Extracto
Estudios recientes subrayan la importancia del papel de los microARN (miARN) en el desarrollo de cáncer de pulmón cáncer. Los principales reguladores de la biogénesis miARN son las ribonucleasas Drosha, Dicer y Ago2. A continuación se evaluó el papel de las proteínas principales de la maquinaria de la biogénesis miARN en la respuesta de las líneas celulares de carcinoma de pulmón de células no pequeñas y pequeños humanos para el tratamiento con radiación ionizante. Se encontró que Drosha y Dicer se expresaron en niveles más altos en radioresistant pero no en líneas celulares sensibles. Sin embargo, la regulación por disminución de cualquiera de Dicer o Drosha no tuvo efecto sobre la sensibilidad de las células a la irradiación. Eliminación de componentes del complejo de silenciamiento inducido por ARN Ago2 y Tudor nucleasa de estafilococos tampoco sensibilizar a las células al mismo tratamiento. Por lo tanto, la modulación de la maquinaria de la biogénesis miARN no es suficiente para aumentar la radiosensibilidad de los tumores de pulmón y otras estrategias son necesarias para combatir el cáncer de pulmón
Visto:. Surova O, Akbar NS, Zhivotovsky B (2012) knock-down de Las proteínas básicas de regulación MicroARN Biogénesis no tiene efecto sobre la sensibilidad de las células de cáncer de pulmón a la radiación ionizante. PLoS ONE 7 (3): e33134. doi: 10.1371 /journal.pone.0033134
Editor: Eric J. Bernhard, Instituto Nacional del Cáncer, Estados Unidos de América
Recibido: 29 Noviembre 2011; Aceptado: 5 Febrero 2012; Publicado: 30 Marzo 2012
Derechos de Autor © 2012 Surova et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por subvenciones del Consejo de Investigación sueco, el sueco y las Sociedades del cáncer Estocolmo, la Fundación sueca del cáncer de la niñez, Sociedad sueca para la Investigación médica, el Ministerio de Educación Superior y Ciencia (11.G34.31.0006) de Rusia, la CE FP 6 (CHEMORES), así como los programas del FP7 (APO-SYS). OS fue apoyado por una beca del Instituto Sueco y el Instituto Karolinska y NA por la Comisión de Educación Superior de Pakistán. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón (LC) es la principal causa de mortalidad por cáncer en todo el mundo tanto en mujeres y hombres. Hay dos tipos principales de esta neoplasia, carcinoma de pulmón de células pequeñas (SCLC) y el carcinoma no microcítico de pulmón no microcítico (CPNM), que difieren considerablemente en sus características histopatológicas y respuestas a la terapia. La radiación ionizante, solo o en combinación con cirugía o quimioterapia, es un tratamiento eficaz para muchos tipos de cáncer, incluyendo LC. Sin embargo, tanto radioresistance tumoral intrínseca y adquirida a reducir en gran medida la eficacia de la radioterapia para el NSCLC y SCLC y, a menudo conducen a la recaída y la metástasis. Por lo tanto, es de gran importancia para explorar los mecanismos moleculares que subyacen a la resistencia de las células a la radiación LC.
Los microARN (miARN), la codificación no proteico, los ARN de una sola hebra de 19-25 nucleótidos, constituyen una nueva clase de reguladores de genes y se ha informado que desempeñan un papel crítico en la transformación del cáncer [1]. Estudios recientes demostraron la expresión aberrante de miRNAs en LC [2] - [5]. La producción de miRNAs requiere un conjunto de proteínas que se refiere colectivamente como la maquinaria miARN. La expresión aberrante de componentes de la maquinaria miARN se ha implicado en la tumorigénesis, incluyendo LC [6], [7]. Sobre regulación de Dicer en el adenocarcinoma de pulmón y su posible papel en el desarrollo de adenocarcinomas periféricos se han comunicado [7]. Alta expresión de otros silenciamiento inducido por ARN proteínas complejas (RISC), retardo mental X frágil proteína relacionada con el síndrome-1 (FXR1), Tudor-SN (TSN) y activador de la proteína de la proteína quinasa inducida por interferón (PACT), se han demostrado en el CPCP [7]. Otro grupo ha descrito una asociación entre la reducción de la expresión de Dicer y de mal pronóstico en pacientes con CP [8]. Por lo tanto, se requieren investigaciones adicionales para aclarar aún más el papel de la maquinaria miARN en la patogénesis molecular de LC. Recientemente, se ha reportado el potencial efecto terapéutico de agotamiento Dicer en la quimiosensibilidad y proliferación de células de cáncer de mama. El derribo de Dicer de siRNA condujo a la detención de G1 y significativo aumento de la sensibilidad a la agente que daña el ADN, cisplatino, en la línea celular de cáncer de mama MCF-7 [9]. Dadas las funciones biológicas fundamentales y múltiples de miRNAs en diferentes procesos celulares, la modulación de la expresión de proteínas implicadas en la biogénesis de miRNAs podría ser un enfoque terapéutico prometedor para su posterior aplicación clínica. Hasta la fecha no existen datos sobre la función de las proteínas de los genes miARN-produciendo en los mecanismos de resistencia /sensibilidad de las células de LC al tratamiento. Por lo tanto, se investigó si el agotamiento de las proteínas básicas implicadas en la biogénesis de miRNAs influye en la resistencia de LC a la radioterapia. Sorprendentemente, knock-down de expresión de Drosha, Dicer, Argonaute2 y Tudor-SN por la interferencia de ARN no aumentó la sensibilidad de las células de NSCLC que eran resistentes al tratamiento con radiaciones ionizantes.
Materiales y Métodos
Cultivo celular y tratamientos
líneas celulares de cáncer humano U1810, U1299 (ambos de la colección UU), A549, H661, H157, H23 (todos de la ATCC); y SCLC líneas de células H69 (ECACC), H82 (ATCC), U1906, U1690, U2020, U1285 (todos de la colección UU) se mantuvieron en RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), glutamina ( 2 mM), penicilina (100 U /ml) y estreptomicina (100 mg /ml) (todos obtenidos de Gibco) a 37 ° C, 5% de CO
2 y 95% de humedad. Las células fueron expuestas a la irradiación a una dosis de 8 Gy usando un
fuente de 60Co (Karolinska Biomics Center, Hospital Universitario Karolinska) para los períodos indicados en las leyendas de las figuras.
Evaluación de la apoptosis
la apoptosis se determinó por la cantidad de células en la fase sub-G1. Las células se trataron con tripsina y se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene 0,1% de FBS. Un total de 1 × 10
6 células se utilizaron para el análisis. Las células se sedimentaron a 2000 rpm y se lavaron una vez en PBS. El sedimento se resuspendió en PBS 250 l de hielo frío y se mezcla con 2 ml de 70% gota a gota etanol helado mientras vórtex. Las muestras se mantuvieron a 4 ° C durante 24 h y después sedimentaron a 2000 rpm y se lavaron dos veces con PBS. Después del último lavado se resuspendieron las células en 360 l de PBS que contiene 100 mg /ml de RNasa A (Fermentas) y se incubaron a 37 ° C durante 1 h. Se añadió cuarenta l de solución de yoduro de propidio (stock con 0,5 mg /ml) a las muestras seguido de incubación durante 30 min a temperatura ambiente con balanceo suave y la protección de la luz. Las células se analizaron por citometría de flujo (FACScan, Becton Dickinson), y se evaluaron los datos utilizando el software Cell Quest.
caspasa Ensayo de actividad
Las células se lavaron con PBS enfriado con hielo, se resuspendieron en 25 l PBS, se lisaron por congelación en nitrógeno líquido, se incubaron con sustrato de la caspasa-3-como y se analizaron como se describe anteriormente [10]. la actividad de caspasa se expresó como el pliegue de aumento en relación con los controles adecuados.
siRNA transfección
siRNAs dirigidos humana DICER1, Drosha, Argonaute2 y no siRNA dirigidos como control negativo se obtuvieron de Thermo Scientific Dharmacon® y se almacenan a una concentración de 20 mM. Veinticuatro horas antes de la transfección las células fueron sembradas en placas de 6 pocillos en medio de crecimiento sin antibióticos. siRNAs se diluyeron en 100 l de medio RPMI 1640 (Gibco) y se mezcla con 1 l DharmaFECT®1 siRNA reactivo de transfección (Thermo Scientific Dharmacon®). Después de 20 min de incubación, se añadieron los complejos a las células para dar una concentración final de siRNAs en el medio de 50 nM. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se sustituyó el medio y las células se sometieron a irradiación.
Western Blot Detección
Las células se lisaron usando tampón de lisis completo (Roche), además de inhibidores de la proteasa cóctel (PIC, Complete-M, Roche). La concentración de proteína se determinó utilizando el ensayo de proteína BCA (Pierce). Después de la mezcla con tampón de Laemmli, las muestras se sometieron a SDS-PAGE y Western Blot. Para la inmunodetección, se utilizaron los siguientes anticuerpos: anti-Dicer, anti-exfoliados PARP, anti-exfoliados caspasa-3, anti-exfoliados caspasa-9 (todos obtenidos de Cell Signaling Technology), anti-Ago2, anti-Drosha (ambos de Millipore), anti-XPO5, anti-prkra (PACT) (ambos de Abnova), anti-FXR1 (Santa Cruz Biotechnology), anti-β-actina (Sigma-Aldrich), y anti-GAPDH (Trevigen). anti-ratón o anti-conejo anticuerpos peroxidasa de rábano marcada con secundarios (Pierce) y un kit mejorado de quimioluminiscencia (reactivo de detección de transferencia de Western, GE Healthcare UK Limited) se utilizaron para la detección de proteínas reconocidas. El análisis densitométrico para la cuantificación del nivel relativo de expresión de la proteína se realizó utilizando el software ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
Real-Time PCR cuantitativa
ARN fue aislado de células utilizando un kit de PureLink ™ RNA Mini (Invitrogen). ADNc transcritas-invertir a partir de las muestras se utilizaron como plantillas. Argonaute2 (ctaccttcccctggaggtctg y Ago2-izquierda cgacctagcagtcgctctga Ago2-derecha) y 18S ARN ribosomal (18S-1 cgctactaccgattggatggtt y 18S-2 agtcaagttcgaccgtcttctc) primers (Invitrogen) fueron diseñados para que coincida con la secuencia de ADNc diana. Veinte ng de la plantilla de cDNA a transcripción inversa se mezcló con SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) y se amplifica usando un sistema de PCR en tiempo real 7500 (Applied Biosystems) con el siguiente programa: 40 ciclos, con cada ciclo que consiste en una paso de desnaturalización a 95 ° C durante 15 s, y una etapa de hibridación /extensión a 60 ° C durante 1 min.
Evaluación estadística
los resultados de tres experimentos independientes se expresaron como la media ± SEM La evaluación estadística se realizó mediante una prueba t no pareado.
Resultados
La expresión de las proteínas implicadas en la biogénesis de miRNA en el CPNM y CEP
Con el fin de identificar dianas moleculares para la radiosensibilización de células de LC entre las proteínas implicadas en la biogénesis de miARN se realizó un análisis de la expresión de proteínas de siete componentes básicos de maquinaria miARN en un panel de NSCLC y SCLC (seis líneas celulares en cada panel). Para cada subtipo LC se seleccionaron las líneas de células en función de su radiosensibilidad, medida por la fracción de supervivencia después de la exposición a 2 Gy (SF2) en un ensayo de supervivencia clonogénico, y se agrupan en radiosensibles (RS) con SF2 & lt; 0,3 Gy o resistente a la radiación (RR) con SF2 ≥ 0,3 Gy [11] - [14]. Los niveles basales de todas las proteínas (Drosha, Dicer, exportin-5 (XPO5), Tudor-SN (TSN), activador de la proteína de la proteína quinasa inducida por interferón (PACT), retardo mental X frágil proteína relacionada con el síndrome-1 (FXR1) y Argonaute2 (Ago2) se evaluaron por Western blot en todas las líneas celulares seleccionadas antes de la irradiación (Figura 1A). Ambos RNasa enzimas III (Drosha y Dicer) se expresaron en niveles relativamente altos en las células NSCLC en comparación con SCLC. Un miembro de las carioferinas familia de proteínas, XPO5, que está implicado en la exportación nuclear de miRNAs, se expresó en un nivel superior en H661 mientras que los niveles bajos de expresión se observaron en H69 y U1690 en comparación con las líneas celulares restantes. el nivel de expresión de TSN, PACT, proteínas FXR1 y Ago2 no variaron profundamente entre las distintas líneas celulares, con la excepción de H69, que exhibió una menor expresión de todas las proteínas estudiadas. a medida que nuestro grupo estaba formado por dos RS y las células RR, la línea celular H23 fue seleccionado como el representante de las células radiosensibles, y U1810 y H661 se utilizaron como representantes de las células radioresistant en nuevas investigaciones. El análisis densitométrico de la expresión de proteínas reveló que Dicer, Drosha y XPO5 se expresaron en niveles altos en las células RR comparado con RS, mientras que no había una clara correlación entre los niveles de expresión de Ago2, TSN, PACT y los valores FXR1 y SF2 (Figura 1B) .
(A) análisis de transferencia de Western del nivel de expresión de la proteína de Drosha, Dicer, exportin 5 (XPO5), Tudor-SN (TSN), activador de la proteína de la proteína quinasa inducida por interferón (PACT), retardo mental X frágil proteína relacionada con el síndrome-1 (FXR1) y Argonaute 2 (AGO2) en un panel de NSCLC (U1810, U1299, A549, H661, H157, H23) y el SCLC (U1285, H82, H69, U1690, U1906, U2020 ) líneas celulares. (B) Análisis densitométrico de los niveles relativos de expresión de la proteína en H23, líneas celulares H1299, H661 y U1810. Las líneas celulares distribuidos de acuerdo con la radiosensibilidad, medida como la fracción de supervivencia a 2 Gy (SF2). La igualdad de carga fue verificada utilizando anticuerpos anti-beta-actina. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes.
Efecto de la radiación ionizante en miARN Maquinaria en CPNM
Para investigar más a fondo el papel de los componentes de la maquinaria miARN en la respuesta de las células de LC a la irradiación, dos líneas de células RR (U1810 y H661) y una línea RS (H23) del panel de NSCLC se sometieron a irradiación gamma y la expresión de proteínas se analizó 6, 24 y 48 h después del tratamiento. Como era de esperar, se observó la muerte masiva de células apoptóticas en H23 a 6 h después de la radiación ionizante, según la evaluación de la escisión de PARP, mientras H661 y U1810 respondieron al tratamiento en puntos de tiempo posteriores después de 24 y 48 h, respectivamente (Figura 2). No se detectaron cambios visibles en la expresión de cualquiera de las proteínas estudiadas, ya sea en RR o células RS, medida por Western blot en 6, 24 y 48 h después del tratamiento IR (Figura 2). Por lo tanto, la irradiación gamma no afecta a la expresión de proteínas del núcleo de la maquinaria de miARN en NSCLC independientemente de la RR o RS fenotipo de estas células de cáncer de
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La escisión de PARP y el nivel de expresión de Drosha, Dicer, Exportin 5 (XPO5), Tudor-SN (TSN), activador de la proteína de la proteína quinasa inducida por interferón (PACT), y frágil X proteína relacionada con el síndrome del retraso mental 1 (FXR1) en U1810, las células H661 y H23 fueron detectados por Western borrar a los 6, 24 y 48 h después de la irradiación con 8 Gy. La igualdad de carga fue verificada utilizando anticuerpos anti-beta-actina. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.
Knock-down, de Core proteínas implicadas en el primer paso del miARN Biogénesis no es suficiente para sensibilizar a las células de NSCLC de irradiación
Dado que el nivel de expresión de la proteína de al menos tres componentes de la maquinaria miARN, Dicer, Drosha y XPO5, se correlacionó positivamente con la radioresistance de células de NSCLC, el alto nivel de su expresión puede contribuir a la respuesta de las células tumorales al tratamiento de una manera miARN guiada. Para explorar esta posibilidad, decidimos investigar el potencial efecto sensibilizador de la baja regulación de proteínas Dicer y Drosha en la línea celular U1810. La ribonucleasa nuclear Drosha y Dicer la ribonucleasa citoplasmática son los dos principales reguladores de la primera etapa de la producción de miRNA y promueven la disociación de transcritos primarios largos en los intermedios de la horquilla (pre-miRNAs) y la posterior escisión en miRNAs maduros. De este modo, mediante la eliminación de cualquiera de estas dos proteínas básicas que esperábamos para reducir la producción de miRNA y afectar la radioresistance de células de NSCLC.
El derribo de Dicer en U1810 células se realizó utilizando ARN de interferencia, después de lo cual las células se sometido a irradiación gamma y se analizaron 48 h después del tratamiento. El silenciamiento completo de la expresión de proteína Dicer fue confirmada por Western blot antes y después de la irradiación (Figura 3A). Baja regulación de Dicer fue seguido por disminución en la producción de varios miRNAs (miR1301, miR1249, miR1227, miR532-3p, miR625, miR1827, miR324-5p) según la evaluación de PCR en tiempo real (datos no mostrados). Sin embargo, las células U1810 con empobrecido Dicer exhibieron tan fuerte respuesta a la radiación ionizante al igual que las células de tipo salvaje. No hubo diferencias en la escisión de PARP entre el control y las células abatidos Dicer (Figura 3A). El porcentaje de células apoptóticas después de la irradiación fue el mismo en todos los grupos estudiados (Figura 3B). Análisis de la activación de las caspasas mostró que la caspasa-3 y -9 fueron procesados igualmente después de la irradiación y que la actividad caspasa-3-como era casi idéntica en ambos de tipo salvaje y las células-agotado Dicer (Figura 3 A y C). Un efecto similar en radioresistance era evidente cuando se agota en Drosha U1810 células. No se detectaron cambios en la escisión PAPR (Figura 3D) o el número de células apoptóticas (Figura 3E) entre el control y las células Drosha abatidos 48 h después ionizante radiaiton. Resultados similares se obtuvieron tras la eliminación de Dicer y Drosha de otras líneas celulares de cáncer (Figura S1 y S2). En general, estos datos sugieren que el knock-down de cualquiera de Dicer o Drosha no era suficiente para sensibilizar a las células de NSCLC a irradiación gamma
(A) El nivel de expresión de Dicer, la escisión de PARP y el procesamiento de la caspasa-3 y. - 9 en U1810 células transfectadas (48 h) con el control (si scr) o Dicer (siDicer) siRNA evaluó mediante transferencia Western 48 h después de la irradiación. La igualdad de carga fue verificada utilizando anticuerpos anti-GAPDH. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. (B) Detección de muerte celular apoptótica en U1810 evaluado mediante la medición de la población sub-G1 después de la transfección (48 h) con el control o Dicer siRNA y tratamiento de irradiación (48 h). (C) Actividad de la caspasa-3-como (veces de aumento con respecto al control) en U1810 células después del tratamiento con ya sea solo o en combinación con la transfección de control o Dicer siRNA irradiación (para detalles ver Materiales y métodos). (D) El nivel de expresión Drosha y la escisión de PARP en células transfectadas U1810 (48 h) con el control (SI SCR) o Drosha (siDrosha) siRNA analizados por Western blot 48 h después del tratamiento con irradiación. La igualdad de carga fue verificada utilizando anticuerpos anti-GAPDH. Todos los datos son representativos de tres experimentos independientes. (B) la muerte apoptótica en células U1810 medido por el análisis de la población sub-G1 después de la transfección (48 h) con control o Drosha siRNA y tratamiento de irradiación (48 h). Los resultados mostrados son la media ± E.E.M. de tres experimentos independientes.
El descenso de regulación de los componentes principales de ARN inducida por silenciar complejo (RISC) no sensibiliza las células NSCLC a la irradiación
Desde el agotamiento de las proteínas principales de la primera etapa de miARN biogénesis no afectó a la radiosensibilidad de NSCLC, es posible que la interferencia de ARN mediada por knock-down de cualquiera de Dicer o Drosha resultado en una reducción significativa, pero no la pérdida completa, de maduro miARN debido a la larga media vida de moléculas maduras. miRNAs son estables una vez que entran en el complejo efector. Por lo tanto, decidimos bloquear la segunda etapa de la biogénesis miARN por el derribo de los dos componentes principales de RISC, Argonaute2 y Tudor-SN, y así establecer su papel en la radioresistance de las células de LC. La baja regulación eficaz de la expresión de Ago2 en la línea celular U1810 se confirmó mediante la medición de su expresión de ARNm, que se redujo hasta en un 95% después de la transfección con anti-Ago2 siRNA (Figura 4A). Sin embargo, la respuesta de apoptosis (evaluada por la escisión de PARP y el procesamiento de la caspasa-3 y -9) exhibida por células Ago2-agotado después de la irradiación fue tan fuerte como en las células U1810 de tipo salvaje (Figura 4B). Además, no hubo cambios significativos en el porcentaje de la población sub-G1 o la activación de la caspasa-3 después de la radiación ionizante, aunque ambos parámetros se redujeron ligeramente en las células Ago2-reguladas por comparación con las células de tipo salvaje (Figura 4C y D).
(a) El nivel de Argonaute2 (AGO2) mRNA en U1810 células transfectadas con el control (parada de emergencia) o AGO2 siRNA normalizado contra 18S ARN ribosomal. Los resultados son la media ± E.E.M. de tres experimentos independientes. (B) La escisión de PARP y el procesamiento de la caspasa-3 y -9 en U1810 células transfectadas (48 h) con el control (si scr) o AGO2 siRNA, y después se somete a irradiación por 48 h. La igualdad de carga fue verificada utilizando anticuerpos anti-GAPDH. Todos los datos son representativos de tres experimentos independientes. (C) Detección de muerte celular apoptótica en células U1810 después de la transfección (48 h) con el control o AGO2 siRNA y posterior tratamiento con irradiación (48 h). (D) Actividad de la caspasa-3-como (veces mayor con respecto al control) en U1810 células después del tratamiento con ya sea solo o en combinación con la transfección con el control o AGO2 siRNA irradiación. Todos los resultados que se muestran son la media ± E.E.M. de tres experimentos independientes.
Por último, el mismo conjunto de experimentos se llevó a cabo con el fin de ronda por la expresión de otro componente RISC, Tudor-SN. Además de su función como un componente del complejo multiproteico involucrado en miRNA funcionamiento, TSN se sabe que actúa como un activador de la transcripción y el oncogén en muchos tipos de cáncer. Además, se escinde durante la apoptosis. A pesar de que significativa regulación por disminución de la expresión de TSN usando siRNA se logró en U1810 células, como se muestra por análisis de transferencia Western, las células abatidos exhibió escisión similar de PARP como la de tipo salvaje en tratamiento con radiación ionizante (Figura 5A). El porcentaje de células apoptóticas no difirió entre los TSN derribados grupos después de la irradiación (Figura 5B) y el control. Se obtuvieron resultados similares para otras dos líneas celulares de NSCLC el panel (A549 y H661) después de la baja regulación de TSN (Figura 5C y D).
El nivel de expresión de Tudor-SN y la división de PARP en U1810 (A), A549 (C) y las células H661 (D) transfectadas (48 h) con el control (si scr) o Tudor-SN (si TSN) siRNA se analizan por transferencia Western 48 h después de la irradiación. La igualdad de carga fue verificada utilizando anticuerpos anti-GAPDH. (B) La muerte celular apoptótica en células U1810 después de la transfección con TSN siRNA y la irradiación. Todos los datos son representativos de tres experimentos independientes.
Discusión
La radioterapia es un arma terapéutica importante en LC. Sin embargo, la eficacia de este tipo de terapia está limitada por el radioresistance inicial o adquirida de las células tumorales. NSCLC se caracteriza por una tasa de respuesta tumoral baja a la irradiación y una tasa de supervivencia a los 5 años de sólo el 7% y el 10% [15]. SCLCs inicialmente responden bien a la quimioterapia y la radioterapia convencional, sino que se desarrollan quimioterapia adquirida y radioresistance lo largo de los siguientes 3 a 12 meses, y la tasa de supervivencia global a los 5 años es sólo del 5% [16]. Los mecanismos que conducen a la radioresistance de estos tumores no se comprenden todavía completamente.
miRNAs se han notificado a ser posibles dianas de diagnóstico o terapéuticos en el tratamiento del cáncer, incluyendo los tumores de pulmón. Existe una creciente evidencia de la asociación entre la expresión de los genes miARN en los tumores y quimioterapia y la radiosensibilidad, tanto en lo que respecta a la predicción y la modulación de la sensibilidad [17] - [20]. Un estudio reciente sobre el NSCLC identificó un subconjunto de miRNAs que muestra los cambios en la expresión robustas en respuesta a la irradiación. Por lo tanto, una respuesta global miRNA existe en todas las células tumorales, incluyendo el cáncer de pulmón, y miRNAs podría ser componentes de la respuesta celular a citotóxico insulto [20]. hallazgos similares en relación con los cambios en la expresión global de genes miARN se registraron después del tratamiento contra el cáncer con diversos fármacos quimioterapéuticos en diferentes líneas celulares de cáncer y muestras de los pacientes [21]. La expresión de los componentes de procesamiento de miRNA ha demostrado ser desregulado en diferentes cánceres humanos [8], [22], [23] y, por lo tanto, podría contribuir a la respuesta de las células tumorales al tratamiento de una manera miARN guiada o independientemente de la vía de interferencia de ARN. Baja regulación de Dicer en células MCF-7 línea celular de cáncer de mama de siRNA fue demostrado que causa la detención de G1 y aumentar la sensibilidad a la que daña el ADN agente, cisplatino, lo que sugiere que la combinación de la estrategia anti-Dicer y la quimioterapia tradicional podría mejorar la eficiencia del tratamiento del cáncer [9]. Otro estudio demostró que Dicer baja regulación puede aumentar la capacidad proliferativa e invasiva de las células tumorales in vitro y de manera similar promover la proliferación de xenoinjerto de tumor subcutáneo in vivo 24. En general, estos datos sugieren que la maquinaria miRNA desempeña un papel, ya sea negativo o positivo en la transformación tumoral y respuesta a la terapia en diferentes tipos de cáncer. En el presente estudio, que tuvo como objetivo aclarar el papel de los componentes de la biogénesis miARN en la modulación de la respuesta de la radiación en el CPNM y CEP líneas celulares. Con el fin de identificar dianas moleculares para la radiosensibilización, el análisis de la expresión de proteínas de siete proteínas del núcleo de la maquinaria miARN, Drosha, Dicer, XPO5, TSN, PACT, FXR1 y Ago2, se llevó a cabo en un panel de CPNM y CEP líneas celulares. Nuestros resultados demostraron la mayor expresión de las proteínas de Drosha y Dicer en las células resistentes a la radiación en comparación con las líneas sensibles. Sin embargo, knock-down de estas dos proteínas esenciales no afectó a la sensibilidad de las células de NSCLC con el tratamiento con irradiación gamma. Esto puede ser parcialmente debido a la larga vida media de maduro miARN. Varios estudios han demostrado que por ronda mediada por interferencia de ARN de los resultados de Dicer Drosha, XPO5-5 o en una reducción significativa, pero no la pérdida completa, de maduro miARN [25] - [28]. Desde miRNAs parecen ser bastante estables una vez que entran en el complejo efector, exploramos la posibilidad de aumentar la radiosensibilidad de las células tumorales de pulmón por el agotamiento de los componentes corriente abajo de la vía de la biogénesis miARN, es decir, dos principales proteínas RISC, Ago2 y Tudor-SN. Sin embargo, la regulación por disminución de estas proteínas no afectó a la sensibilidad de las células de NSCLC al tratamiento. Así, puede haber vía de la biogénesis alternativa (s) que puede ser activado sobre la interrupción de uno de los múltiples pasos en el proceso de biogénesis de miRNA canónica. Se encontraron algunos miRNAs que se genere a través de una vía de la biogénesis Dicer-independiente: después de haber sido procesado por Drosha, los pre-miRNAs pueden ser cargados directamente a Ago y escindidos por el centro catalítico Hace generar un intermedio 3` extremo, que se recorta aún más [29]. También hay una clase de miRNAs no canónicos que omiten el microprocesador Drosha, pero aún requieren Dicer para su biogénesis [30]. Cabe señalar que el análisis de la expresión de la proteína de todos los componentes esenciales de la maquinaria miARN en U1810 células se realiza después de la baja regulación de Dicer, Drosha, TSN o Ago2 reveló que ninguno de los derribos tuvieron un efecto significativo en la expresión de otras proteínas en la vía, es decir, se observó ningún aumento en la expresión de los componentes de la maquinaria miARN siguiente knock-downs (Figura S3). Por otro lado, un estudio reciente realizado en las células endoteliales inmortalizadas y primarias mostró que la supresión global de la expresión de los genes miARN logrado a través de la regulación por disminución de cualquiera de Ago2 o Dicer proteínas usando siRNA condujo a un aumento de la muerte celular después de la irradiación [31]. Esto indica que la contribución de la maquinaria miRNA a la respuesta a la radioterapia podría altamente dependen del tipo de célula y ser diferente en células normales y cancerosas.
Otro informe mostró que los genes miARN biogénesis es inducida a nivel mundial a daños en el ADN en una ataxia -telangiectasia mutada (ATM) de manera quinasa dependiente en fibroblastos de embriones de ratón (MEFs) después del tratamiento con el fármaco radio mimético neocarcinostatin (NCS), que genera rupturas de doble hebra (DSB). proteína reguladora de tipo KH empalme (KSRP) se encontró que era un jugador clave que traduce la señalización de daño en el ADN de los genes miARN la biogénesis. La quinasa ATM se une directamente a fosforila y KSRP, dando lugar a una mayor interacción entre KSRP y pri-miRNAs y el aumento de la actividad en el procesamiento de KSRP miARN [32]. Ya sea KSRP se activa y contribuye al procesamiento de miRNA en el CPNM en la regulación a la baja de los componentes centrales de la maquinaria miARN y el tratamiento con irradiación gamma Queda por aclarar.
Además, se sabe que la mayoría de miRNAs tienen a decenas cientos de objetivos, y que los ARNm diana pueden enlazar varios miRNAs. Tal vez la magnitud de la disminución en la producción y actividad causada por la eliminación de una sola proteína de una vía miARN miARN no es suficiente para afectar a los mecanismos responsables de la resistencia de las células de LC a tratamiento de irradiación. En otras palabras, es probable que un impacto real sobre la radioresistance de células de NSCLC mediante la maquinaria miARN no se puede lograr mediante la eliminación de las proteínas individuales de la vía de la biogénesis, y de este modo aún más la identificación y la selección de miRNAs particulares implicados en la respuesta de LC se requiere células a la terapia de irradiación.
en resumen, en el presente estudio la expresión de un conjunto de proteínas implicadas en la biogénesis de miARN se evaluó por primera vez en un panel de líneas celulares de LC humanos. A pesar de que la expresión de las proteínas del núcleo de la vía de miARN en correlación con la resistencia de las células a la radioterapia, el derribo de estas proteínas no fue suficiente para desencadenar la sensibilización de las células de LC a este tipo de tratamiento. Esto sugiere que radioresistance tumor de pulmón no se puede superar mediante la modulación de la maquinaria de la biogénesis de miARN y que se requieren otras estrategias para combatir el cáncer de pulmón.
Apoyo a la Información
Figura S1.
La expresión de Dicer y la escisión de PARP en células A549 y H661 transfectadas con el control (si scr) o Dicer (si Dicer) siRNA se analizaron por Western blot 48 h después del tratamiento con irradiación (A). La igualdad de carga fue verificada utilizando anticuerpos anti-GAPDH. (B) La muerte celular apoptótica en células A549 y H661 medidos por el análisis de la población sub-G1 después de la transfección (48 h) con control o Drosha siRNA y tratamiento de irradiación (48 h)
doi:. 10.1371 /journal.pone. 0033134.s001
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figura S2. Francia El nivel de Drosha y PARP escindida en el A549 (A) y células H661 (C) después de la precipitación de Drosha. La igualdad de carga fue verificada utilizando anticuerpos anti-GAPDH. (B) El porcentaje de células apoptóticas en A549 transfectadas con siRNA Drosha y tratado con irradiación (48 h). . (D) de la caspasa-3-como actividad (veces mayor con respecto al control) en células H661 después del tratamiento con ya sea solo o en combinación con la transfección con el control o Drosha siRNA irradiación
doi: 10.1371 /journal.pone.0033134. S002 gratis (TIF)
Figura S3. México La nivel de Drosha, Dicer, XPO5, TSN, PACT después de knock-down de Dicer, Drosha, TSN y Ago2 en células U1810. La igualdad de carga fue verificada utilizando anticuerpos anti-GAPDH
doi:. 10.1371 /journal.pone.0033134.s003 gratis (TIF)
Reconocimientos
Los autores desean expresar la agradecimiento a Hogir Salim, Dali Zong y Birgitta Mörk (Karolinska Biomics Center, Departamento de Oncología-Patología, Instituto Karolinska) para la asistencia técnica.