Extracto
Las células madre del cáncer (CSC), una población poco común en cualquier tipo de cáncer, incluyendo el cáncer de colon, son tumorigénicos. Se ha pensado que los CAC son responsables de la recurrencia del cáncer, metástasis y resistencia a los medicamentos. El aislamiento de células madre cancerosas en cánceres de colon es un reto, y por lo tanto el mecanismo molecular que regula la auto-renovación y diferenciación de las células madre cancerosas sigue siendo desconocido. Nos cultivadas DLD-1 células, uno de los tipos de células derivadas de cánceres de colon, en medio libre de suero para obtener células esferoide. Estas células poseían las características de los CAC, con la expresión de CD133, CD166, LGR5 y ALDH1, mayores capacidades de quimio-resistencia, la migración, la invasión y la tumorigenicidad
in vitro
y
in vivo
que las células adherentes DLD-1. factor de Krüppel 4 similar (KLF4) es un factor esencial para el mantenimiento de la auto-renovación de las células madre adultas y embrionarias. Se ha utilizado para inducir a las células madre pluripotentes (iPS) a partir de células somáticas. Desde KLF4 se expresa en células de cáncer de colon, se investigó su papel en células esferoide aisladas de células DLD-1 y se encontró que KLF4 se sobreexpresa sólo en las células esferoide y la reducción de la expresión de KLF4 por la RNA-horquilla corta disminuyó significativamente las capacidades de estas células para resistir los productos químicos, migrar, invadir, y generar tumores
in vitro
y
in vivo
. Las células esferoide con la reducción de expresión KLF4 también tuvieron una disminución de expresión de marcadores de CSC y marcadores mesenquimales. En conjunto, el cultivo de células DLD-1 en medio libre de suero enriquece CSC y la expresión de KLF4 es esencial para las características de células madre cancerosas en DLD-1; por lo tanto KLF4 puede ser una posible diana terapéutica para el tratamiento de cáncer de colon
Visto:. Leng Z, Tao K, Q Xia, Tan J, Z Yue, Chen J, et al. (2013) Krüppel-Como Factor 4 actúa como un oncogen en células madre del cáncer de colon enriquecida en células Esferoide. PLoS ONE 8 (2): e56082. doi: 10.1371 /journal.pone.0056082
Editor: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 7 de Diciembre, 2012; Aceptó 3 de enero de 2013; Publicado: 13 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Leng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por la Fundación Estatal para las Ciencias Naturales de la República Popular de China 81071541 /H1504 (HZ) [http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm]. La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y el análisis de la fecha, la decisión de publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de colon es la causa común de muerte por cáncer en todo el mundo [1], [2]. Las terapias actuales, incluyendo la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia, fueron diseñados para dirigirse a todas las células tumorales. El éxito de estas terapias se ve gravemente obstaculizada principalmente debido a la existencia de las células tumorales resistentes a la terapia, que son capaces de desarrollar a todo el cáncer de colon después de las terapias [3]. Se ha pensado que estas células son las células madre del cáncer (CSC), que tienen capacidad de auto-renovarse y diferenciarse a todos los tipos de células en el cáncer de colon [4]. CSC existe en varios tipos de cánceres. Ellos son raras en los cánceres, pero muy tumorigénicas y también es responsable de la progresión del cáncer. Cuando se trasplantan en ratones inmunodeficientes, los CSC muestran una alta tumorigenecity. También se ha demostrado que células madre cancerosas son células responsables de la recurrencia del cáncer, metástasis, y la resistencia a fármacos [5], [6]. Por lo tanto, una terapia eficaz para el tratamiento de un cáncer que requiere de orientar bien las células madre cancerosas en el cáncer [7].
células madre cancerosas en varios tipos de cánceres poseen marcadores de superficie específicos que permiten a los científicos aíslan ellos. En el cáncer de colon, células madre cancerosas son positivos para CD133 +, CD44 +, CD166, LGR5, ALDH1, y la ESA. CSC de colon también tienen la capacidad de expulsar colorante Hoechst 33342 [8] - [19]. Sin embargo, las células madre cancerosas son muy raros, y en muchos casos, no pueden ser detectados. Por lo tanto, el aislamiento de células madre cancerosas en cánceres de colon en base a sus marcadores de superficie se vuelve extremadamente difícil [20].
CSC en algunas líneas celulares de cáncer, incluyendo cánceres de colon, puede aislarse mediante el cultivo de células en medio libre de suero para formar esferas. En esta condición, las células esferoide que expresan los genes "troncalidad" relacionados y poseen una alta capacidad de migrar, invadir y generar tumores [20], [21], [22], [23]. En el medio libre de suero, muchas líneas celulares de cáncer de colon humano HCT116, incluyendo, HT29, LOVO, SW480 y DLD-1 línea celular, pueden formar esferas [22].
Los mecanismos por los que las CSC de diversos tipos de los cánceres de mantener su "stemness" han sido ampliamente estudiados. La capacidad de auto-renovación es fundamental para los CAC mantenimiento y de recurrencia del cáncer [12], [23], [24], [25], [26], [27] KLF4 es esencial para mantener la característica de células madre cancerosas y necesarios para la capacidad para migrar e invadir en cáncer de mama [28]. Muchos grupos informaron que la KLF4 se expresa y funciona como un supresor de tumores en el cáncer de colon [29], [30], [31], [32]. Sin embargo, como se informó, las células de tumor a granel no son capaces de generar nuevas células. Mientras que las CSC pueden regenerar todos los tipos de células en el tumor a través de su comportamiento de células madre similares y hacer que la recaída de cáncer [6]. Por lo tanto, CSC y la mayor parte de las células del cáncer son extremadamente heterogénea. Esos estudios no distinguieron células madre cancerosas de colon de las células cancerosas a granel.
KLF4 es un factor de transcripción en dedo de zinc. Se ha demostrado que KLF4 regula la proliferación, diferenciación, apoptosis, y el metabolismo de thymocyto y de las células caliciformes de colon, respectivamente [33], [34]. En murino, KLF4 es esencial para la auto-renovación de las células madre embrionarias [35]. KLF4 también se utiliza para reprogramar fibroblastos de ratón a células madre pluripotentes, lo que implica la función de KLF4 en el mantenimiento de las características de las células madre [36]. Es importante destacar que las células madre normales demuestran características comunes a las células madre de cáncer, sino que también será importante para determinar si la regulación similar se produce en las células madre y células madre de cáncer. Por lo tanto, si KLF4 se expresa en células madre cancerosas de colon y de sus funciones de KLF4 en el cáncer de colon es necesario abordar.
En este estudio, hemos explorado las posibles funciones de KLF4 en células esferoide enriquecidas con células madre cancerosas. En primer lugar, en cultivo células DLD-1 en medio libre de suero para conseguir células esferoide que poseen las características de los CAC, y luego nos preguntamos si KLF4 se sobreexpresa en las células esferoide y si la reducción de expresión en las células esferoide KLF4 perturbaría sus características.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio de los Institutos nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentación Animal de la Universidad de la Universidad Huazhong de Ciencia y Tecnología (Número de Permiso: S255). Toda la cirugía se realizó bajo una mezcla de ketamina y la clorpromazina la anestesia, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Líneas Celulares
líneas celulares de cáncer de colon humano DLD-1, SW480, SW620, LOVO y de colon humano epitelio normal línea celular FHC eran fuentes comerciales, y el medio de cada línea celular se determinará en función del tipo de recogida cultura americana (ATCC) o para la referencia publicada. DLD-1, las células SW620 y SW480 se cultivaron en RPMI1640 (Hyclone) medio completo [37]. Otras líneas celulares de cáncer de colon, HCT116 y HT29 fueron amablemente proporcionados por el Dr. Liu y se cultivaron en 5A de McCoy (Sigma) medio completo [38]. células FHC epitelio normal de colon humano se cultivaron en DMEM /F12 (Hyclone) medio completo. células LOVO se cultivaron en DMEM (Hyclone) medio completo [39].
La cultura esfera se llevó a cabo como se ha descrito antes [22]. En pocas palabras, cada línea de células de cáncer de colon se cultivaron a una densidad de 2 × 10
6 células /ml en medio DMEM /F12 libre de suero que contiene 20 ng /factor de crecimiento epidérmico ml (EGF, PeproTech), 10 ng /ml factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF, PeproTech), 5 mg /ml de insulina (Sigma), 0,4% de albúmina de suero bovino (Amresco), y 2% B27 (Invitrogen). Para esferas de paso, les recogieron por centrifugación de ellos en 73 g durante 5 minutos. Esferas se disociaron a células individuales utilizando digestión con tripsina. Se hicieron crecer células esferoides individuales como se describe anteriormente. Todas las células se mantuvieron en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% CO2.
Aislamiento de células CD133 + y CD133-
CD133 + y se aislaron las células del cultivo de células CD133- mediante clasificación con perlas magnéticas utilizando el sistema MACS (Miltenyi Biotech) o por FACS [12], [40]. Para ambas separaciones, las células se incubaron con el anticuerpo monoclonal CD133 /2-PE (Miltenyi Biotech) durante 15 min a 4 ° C. Para la separación magnética, las células fueron seleccionados por columnas MS (Miltenyi Biotech), que conservaron las células positivas vinculadas por perlas. Para la separación FACS, las células teñidas CD133 /2-PE fueron clasificados con el instrumento BD FACSCanto II citómetro de flujo (BD Bioscience), y el isotipo IgG2b (Miltenyi Biotech) se utilizó como control.
Lentiviral La infección de esferoide las células
los vectores lentivirales que llevan KLF4 shRNA (NM004235.3, 1582-1610) o un no-diana revueltos shRNA se adquirieron de Shanghai GeneChem Co., Ltd. las células fueron infectadas esferoide de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
PCR en tiempo real
total ARNm se extrajeron de las células y luego transcribe inversamente a ADNc con PrimeScript RT Master Mix (Takara, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para medir los niveles de mRNA de los genes en cada muestra, se utilizó a base de intercalador PCR en tiempo real. Gliceraldehído-3-phpsphate-deshidrogenasa (GAPDH) se utilizó como control interno. La PCR en tiempo real se llevó a cabo con SYBR Green Master Mix (Takara, Japón) en el sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus ™ (Applied Biosystems, EE.UU.). La amplificación por PCR de los genes se realizó bajo las condiciones: la desnaturalización a 95 ° C durante 30 s, recocido a 60 ° C durante 60 s, y se extendió a 95 ° C durante 5 s; las reacciones se llevaron a cabo durante 45 ciclos. Para cada muestra, las reacciones fueron duplicadas y el nivel medio de mRNA de cada gen se determinó utilizando el método 2
-ΔΔCt. Los pares de cebadores para la medición de los niveles de cada gen se enumeran en la Tabla S1.
La tinción de inmunofluorescencia
Las expresiones de CD133, KLF4, E-cadherina, y vimentina en monocapa de células y esferas eran también analizados con la técnica de inmunofluorescencia. Para llevar a cabo el análisis de inmunofluorescencia, las células fueron cultivadas en un medio apropiado sobre vidrio-cubreobjetos durante 16 horas antes fijadas con paraformaldehído al 2% a 37 ° C durante 15 min. Las células fijadas fueron entonces permeablized con 0,1% Triton X-100 a temperatura ambiente durante 15 min seguido de la incubación a 4 ° C durante toda la noche con los siguientes anticuerpos primarios: CD133 /2 (Miltenyi Biotec), E-cadherina (Santa Cruz Biotec), vimentina (Cell Signaling Technology), y KLF4 (Santa Cruz Biotec), respectivamente. En el día siguiente, las células fueron incubadas con PE- o FITC-conjugado anticuerpo secundario (Boster) a temperatura ambiente durante 1 hora. Estas diapositivas fueron montadas con Prolong de oro con 4 ', 6-diamino-2-fenilindol (DAPI, Invitrogen). Fluorescente imágenes fueron tomadas con el Olympus IX71 epifluorescencia (Olympus, Japón).
Análisis Western Blot
Los extractos de proteínas se separaron por electroforesis en geles de diferentes concentraciones de SDS-poliacrilamida en función de los tamaños esperados de medida proteínas y se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore, EE.UU.). Después se bloquearon con 5% de leche sin grasa y 0,1% de Tween 20 en TBS durante 1 h, la membrana se incubó a 4 ° C durante toda la noche con los anticuerpos primarios, seguido de incubación con anticuerpo de cabra anti-conejo secundaria de anticuerpos. Los anticuerpos primarios utilizados en este análisis son: conejo anti-E-cadherina, conejo anti-vimentina, conejo anti-ZO-1, y de conejo anti-Caracol (Cell Signaling Technology); conejo anti-KLF4 y conejo anti-LGR5 (Santa Cruz Biotec).
Quimioterapia sensibilidad y resistencia Ensayo
La sensibilidad de las células de cáncer de colon a 5-FU se analizó utilizando kit de ensayo de CCK-8 (Dojindo, technolonies moleculares, Inc, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, 2.000 células se sembraron en cada pocillo de placas de 96 pocillos que contenían medio de crecimiento suplementado con varias concentraciones de 5-FU (Sigma) y se incubaron a 37 ° C y 5% de CO
2 en una condición humidificada durante 48 horas. La absorción de cada pocillo se leyó a 450 nm en un lector de placas. La tasa de supervivencia de las células se calculó como sigue:. Absorción del experimento /absorción del control x 100% se recogieron APC
Anexina-V /PI doble etiquetado
celular, se lavaron con buffer fosfato- de solución salina (PBS) y se tiñeron con Anexina V-APC (Keygen, china) y PI (Sigma), tanto para 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todas las células teñidas se examinaron a continuación, mediante el uso de instrumentos BD FACSCanto II citómetro de flujo (BD Bioscience).
Ensayo en agar blando
ensayo de agar blando se realizó para las células esferoides como se describe anteriormente [41]. Brevemente, cada pocillo de una placa de 6 pocillos se cargó con 2 ml de 0,5% de agar (w /v) en RPMI1640 suplementado con 10% de FBS como base. Después de la polimerización del agar base, 1 × 10
4 células mezcladas en 2 ml 0,375% de agar (w /v) en RPMI1640 suplementado con 10% FBS se añadieron. Los cultivos se mantuvieron en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO
2 de 2 semanas antes se contaron las colonias y se fotografiaron.
Formación de Colonias Ensayo
ensayo de formación de colonias se realizó para adherentes células DLD-1 como se describió previamente [27]. Brevemente, las células individuales (2.000 células por pocillo) se sembraron en placas de 6 pocillos y se cultivaron durante 2 semanas. Después se tiñeron con violeta, las células se fotografiaron y se analizaron por su eficiencia en la formación y proliferación de colonias. Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces.
La migración celular y la invasión de ensayo
La migración y la invasión de ensayo se llevó a cabo como se describe antes [42]. Brevemente, se sembraron 10
6 células en cultivo celular inserta con 8 micras filtros microporosos (BD Bioscience) recubiertas con (invasión) o sin matrigel (migración) (Sigma) y se incubaron durante 20 h, respectivamente. Las células migraron o invadidas se tiñeron con cristal violeta al 0,1% y se contaron en cinco campos aleatorios. Los experimentos se realizaron por triplicado.
En vivo
Tumorigénesis
Las células se obtienen mediante esferas cosechadas con tripsina. Diversas cantidades de células (1 × 10
4, 5 × 10
4, 1 × 10
5, 5 × 10
5, o 1 × 10
6 células) en 200 l PBS se trasplantaron por vía subcutánea en 4 a 6 semanas de edad, hembra atímicos, ratones Balb /c nu /nu (Beijing HFK Bioscience). El tamaño del tumor se midió cada 4 días usando un calibre. Se determinó el volumen de cada tumor usando la fórmula: longitud x anchura
2 × 0,5. Todo el trabajo con animales se ha llevado a cabo de acuerdo con el guidline de la Comisión de Ética de la Universidad Huazhong de Ciencia y Tecnología (S255). Los animales fueron alojados en una instalación específica libre de patógenos, con ambiente controlado. Los ratones fueron sacrificados con una inyección intraperitoneal de pentobarbital de sodio y se eliminaron los injertos cuando los tumores alcanzaron una longitud de 2,0 cm, o 60 días después de la inyección, cada vez que se primera [41]. tumores recogidos se prepararon para el análisis histopatológico.
Análisis histopatológico
Los tumores se cosecharon y se fijaron en formalina al 4% durante 24 horas antes incrustados en parafinas. Se obtuvieron secciones (2,5 micras) y se tiñeron con H & amp; E. Las imágenes fueron tomadas con Olympus IX71 (Olympus, Japón).
Análisis estadístico
Cada experimento se realizó al menos tres ensayos independientes. Los resultados se expresaron como la media ± SD. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando de Student
t-test
, donde
P
. & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
Generación de células Esferoide a partir de líneas celulares de cáncer de colon
estudios anteriores mostraron células HCT116 y de cáncer de colon HT29 forman esferas cuando se cultivan en medio libre de suero y las células esferoide posee las características de células madre cancerosas [22], [43], [44]. Nos preguntamos si HCT116, las células HT29, SW620, SW480, LOVO y DLD-1 podría formar esferas cuando se cultivan en medio libre de suero, respectivamente. Las células de cada línea celular se cultivaron a una densidad de 2 × 10
6 /ml en medio libre de suero. En el día 3, pudimos ver la formación de la esfera de HCT116, HT29, SW620, LOVO y DLD-1, pero no de SW480 (Figura 1 y los datos no se muestra). Las esferas aumentaron de tamaño a lo largo del tiempo. Por otra parte, las células esferoides en las esferas podrían ser pasados por más de 25 veces sin pérdida de ninguna característica a prueba a continuación, indicando que ellas podrían tener la capacidad de auto-renovación. Dado que las células DLD-1 forman esferas con mayor facilidad que otras líneas de cáncer de colon ensayados anteriormente, sólo se utilizaron los concentrados en las células DLD-1 en los siguientes experimentos. Para nuestra descripción conveniente, designamos las células esferoides de DLD-1 como DLD-S.
HT29, HCT116, SW620, LoVo, y las células DLD-1 podrían formar grandes y redondos, colonsphere flotando suelto de 50-100 m cuando se cultivan en SFM (como se muestra en DLD-1 grupo). Mientras SW480 no podía.
Caracterización de Células Esferoide
En primer lugar, se le preguntó si DLD-S expresa los marcadores de superficie de células madre cancerosas de cáncer de colon y los genes del núcleo de células madre. Hemos encontrado que la expresión de los genes del núcleo de células madre tales como Oct4 /3, Sox2 y Nanog y los genes marcadores de células madre cancerosas de colon, tales como CD133, CD166, LGR5 y ALDH1 se incrementaron en las células DLD-S en comparación con su expresión niveles en DLD-1 (Figura 2), lo que sugiere que las células esferoides pueden tener alto porcentaje de células madre cancerosas.
(a) La expresión de CD133, CD166, LGR5, ALDH1 y el tallo del núcleo celular genes Oct4 /3, Sox2 y Nanog en células esferoide dependiera regulado en comparación con DLD-1 células adherentes. Se observaron obviamente (B) Más células esferoide en comparación con sus células parentales DLD-1, analizados mediante la migración transwell y ensayo de invasión, respectivamente. (C) tal como se evaluó por el ensayo de agar blando y el ensayo de formación de colonias, las células esferoides presentan una mayor capacidad de formación de colonias. (D) tal como se evaluó mediante el ensayo CCK8, la tasa de supervivencia de las células esferoides se incrementa en comparación con las células adherentes en varias concentraciones de 5-FU. (E) según la evaluación de modelo de xenoinjerto de ratón, las células esferoide tenía mayor capacidad tumorigénico de sus células madre DLD-1. * P & lt;.
0,05
A continuación se investigó el perfil maligna de las células DLD-S, incluyendo su capacidad para migrar e invadir, para formar colonias, para responder a 5-FU, y generar tumores en ratones de inmunodeficiencia. Usando transwell ensayo de migración /invasión, hemos encontrado que las células DLD-S tuvieron significativamente mayor capacidad de migrar e invadir insertos recubiertos con Matrigel de sus células madre, DLD-1, lo hizo (Figura 2B).
El uso de agar blando ensayo y ensayo de formación de colonias, se encontró que DLD-S tenía una capacidad significativa para la formación de colonias mayores que sus células madre, DLD-1 (Figura 2C).
para probar la sensibilidad del sistema antibloqueo de frenos-S a la quimioterapia, se trataron células con 5-FU a diversas concentraciones. Las tasas de supervivencia de DLD-S y DLD-1 en medio de crecimiento con la misma concentración de 5-FU se compararon, y se encontró que DLD-S tuvo significativamente mayor tasa de supervivencia en las concentraciones ensayadas de 5-FU que sus células madre, DLD- 1 células hacían, lo que indica que DLD-S eran más resistentes a la quimioterapia (Figura 2D).
por último, se determinó la capacidad tumorigénico de las células DLD-S
in vivo
. Varios cantidad de DLD-S o DLD-1 (1 × 10
4, 5 × 10
4, 1 × 10
5, 5 × 10
5, o 1 × 10
6 células) se inyectaron por vía subcutánea en /c ratones y los ratones con la formación de tumores nu /nu Balb se contaron a los 60 días después del trasplante de células. Hemos encontrado que las células DLD-S tenían capacidad tumorigénico más alto que sus células madre, DLD-1 (Tabla S2). Un ratón trasplantado con 1 × 10
5DLD-S o células a los 60 días DLD-1 se muestran en la Figura 2E.
Poblaciones Expresión de KLF4 en células de cáncer de colon y células madre cancerosas enriquecidos con
primero se intentó confirmar que las expresiones de KLF4 en varias líneas celulares de cáncer de colon fueron menores que las líneas de células epiteliales normales de colon como se informó anteriormente [45]. Los niveles de expresión de KLF4 en SW620, HT29, SW480, HCT116, DLD-1, y las líneas celulares de cáncer de colon humano LOVO, así como FHC, una línea celular epitelial de colon normal, se analizaron mediante PCR en tiempo real y análisis de transferencia de Western. Como era de esperar, la KLF4 se expresó en todas las líneas celulares ensayadas y los niveles de mRNA (Figura 3A) y los niveles de proteína (Figura 3B y 3C) en estas líneas celulares de cáncer fueron significativamente más baja que la línea celular de FHC.
(a) según la evaluación de PCR en tiempo real, la expresión de KLF4 en varias líneas celulares de cáncer de colon fue significativamente más baja que la línea de células epiteliales de colon normal. (B y C) Según la evaluación de Western-blot, la expresión de KLF4 en varias líneas celulares de cáncer de colon fue significativamente más baja que la línea de células epiteliales de colon normal. (D) La expresión de KLF4 fue significativamente mayor en las células esferoides que en DLD-1, HT29, HCT116 células adherentes según la evaluación de PCR en tiempo real y Western-blot, respectivamente (como se muestra en DLD-1 grupo). (E) según la evaluación de PCR en tiempo real, la expresión de KLF4 fue significativamente mayor en las células CD133 + CD133 que en las células de DLD-1. * P & lt;.
0,05
Por último, comparamos los niveles de expresión de KLF4 en células esferoide y las células adherentes de células HCT116 DLD-1, HT29, y, y se encontró que los niveles de ARNm y proteínas de KLF4 eran significativamente mayor en las células esferoide que en las células adherentes (Figura 3D y la fecha no se muestra). Estamos ordenados más CD133 + y células CD133- de las células DLD-1 mediante la tecnología de separación MACS y se midieron los niveles de mRNA en ambos subgrupos de células DLD-1 utilizando PCR en tiempo real. Hemos observado que el nivel de mRNA de KLF4 fue significativamente mayor en las células CD133 + que en las células CD133- (Figura 3E). La expresión de CD133 y KLF4 en las células DLD-S se confirmó adicionalmente por tinción de inmunofluorescencia (Figura 4). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que KLF4 es más probable que se expresa en las células esferoides derivados-DLD-1 CD133 + subpoblación y, lo que enriquece las CSC, desafiando a la anterior conclusión de que las funciones de KLF4 como un supresor de tumores en la progresión del cáncer de colon.
el análisis de inmunofluorescencia confirma la presencia de CD133 y KLF4 en las células DLD-1 y DLD-S, el núcleo se tiñe con DAPI.
Desmontables de la expresión de KLF4 en células Esferoide alterado su stemness
a continuación pregunta si KLF4 es esencial para la auto-renovación y /o el perfil maligna de las células esferoides de DLD-1. Con este fin, hemos generado DLD-S siKLF4 mediante la infección de células DLD-S con KLF4-shRNA vector lentiviral y el DLD-S SiCon mediante la infección de células DLD-S con la no diana shRNA vector lentiviral. Primero examinamos la apoptosis de las células DLD-S SiCon y DLD-S siKLF4 para excluir la posibilidad de que la capacidad disminuida de la quimio-resistencia, la migración, la invasión y la tumorigenicidad de las células siKLF4 DLD-S se debió a un aumento de la apoptosis derribando expresión KLF4 y encontró que la tasa de supervivencia fue similar entre ambas células DLD-S siKLF4 (Figura 5A) DLD-S y SiCon. A continuación, se estudió el ARNm y los niveles de proteína de KLF4 en estas células DLD-S infectadas por virus y encontró que los niveles tanto de ARNm y proteínas de KLF4 fueron significativamente más bajos en las células DLD-S siKLF4 que en las células DLD-S SiCon (Figura 5B), lo que sugiere que la expresión de genes KLF4 fue eliminado con éxito abajo
.
(A) La tasa de supervivencia fue similar entre ambas células DLD-S siKLF4 DLD-S SiCon y como se evaluó mediante el ensayo de Anexina-V APC /PI doble etiquetado. (B) La expresión de KLF4 estaba golpeando de manera eficiente en las células DLD-S. análisis (C) de citometría de células CD133 +. La fracción CD133 + se redujo significativamente después de eliminar a KLF4 en las células DLD-S. (D) La expresión de CD133, CD166, LGR5 y ALDH1 fue significativamente menor en LDN-S siKLF4 que en DLD-S SiCon. (E) cultivadas en SFM, las células DLD-S siKLF4 formado pequeñas esferas en una frecuencia significativamente menor que hicieron las células DLD-S SiCon. * P & lt;.
0,05
A continuación, pregunta si la caída de expresión KLF4 en LDN-S alteró su expresión génica CSC-marcador mediante análisis FACS, PCR en tiempo real y análisis de Western Blot. Se encontró que el número de células CD133 + es significativamente menor en las células DLD-S siKLF4 que en las células DLD-S SiCon (Figura 5C) y la expresión de todos los genes CSC-marcadores, incluyendo CD133, CD166, LGR5 y ALDH1, significativamente menor en DLD-S siKLF4 que en DLD-S SiCon (Figura 5D). Finalmente, nos preguntamos si desmontables de KLF4 afectó a la auto-renovación de DLD-S. Cuando se cultivan en medio libre de suero, las células DLD-S siKLF4 forman pequeñas esferas en una frecuencia significativamente menor que las células DLD-S SiCon hizo (Figura 5E), lo que sugiere que KLF4 es esencial para la auto-renovación de las células DLD-S.
desmontables de la expresión de KLF4 alterado el perfil maligna de las células esferoide DLD-1 células
además, investigó si desmontables expresión KLF4 en DLD-S alteraría su perfil maligno mediante la comparación de la capacidad de DLD-S siKLF4 y DLD-S SiCon para migrar e invadir, para formar colonias, para responder a 5-FU, y de generar tumores en ratones de inmunodeficiencia. En primer lugar, el uso de transwell ensayo, se encontró que el sistema antibloqueo de frenos-S siKLF4 migró e invadió significativamente más lento que las células DLD-S SiCon (Figura 6A). En segundo lugar, hemos probado las tasas de supervivencia de las células DLD-S siKLF4 en medio de cultivo con 5-FU y se encontró que el sistema antibloqueo de frenos-S siKLF4 tuvo tasas de supervivencia significativamente menores que las células DLD-S SiCon (Figura 6B). En tercer lugar, usando el ensayo de agar blando y el ensayo de formación de colonias, se encontró que las células DLD-S siKLF4 forman significativo menor número de colonias y las colonias más pequeñas que el DLD-S SiCon (Figura 6C). Por último, se utilizó el modelo de xenoinjerto de ratón para preguntar si se requiere KLF4 para
in vivo
tumorigénesis de las células DLD-S-CSC enriquecidos. Un millón de células DLD-S siKLF4 o la SiCon se inyectaron por vía subcutánea en cada Balb /c nu /nu de ratón, respectivamente. Se encontró que los tumores se formaron en los ratones trasplantados con células DLD-S SiCon anterior y significativamente mayores que en los ratones trasplantados con células DLD-S siKLF4 (Figura 6D). Por ejemplo, en el día 56 la inyección de células poste, los tumores en los ratones que recibieron DLD-S SiCon crecieron a un promedio de 1256.52 mm
3 en volumen, mientras que los tumores en ratones que recibieron DLD-S siKLF4 crecieron sólo para promedio de 374.11 mm
3. La histología de los tumores de xenoinjertos fue examinado por tinción HE. No hubo diferencias significativas entre los grupos histológico DLD-S siKLF4 (Figura 6E) DLD-S SiCon y. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que desmontables de expresión KLF4 en las células DLD-S paralizado la capacidad de estas células para migrar, invadir, resistir a 5-FU, y generar tumores.
(A) DLD-S siKLF4 migró e invadido significativamente más lento que las células DLD-S SiCon, evaluados por transwell ensayo. (B) tal como se evaluó mediante el ensayo CCK8, DLD-S siKLF4 tuvo tasas de supervivencia significativamente menores que las células DLD-S SiCon en varias concentraciones de 5-FU. células (C) DLD-S siKLF4 formaron significativo menor número de colonias y colonias más pequeñas que el sistema antibloqueo de frenos-S SiCon. (D y E) las células DLD-S SiCon formaron tumores antes y significativamente mayor que en los ratones trasplantados con células DLD-S siKLF4. No hubo diferencias significativas entre los grupos histológico DLD-S siKLF4 DLD-S SiCon y. aumentos x 200 originales. * P & lt;. 0,05
El derribo de Expresión KLF4 Suprime la transición epitelio-mesenquimal de las células Esferoide
epitelio-mesenquimal transición (EMT) proceso está estrechamente relacionada con la función de metástasis de las células cancerosas [46], [47]. Las células cancerosas que participan proceso de EMT expresar genes mesenquimales, como la vimentina, caracol, y la babosa, mientras que las expresiones de genes marcadores epiteliales, tales como E-cadherina y ZO-1 disminuyen. Estas células también tienen perfil maligno similar a células madre cancerosas o células iniciadoras del cáncer hacen. En primer lugar, demostramos que, a diferencia de las células DLD-1, DLD-S expresó un típico marcadores epiteliales, E-cadherina y un marcador mesenquimal típica, vimentina mediante inmunofluorescencia y en tiempo real el análisis de PCR (Figura 7A y 7B), lo que sugiere que DLD-S poseía las características de las células que pasan por la EMT. Por último, comparamos la expresión de epiteliales y mesenquimales marcadores entre las células DLD-S siKLF4 y DLD-S SiCon y se encontró que las células DLD-S siKLF4 tuvieron significativos niveles más altos de proteína de ZO-1, pero significativa los niveles de proteína más baja de E-cadherina y vimentina de LDN-S SiCon (Figura 7C). Curiosamente, la expresión de caracol fue similar entre ambos DLD-S siKLF4 y DLD-S SiCon. Estos resultados sugieren que se requiere para promover el proceso de KLF4 EMT en células esferoide de colon.
(A) El análisis de inmunofluorescencia sobre células DLD-S SiCon y DLD-S siKLF4 para E-cadherina y vimentina, el núcleo se tiñe con DAPI . (B) según la evaluación de las células en tiempo real PCR, DLD-S tuvo significativas superiores niveles de mRNA de la E-cadherina, vimentina y Caracol. La expresión de ZO-1 se redujo. células (C) DLD-S siKLF4 tenían significativamente más alta de los niveles de proteína ZO-1, pero significativos más bajos niveles de la proteína E-cadherina y vimentina que DLD-S SiCon. La expresión de caracol fue similar entre ellos. * P & lt;. 0,05
Discusión
En este estudio, hemos sido capaces de enriquecer las CSC de varias líneas celulares de cáncer de colon cultivándolas en un medio libre de suero. Las esferas formadas en el medio libre de suero contenían células esferoides, que poseían características de células madre cancerosas de colon: primero, estas células tenían una alta expresión de genes marcadores de células madre cancerosas de colon y las células madre (Figura 2A); segundo, estas células eran más características malignas que sus parentales células DLD-1 (Figura 2B, 2C, y 2D); Por último, estas células mostraron una mayor tumorigenicidad cuando se trasplantan subcutáneamente en ratones inmunodeficientes (Figura 2E). Otros también utilizan sistema de medio libre de suero para obtener esferas CSC-enriquecidos de HCT116, líneas celulares de cáncer de colon HT29 [22], [43], [44]. Vale la pena señalar que este método las CSC-enriquecedora no es adecuado para todas las líneas celulares de cáncer de colon. Por ejemplo, en nuestro estudio, que no fueron capaces de enriquecer las esferas de SW480 usando este método.
También concluimos que KLF4 se requiere para las características de células madre cancerosas de colon. En primer lugar, se KLF4 sólo es altamente expresado en células esferoide enriquecidos-CSC de DLD-1, HCT116, HT29 células y las células CD133 + aisladas a partir de células DLD-1 (Figura 3D, 3E, y la fecha no se muestra). En segundo lugar, derribando la expresión KLF4 en las células DLD-S redujo el número de células CD133 + y redujo los niveles de expresión de genes marcadores de células madre de cáncer de colon (Figura 5C y 5D) y las células no podrían formar eficazmente esferas en medio libre de suero ( Figura 5E). En tercer lugar, las células DLD-S con disminución de la expresión KLF4 mostró la capacidad de migrar lisiado, invadir, resistir a 5-FU, y generar tumores (Figura 6A, 6B, 6C, 6D y 6E).