las principales enzimas de conversión de superóxido /peróxido (Fig S6). Sin embargo, el agotamiento de los reguladores positivos identificados de la acumulación de HIF-1α no tuvo ningún efecto sobre la expresión de MnSOD (Fig S6).
(A) Mientras que la adición de peróxido de hidrógeno (100 mu M, 3 hr de incubación) puede estimular HIF acumulación -1α, disminuye dicha acumulación en las células TNF-tratado (21 h de incubación con TNF solamente seguido de 3 horas de incubación en presencia de tanto TNF y peróxido de hidrógeno). Datos (mediana de +/- MAD) normalizado a las células transfectadas con ARNsi de control NTC1 y tratados con DMSO. (B) El superóxido carroñeros de rescate acumulación de HIF-1α en las células transfectadas con siRNAs dirigidos
ADCK2
y
Trib2
pero no
PRKAR2B
o
TRPM7
. Las células se trataron con TNF similar a (A) y se incubaron con Tiron (0,3 mM), 4-hidroxi-TEMPO (0,1 mM) o DMSO (control vehículo) durante 3 h. Datos (mediana de +/- MAD) normalizado a las células transfectadas con ARNsi de control NTC1 y tratados con DMSO. Para cada panel de datos son representativos de dos experimentos independientes realizados por cuadruplicado. *, **:.-Test de la t de p-valor de Student entre las células tratadas y correspondiente grupo de control, * - p & lt; 0,01, ** - P & lt; 0,05
Hemos observado que los basureros superóxido Tiron y TEMPOL son capaces de rescatar la acumulación de HIF-1α en las células TNF-tratada transfectadas con siRNA contra ADCK2, y Trib2 cuando se aplica en una concentración que no afecta significativamente las células de control (Fig. 4b). Las células transfectadas con siRNA PRKAR2B y TRPM7 no se vieron afectados por los carroñeros superóxido (Fig. 4B). Tomados en conjunto nuestros datos sugieren que TNF media la acumulación de HIF-1α través de un mecanismo que mitiga la producción de superóxido, y ADCK2, PRKAR2B y Trib2 son reguladores positivos de este mecanismo.
múltiples vías y los factores son reportados como reguladores de HIF actividad 1α en otros sistemas y condiciones experimentales, incluyendo NFkB convencional, JNK, STAT3, y la actividad del proteasoma [5]. Además, TNFa se sabe que inducen la señalización a través de la vía NFkB convencional [9], [17]. El análisis de los resultados reveló que el agotamiento de las quinasas que son necesarios para estas vías no produjeron ningún efecto negativo sobre la acumulación de HIF-1α TNF-mediada. En nuestros experimentos, TNFa produjo ningún efecto significativo sobre la vía STAT3-dependiente (Fig S7a). La hipótesis de que debido a TNF induce la acumulación de HIF-1α, sino que también puede inhibir la actividad del proteasoma. Con este fin hemos probado TNFa como un posible agonista en el U2OS_E6-AP: La degradación de p53 y U2OS_SCF-Skp2 E3: ensayos de redistribución de degradación de p27. acumulación inducida por inhibidor de la actividad del proteasoma MG132 de quimeras de eGFP en ambos ensayos, mientras que la incubación con TNF no tuvo ningún efecto (Fig S7b, c).
Los datos de nuestros experimentos de cribado sugiere que el agotamiento de los reguladores aguas arriba de los resultados vía de JNK en una aumento de la acumulación de HIF-1α en respuesta al tratamiento TNFa (Tabla S1). El agotamiento de los reguladores de aguas arriba de la vía NFkB convencional
Chuk, IKBKB o IKBKE
no modulan la acumulación de HIF-1α en respuesta al tratamiento TNF (Fig S8). Además, el agotamiento mediada por siRNA reveló que las proteínas NFkB RELA y NFκB2 pueden actuar como reguladores negativos de dicha acumulación debido a que su caída produjo fuerte aumento en la acumulación de HIF-1α (Fig. 5a). En contraste, las proteínas NFkB RELB, CREL y NFκB1 parecen ser necesarias para la acumulación de HIF-1α TNFa inducida porque el agotamiento de los genes producidos fuertes efectos negativos sobre la acumulación (Fig. 5a) correspondiente. La activación de proteínas NFkB se correlaciona con su translocación intracelular [17]. Se encontró que en células de osteosarcoma U2OS, TNFa estimula la translocación de RELB y crel entre el núcleo y el citoplasma, con RELB ser excluido del núcleo y crel acumulación en el núcleo. Al igual que en el agotamiento de TNFR1, el agotamiento de Trib2 y TRPM7 evitarse la exclusión nuclear de RELB (Fig. 5b). crel translocación no se vio afectada por el agotamiento de los objetivos seleccionados (datos no mostrados). Además, el efecto del agotamiento del RELB fue atenuada por eliminadores de superóxido Tiron y TEMPOL (Fig. 5c). Tomados en conjunto nuestros resultados sugieren que la acumulación de HIF-1α mediada por TNFa puede ser al menos parcialmente gobernado por una vía de señalización de NFkB no convencional activado por Trib2 y TRPM7.
(A) El agotamiento de NFκB1, RELB y crel pero no NFκB2 y RELA interfieren con la acumulación de HIF-1α en las células TNF-tratada. (B) El agotamiento de ADCK2 y PRKAR2B previene la acumulación de RELB en los núcleos de las células TNF-tratada. (C) Efecto del agotamiento de RELB es rescatado por los carroñeros ROS. Las células se trataron similar a la Fig. 4C. (D) Todos los datos (Mediana +/- MAD) se normaliza a las células transfectadas con ARNsi de control NTC1 tratados con TNF (10 ng /ml, 24 h). Los datos son representativos de dos experimentos independientes realizados por triplicado. *, **:.-Test de la t de p-valor de Student entre las células tratadas y correspondiente grupo de control, * - p & lt; 0,01, ** - P & lt; 0,05
Discusión
TNFa es bien conocido para evocar múltiples mecanismos de señalización en diversas quinasas juegan un papel irreemplazable. Los recientes avances en genómica funcional y técnicas de imagen celular nos permitió realizar una investigación sistemática de los posibles mecanismos de acumulación de HIF-1α TNF-mediada. Para explorar el papel de las quinasas en la regulación de HIF-1 actividad bajo tratamiento con TNF-α, que agotados quinasas en células de osteosarcoma U2OS utilizando una biblioteca quinasa siRNA modificados químicamente de focalización 778 quinasas y después se analizó la acumulación nuclear de HIF-1α-eGFP quimera expresada constitutivamente en estas células. En este ensayo, TNFa aumentó fuertemente HIF-1α-eGFP acumulación de proteína (Fig. 1b, c).
En condiciones fisiológicas normales la acumulación de HIF-1α está fuertemente reprimida por varias vías de regulación. Quinasas y proteínas relacionadas son bien conocidos por jugar un papel importante en tales vías. Por lo tanto, se esperaba que la mayoría de los candidatos siRNA golpeado proporcionarían una liberación de la represión de la acumulación de HIF-1α. De hecho, entre los 788 quinasas apantallados por siRNA mediada por silenciamiento, el agotamiento de 6 quinasas disminuyó significativamente la acumulación de HIF-1α y el agotamiento de otros 89 quinasas aumento de la actividad de HIF-1 en las células tratadas con TNF (Fig. 2a, b y en la Tabla S1).
Hasta cierto punto, nuestros datos recapitula hallazgos previos sobre los reguladores negativos de la actividad de HIF-1α [18]. Se informó de que SMG-1 suprime la actividad de HIF-1 en condiciones de hipoxia y que el agotamiento de siRNA mediada por el producto del gen aumenta significativamente la actividad de un reportero de HIF-1α sensible a [18]. Los resultados de nuestros experimentos de selección indican que el agotamiento de SMG-1 específicamente hasta regula TNF inducida por HIF-1α de acumulación (datos no mostrados).
Se encontraron varias vías a ser significativamente representado en off en el grupo de los 77 reguladores negativos: 16 genes representa GO: 0007049 ciclo celular (
NEK4
,
TAF1L
,
CKS2
,
TTK
,
MAP3K8
,
PIM2
,
TLK1
,
PPP2CA
,
NEK9
,
PRKAG1
,
Nek6
,
PLK4
,
DGKZ
,
dusp1
,
PIM1
,
PRKAA2
), 11 genes representa GO: 0000165 cascada de señalización MAPKKK (
PPP2CA
,
RPS6KA3
,
DUSP5
,
MAPKAPK3
,
MAPK8IP3
,
MAP4K5
,
DUSP2
,
MAPK11
,
MAP4K1
,
dusp1
,
MAP3K9
), y cuatro quinasas representan GO: 0007254 sistema de cascada de JNK (
MAP4K1
,
MAP4K5
,
MAPK8IP3
,
MAP3K9
) (Tabla S1). Estos datos sugieren que tales vías pueden oponerse a la señalización de TNF e inhibir la acumulación de HIF-1α.
El agotamiento de varios genes diana inhibir la acumulación de HIF-1α TNFa mediada (Fig. 2). Estos genes pueden representar uno o más mecanismos de señalización de TNF, y son de particular interés. En nuestra campaña de detección se identificaron seis objetivos de este tipo (Fig. 2b). Por otra parte, nuestros resultados sugieren que cuatro de estos genes -
ADCK2
,
PRKAR2B
,
Trib2
y
TRPM7 CD - parecen regular la acumulación de HIF-1α en múltiples líneas celulares de cáncer (Fig. 2, Fig S4). Los cuatro genes fueron descritas anteriormente en relación con la regulación de la proliferación de células cancerosas y la motilidad pero los datos existentes no sugieren su participación en TNFa señalización [19] - [23]. Las funciones de
ADCK2
proteínas aún no están claras. No se sabe si tiene la actividad de la proteína quinasa y qué tipo de sustrato que sería fosforilar. Varios informes establecen una conexión de
ADCK2
a la proliferación de células cancerosas y la motilidad [20].
PRKAR2B
codifica el AMPc dependiente de la proteína quinasa tipo subunidad reguladora II-beta. La proteína quinasa dependiente de cAMP A (PKA) es una ubicua serina /treonina proteína quinasa. PKA se acepta como un importante mediador de las señales intracelulares de AMPc en las células eucariotas. Hasta la fecha, se ha informado de un gran número de unos sustratos de PKA nucleares y citoplasmáticas A [23]. Curiosamente, el agotamiento de los
PRKAA1 gratis (la subunidad catalítica de la PKA) también produjo una disminución en la acumulación de HIF-1α, aunque en un grado menor que
PRKAR2B
agotamiento (datos no mostrados). son necesarios para clarificar el papel exacto de la PKA en la acumulación de HIF-1α TNF estimulada por otros estudios. Aunque la función molecular de Trib2 (Tribbles homólogo 2) todavía no está claro, se ha identificado como un posible motor de la tumorigénesis de pulmón y un oncogén mieloide [21], [22]. TRPM7 es un canal de catión divalente ubicuamente expresado y constitutivamente activo. Proporciona un mecanismo para la entrada de Mg2 + y por lo tanto es esencial para la supervivencia y la proliferación [19] celular, [24]
reguladores clave de TNFa vías de señalización son las especies de oxígeno reactivo (ROS;.
por ejemplo,
., superóxido, peróxido de hidrógeno, y el radical hidroxilo) [6], [15]. ROS se han sugerido para modular la señalización de TNF, proporcionando la regulación tanto positiva como negativa del sistema de NFkB aguas abajo de TNFR1 en función del sistema y de las condiciones experimentales [6], [25]. Nuestros resultados implican que el peróxido de hidrógeno suprime la acumulación de HIF-1α TNFa mediada (Fig. 4a). Estos datos sugieren que la fuente de peróxido de hidrógeno intracelular, el anión superóxido puede inhibir la acumulación de HIF-1α TNFa mediada también. La hipótesis de que los reguladores recientemente descritas de la acumulación pueden provocar su efecto mediante la modulación de la producción de superóxido. De hecho, el alivio de la actividad de anión superóxido rescata la acumulación de HIF-1α en el fondo de agotamiento de ADCK2 y Trib2 (Fig. 4b). Todos estos resultados sugieren que la acumulación de HIF-1α inducida por TNFa puede ser regulada por una vía sensible superóxido y que las tres proteínas anteriores pueden estar implicados en la regulación negativa de la producción de superóxido (Fig. 6).
Nuestros resultados sugieren que TNFR1 receptor puede transmitir su efecto a través de un mecanismo complejo que incluye una vía no convencional NFkB-dependiente. Este mecanismo puede regular negativamente la producción de especies reactivas de oxígeno y parece estar controlada por Trib2, ADCK2 y PRKAR2B.
Está bien establecido que las cascadas convencionales y no convencionales de señalización de NFkB son los principales mecanismos que transmiten los efectos de TNFa en la fisiología intracelular [26]. Nuestros resultados sugieren que la detección de agotamiento de aguas arriba reguladores positivos de NFkB convencional - IKK-α (
CHUK
), IKK-β (
IKKB
) o IKK-ε (
IKBKE
) - producido ningún impacto negativo sobre la acumulación nuclear de HIF-1α (figura S8)
Además, se encontró que el agotamiento de los
RELA Opiniones y
NFKB2
resultado en una significativa. la regulación positiva de la acumulación de HIF-1α, mientras que el agotamiento de los
RELB
,
crel
y
NFKB1
produce una disminución en la acumulación de HIF-1α. Tal disminución puede ser rescatado por la mitigación de la actividad de anión superóxido (Fig. 5). Por otra parte, el agotamiento de
Trib2
y
fue encontrado TRPM7
para prevenir la translocación intracelular de RELB tras el tratamiento con TNF. Estos resultados nos permitieron especular que TNFa puede regular la acumulación de HIF-1α a través de ambas vías de NFkB convencionales y no convencionales. La cantidad real de HIF-1α acumulada dependerá entonces de un equilibrio entre las diferentes vías NFkB inducida por TNFa. El modelo propuesto parece estar en consonancia con la complejidad de las relaciones conocido inflamación de cáncer [3].
En conjunto nuestros resultados sugieren que la acumulación de TNF inducida por HIF-1α está regulada por una de varias vías (Fig. 6 ). Al menos en parte, TNFa puede transmitir su efecto a través de la señalización del receptor TNFR1 que conduce a un mecanismo de NFkB dependiente no convencional que regula negativamente la producción de especies reactivas del oxígeno. Este mecanismo parece estar controlada por ADCK2 y Trib2. TRPM7 parece estimular RELB translocación, pero su fenotipo agotamiento no puede ser rescatado por el alivio de la actividad superóxido. Por lo tanto TRPM7 puede representar una vía independiente de la regulación de la acumulación de HIF-1α. Son necesarios más estudios para comprender la mayor complejidad de estimulación TNF-dependiente de la acumulación nuclear de HIF-1α y su papel en la tumorigénesis y la progresión tumoral.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares
PC3, DU145, LNCaP, MCF10A, MDAMB-231, MCF7, SW480 y HepG2 se obtuvieron a partir de ATCC y mantenidos de acuerdo con los protocolos recomendados.
ensayo de redistribución HIF-1α_U2OS se utilizó en la campaña de detección para monitorear HIF 1α acumulación nuclear: células U2OS recombinantes que expresan establemente humano
HIF-1α
(NM_001530) fusionado al extremo C-terminal de la proteína fluorescente verde mejorada (eGFP). células U2OS son células epiteliales adherentes derivadas de osteosarcoma humano. La expresión de eGFP-HIF-1α es controlado por un promotor de CMV estándar y expresión continua se mantiene mediante la adición de G418 al medio de cultivo, según el protocolo del fabricante. U2OS línea celular estable que expresa eGFP fue utilizado solamente como control resta en campaña de detección
Además de HIF-1α_U2OS el efecto del tratamiento con TNF se ensayó en tres separada Thermo Fisher Scientific redistribución ensayos:. La redistribución del ensayo STAT3_U2OS , la E6-AP: la degradación de p53 redistribución de ensayo (U2OS), y el SCF-Skp2 E3 ligasa: degradación de p27 redistribución de ensayo (U2OS). Los ensayos se realizaron según los protocolos del fabricante para todos los compuestos de referencia. Para TNF-tratamiento, cada línea de células de ensayo se trató durante 24 horas a 37 ° C con TNFa en las siguientes concentraciones: 80 ng /ml, 40 ng /ml, 20 ng /ml, 10 ng /ml, 5 ng /ml, 2,5 ng /ml, 1,25 ng /ml, y 0,63 ng /mL. Cada titulación TNFa se realizó por cuadruplicado en placas de ensayo de 96 pocillos, y cada placa de ensayo se realizó por triplicado. Después del tratamiento TNF, las placas se fijaron, se tiñeron con Hoechst 33258, y la imagen tal como se describe a continuación. TNFa se adquirió de amp I +; D Systems, peróxido de hidrógeno, Hoechst 33258, Tiron y 4-hidroxi-TEMPO (TEMPOL) fueron adquiridos de Thermo Fisher Scientific
Transfección
fueron transfectadas Todas las líneas celulares. con Dharmafect (DF) los reactivos de transfección (Thermo Fisher Scientific): DF1 (HepG2, MCF7, MCF10A), DF2 (SW480), DF3 (HIF-1α_U2OS, DU145, LNCaP, PC3) y DF4 (MDA-MB-231).