Extracto
L-carnitina (LC) se cree generalmente para el transporte de grupos acilo de cadena larga de ácidos grasos en la matriz mitocondrial para la generación de ATP
a través de Francia El ciclo del ácido cítrico. Basado en la teoría de Warburg que la mayoría de las células cancerosas dependen principalmente de la glucólisis para la generación de ATP, que postula que, el tratamiento LC daría lugar a perturbaciones del metabolismo celular y la citotoxicidad en las células cancerosas. En este estudio, HepG2 de hepatoma humano, las líneas celulares SMMC-7721, se utilizaron timocitos de cultivo primario y ratones portadores de tumor HepG2. contenido de ATP se detectó mediante ensayo de HPLC. del ciclo celular, la muerte celular y la viabilidad celular se ensayaron mediante citometría de flujo y MTS respectivamente. Gene, la expresión de ARNm y el nivel de proteína se detectaron mediante microarrays de genes, PCR en tiempo real y de transferencia de Western, respectivamente. Se detectaron las actividades de HDAC y acetilación de histonas tanto en tubo de ensayo y en células cultivadas. Un estudio de acoplamiento molecular se llevó a cabo con el protocolo CDOCKER de Descubrimiento Studio 2.0 para predecir la interacción molecular entre L-carnitina y HDAC. Aquí encontramos que (1) el tratamiento LC crecimiento de células cancerosas inhibe selectivamente
in vivo
y
in vitro
; (2) tratamiento de LC induce selectivamente la expresión de p21
cip1 gen, mRNA y de la proteína en las células cancerosas pero no p27
kip1; (4) LC aumenta la acetilación de histonas e induce la acumulación de histonas acetiladas tanto en timocitos normales y células cancerosas; (5) LC inhibe directamente la HDAC I /II actividades
a través de
unión a los sitios activos de la HDAC e induce la acetilación de histonas y la acumulación de lisina-acetilación
in vitro
; (6) Tratamiento de LC induce la acumulación de histonas acetiladas en la cromatina asociados con el p21
CIP1 gen p27 pero no
Kip1 detectado por chip de ensayo. Estos datos apoyan que LC, además de transportar grupo acilo, funciona como un inhibidor de HDAC endógena en la célula, lo que sería de importancia fisiológica y patológica
Visto:. Huang H, Liu N, Guo H, Liao S, Li X, Yang C, et al. (2012) L-carnitina es un crecimiento celular endógeno HDAC inhibidor del cáncer selectiva inhibidora de
En Vivo
y
in vitro
. PLoS ONE 7 (11): e49062. doi: 10.1371 /journal.pone.0049062
Editor: Wei-Guo Zhu, la Universidad de Pekín Centro de Ciencias de la Salud, China
Recibido: Diciembre 21, 2011; Aceptado: 9 Octubre 2012; Publicado: 5 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Huang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación y Desarrollo de alta Tecnología Nacional de China (Proyecto 2006AA02Z4B5), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Proyectos 81070033, 30770835, 81170608, 81072091); Proyectos (9251018201002, 94510018201003604) de la provincia de Guangdong Fundación de Ciencias Naturales y proyectos de la Comisión de Educación Municipal de Guangzhou (10A, 08A 057S 108) (a JL, HH y Chequia). Este estudio es apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud de subvención R01HL072166 y R01HL085629 (a XW). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
carnitina se biosintetizan a partir de los aminoácidos lisina y metionina y su forma biológicamente activa es L-carnitina (LC). En general se cree que la carnitina transporta grupos acilo de cadena larga de ácidos grasos en la matriz mitocondrial, donde se pueden analizar a través de β-oxidación en acetil-CoA para obtener energía utilizable
a través de Francia El ciclo del ácido cítrico [ ,,,0],1] - [3]. Por lo tanto LC se requiere para la generación de energía metabólica en las células vivas.
Ha sido bien conocido que la mayoría de las células del cáncer generan predominantemente energía por una alta tasa de glucólisis seguido de la fermentación del ácido láctico en el citosol, en lugar de una tasa relativamente baja de la glucólisis seguido por la oxidación de piruvato en la mitocondria como la mayoría de las células normales. Esto se conoce como efecto de Warburg en células de cáncer [4], [5]. El crecimiento rápido de las células malignas suelen tener tasas de glicolítico que son hasta 200 veces más altos que los de sus tejidos normales de origen. A pesar de que el efecto Warburg ha sido cuestionada y desarrollado aún más, esta teoría sigue siendo el más citado evidencia de que los tumores muestran el metabolismo disfuncional [6].
Sobre la base de esta teoría de que el ciclo cítrico es perjudicial en la mayoría de las células del cáncer [7 ], [8], que postula que el LC daría lugar a perturbaciones del metabolismo celular en las células cancerosas, pero no en las células normales. En este estudio, hemos investigado los efectos de la LC en la citotoxicidad tanto en el cáncer y las células normales. Se encontró que inhibe selectivamente LC crecimiento de células cancerosas tanto
in vitro
y
in vivo
. Además, investigó el mecanismo de la citotoxicidad mediada por LC y se encontró que las concentraciones fisiológicas de LC podrían inhibir directamente la actividad de la HDAC.
Materiales y Métodos
Materiales y agentes
LC, R carnitina, oligomicina (No. 04876), butirato (Buty) y tricostatina A (TSA) se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). HDAC
TM ensayo I /II y cribado sistema se adquirió de Promega Corporación (Madison, WI). L-glucosa y D-glucosa se obtuvieron de Alfa Aesar (Karlsruhe, Alemania). suero bovino fetal (FBS) se adquirió de Invitrogen Co. (Carlsbad, CA). Los anticuerpos monoclonales de conejo contra Acetil-H3 (Lys9) (C5B11), anticuerpos policlonales de conejo contra la PARP, acetilada-lisina, acetil-H4 (Lys8), y los anticuerpos monoclonales de ratón contra p21
Waf1 /Cip1 (DCS60) fueron todos adquiridos de Señalización celular (Beverly, MA). Los anticuerpos contra Rb (G401), fosfo-Rb (S780) se adquirieron de Bioworld Technology, Inc. de ratón p27 anticuerpo monoclonal (F-8), los anticuerpos policlonales de conejo contra GAPDH (FL-335) y peroxidasa de rábano (HRP) marcado con secundaria anticuerpos eran de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). reactivos de quimioluminiscencia potenciada se compraron de Amersham Biosciences (Piscataway, NJ).
Ratones y la dieta
Varón normales Balb /cy /c ratones desnudos Balb 5 semanas de edad (18-22 g) fueron comprado respectivamente de Guangdong Center Animal y alojados en jaulas de malla de alambre de acero inoxidable en una sala de animales a una temperatura constante con un ciclo de 12-h-luz /-dark. Los ratones se consume una dieta y agua ad libitum no purificada comercial. Todos los protocolos experimentales fueron de acuerdo con el Centro de Animales de Guangdong para el tratamiento ético de los animales y aprobados por el Comité de experimentación animal de Guangzhou Medical College (SCXK2008-2002). los ratones Balb /c normales de sexo masculino fueron asignados aleatoriamente a dos grupos (n = 8 ratones /grupo) y fueron
i.p.
. inyectado con vehículo (solución salina) o LC a 400 mg /kg para consecutivos 15 días. El peso corporal y peso de los órganos fueron detectados y resumen. Hombre Balb /c ratones desnudos fueron
s.c.
. inoculado en la axila izquierda con células HepG2 (1 × 10
6 células /ratón). Cuando el tamaño del tumor llega a 50 a 75 mm
3, los ratones fueron divididos aleatoriamente en dos grupos (n = 8 ratones /grupo) y fueron
ip
inyectados con vehículo (solución salina) o LC (400 mg /kg, una vez que se detectaron /día) durante 15 días, excepto el día 8. El peso corporal y el tumor de peso y resumido. Para ilustrar mejor estos resultados, todos los datos primarios se cambiaron para el nivel relativo (%).
Cultivo de células
líneas celulares de hepatoma humano HepG2 y SMMC-7721, adquiridos de la American Type Culture Collection (Manassas, VA), se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10% FBS, 100 U /ml de penicilina de bencilo y 100 U /ml de estreptomicina, pH 7,4 en una atmósfera humidificada con 5% de CO
2 a 37 ° C. aislamiento de timocitos y cultivo primario se realizó como sigue: En resumen, el timo de ratón Balb /c se enrolló en un trozo de gasa estéril para eliminar la grasa adjunta y el tejido conectivo y la glándula se colocó en un plato de 60 mm de Petri que contiene 5 ml de frío medios de comunicación (HBSS a pH 7,0 que contiene suero de ternera fetal al 5% a 4 ° C) y suavemente bromeó el timo de separación, con agujas y pipetearon arriba y abajo varias veces para romper cuidadosamente los grumos de células. Las mezclas se hicieron pasar a través de una malla de acero 75 micras para eliminar los grumos de tejido, se centrifugaron las suspensiones de células (250 g, 10 min, 4 ° C) y se resuspendieron los sedimentos celulares con 5 ml de RPMI 1640 medio. Los números de células totales se contaron con azul de tripano en un contador de glóbulos blancos.
La muerte celular ensayo
Esto se realizó usando Anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI) doble tinción, seguido de citometría de flujo como se describe anteriormente [9]. En resumen, se recogieron las células HepG2 cultivadas y se lavaron con PBS frío y se resuspendieron con tampón de unión, seguido de Anexina V-FITC de la incubación durante 15 min y PI tinción durante otros 15 min a 4 ° C en la oscuridad. Las células teñidas se analizaron con citometría de flujo en 30 minutos.
ATP contenido determinación
Determinación del contenido de ATP se llevó a cabo como se describe anteriormente [10]. Brevemente, se recogió Igual número de células cultivadas y el sedimento celular se congeló inmediatamente y se almacenó en nitrógeno líquido para su posterior análisis ATP. Los lisados se centrifugaron a 12 000 r.p.m. durante 10 min a 4 ° C. Se recogió el sobrenadante para el análisis de ATP usando una fase inversa C18 HPLC (LC-6AD, Shimadzu, Japón) de ensayo después se ajustó el pH 7,4. 180 mM de KH
2 PO
4 (5% de metanol) se utilizó como fase móvil (pH 6,25) funcionando a 0,8 ml /min. El ensayo fue lineal desde 0,05 hasta 200 mg /ml de ATP con coeficiente de determinación (R
2) & gt; 0,999. coeficientes de variación de validación para los ensayos de intra e inter-día eran menos de 1,5% y 5,1%, respectivamente. contenido de ATP relativa se calcula de acuerdo con el área del pico
frente of the ATP de pie curva.
viabilidad de las células de ensayo
Los efectos de los fármacos sobre la viabilidad celular se determinó por el MTS ensayo (CellTiter 96® Una solución acuosa ensayo de proliferación celular, Promega Corporation, Madison, WI, EE.UU.) como se informó anteriormente [9]. Brevemente, las células se cultivaron en placas de 96 pocillos y se trataron con agentes indicados para 24 o 48 h. A continuación, las células tratadas se incubaron con 20 l de MTS para adicional de 3 h. La absorbancia se midió a 490 nm con un lector de microplacas automático (Sunrise, Tecan). La viabilidad celular se calculó mediante la siguiente fórmula: Viabilidad celular (%) = (absorbancia media de grupo tratado - absorbancia media de blanco) /(absorbancia media de no tratado absorbancia media grupo- de blanco)] x 100%
histonas y proteínas acetilación
in vitro
y en células cultivadas
en
in vitro
acetilación de proteínas, lisado celular de cualquiera de las células cancerosas o timocitos de ratón se incubaron con varias dosis de LC y TSA o Buty en un tampón de ensayo HDAC a 37 ° C durante 1,5 h, a continuación, acetilados-H3, -H4, y las proteínas de lisina acetilada se detectó por Western blot. Para la acetilación de proteínas en células cultivadas, ya sea de células de cáncer o de timocitos de ratón se trataron con diferentes concentraciones de LC o TSA y Buty para varios puntos de tiempo, se recogieron las células y luego acetilación de proteína se detectó por Western blot.
Western Blot
Western blot se realizó como se describe anteriormente [11], [12]. En pocas palabras, una cantidad igual de proteína total extraído de células cultivadas se separó por 12% SDS-PAGE y se transfirió a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Los anticuerpos primarios y peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con anticuerpos secundarios apropiados se utilizan para detectar las proteínas designadas. Los anticuerpos secundarios delimitadas en la membrana de PVDF se hicieron reaccionar a los reactivos de detección ECL y se expusieron a películas de rayos X (Kodak, Japón). La exposición de la película de rayos X fue escaneada y digitalizada utilizando un escáner de alta resolución. La densidad de las bandas deseadas se cuantificó con el software Quantity One (BioRad).
Se realizó un análisis del ciclo celular
Análisis del ciclo celular como se informó anteriormente [12]. células HepG2 se sembraron en placas de 6 cm durante la noche en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10%, luego se trató con LC en los puntos de tiempo indicados. Se recogieron las células, se lavaron por PBS, y se tiñeron con PI en presencia de ARNasa. Los datos fueron analizados con base en la distribución de las poblaciones de células en diferentes fases del ciclo celular.
Modelado computacional
Con el fin de comprender la interacción molecular entre la L-carnitina y HDAC, un estudio fue acoplamiento molecular llevado a cabo con el protocolo de descubrimiento CDOCKER Studio 2.0 (Accelrys Software Inc). La estructura cristalina de HDAC (PDB ID: 1ZZ0) se utilizó como la proteína de acoplamiento. En primer lugar, sólo la cadena A de la subunidad se mantuvo después de otras subunidades de cadena, conformaciones alternativas, el ligando ACT original, se eliminaron los metales potasio y moléculas de agua. Después, se añadieron átomos de hidrógeno y los cargos Gasteiger a la subunidad. Por último, sólo las posiciones de hidrógeno han sido optimizados con Dreiding-como campo de fuerza usando el menú Clean Geometría. Mientras tanto, el compuesto L-carnitina seleccionada como el inhibidor de acoplamiento también se optimizó con Dreiding-como campo de fuerza usando el menú Clean Geometría. El HDAC proteína era rígida, mientras que la LC ligando era flexible durante el proceso de acoplamiento. La entrada del sitio de la esfera se centra en el ACT ligando original con un radio de 12 Å. Golpes de la tapa, conformaciones al azar y orientaciones para refinar los parámetros se ajustan a 20. La conformación correspondiente a la CDOCKER interacción más bajo de energía fue seleccionada como la conformación de unión más probable. Por fin, el complejo de acoplamiento se estimó más energía libre de unión por el protocolo de energías de enlace Calcular. Todos los parámetros utilizados en el cálculo por omisión, a excepción de explicar.
ensayo de actividad de HDAC
in vitro Hoteles en células cultivadas y en
actividad HDAC
in vitro y en
células cultivadas se detectó con la HDAC-Glo ™ ensayo I /II y Screening System (Promega, EE.UU.) siguiendo el protocolo estándar. ensayo de HDAC se realizó en la placa blanca de 96 pocillos. Para
in vitro
ensayo de actividad de HDAC, lisado de células (contenido de proteína óptima: 1 g) se incubó con diversos agentes en un tampón de ensayo HDAC (100 l) a 37 ° C durante 60 minutos y luego 100 l HDAC
/se añadió TM I reactivo II, después de 30 minutos, se midió la luminiscencia. Para el ensayo de HDAC en células cultivadas, células (10000 células /pocillo) fueron tratadas con agentes de LC o de control positivo para 6 h o 12 h, a continuación, la celda medio se cambió a medio libre de suero más tampón HDAC (50 l + 50 l). Después de 15 minutos de incubación, HDAC
TM I /II reactivos (100 l) se añadieron a las células, se midió la luminiscencia después de 30 minutos.
cuantitativa en tiempo real PCR
ARNs totales se extrajeron a partir de células HepG2 con reactivo TRIzol. La transcripción inversa de ARN purificado se realizó con superíndice III transcripción inversa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). La cuantificación de los transcritos del gen hecho por cuantitativa utilizando el kit Takara SYBR Premezcla Ex Taq con Applied Biosystems 7500 Fast sistema de PCR en tiempo real. Los valores de P21 y P27 se muestran contra el valor de GAPDH que se usó como un control. Los conjuntos de cebadores para la amplificación se enumeran a continuación: p21-F: 5'GTC CAG CGA CCT TCC TCCA3 TCA '; p21-R: 5'CCA TAG CCT CTA CTG CCA CCA TC3 '; p27-F: 5'ACT GAG GAG GCG ACG AAG GT3 '; p27-R: 5'CCT GAC AAG CCA CGC AGT AGAT3 '; GAPDH-F: 5'CCA GCA AGA GCA GAG CAA GAA3 '; GAPDH-R:. 5'GGT CTA CAT GGC AAC TGT GAGG3 '
ensayos de chip
1 × 10
7 Se prepararon células HepG2 para el chip de ensayo, realizaron como se describe anteriormente [ ,,,0],13] por la compañía biotecnológica Kangchen (Shanghai). Para cada chip de ensayo, la muestra era una mezcla de 3 muestras de células independientes. anticuerpo anti-H3K9 se usó para inmunoprecipitar las histonas. Todas las muestras de chip se realizaron por PCR en tiempo real, utilizando el termociclador de PCR y Takara Rotor-Gene 3000 PCR en tiempo real. P21 y p27 cebadores fueron los siguientes: p21-F: 5'GCC GAA GTC AGT TCC TTG TG3 '; p21-R: 5'CGG GGT CCC CTG TTG TCT3 '; p27-F: 5'CTC TGA GGA CAC TTT GCA GGT3 '; p27-R: 5'TGC AGG TCG CTT CCT TAT TC3 '. Los datos se presentan como el enriquecimiento de pliegue calculado por cada valor de la ficha de anticuerpos (IP /entrada, el porcentaje de entrada) con respecto al valor de control de IgG chip.
ensayo de microarrays de ADN y análisis
células HepG2 fueron tratados diferentes dosis de LC durante 24 h, y a continuación, las células se recogieron y se extrajeron con agentes TRIzol. la cantidad y la calidad del ARN se midieron por NanoDrop ND-1000. La integridad del ARN se evaluó mediante electroforesis en gel desnaturalizante de agarosa estándar. microarrays de ADN se realizó por la compañía biotecnológica Kangchen (Shanghai) de acuerdo con las directrices MIAME. El Humano 12 × 135K génica gama de expresión fue fabricado por Roche NimbleGen. En pocas palabras, se utilizó Acerca de 5 g de RNA total de cada muestra para el etiquetado y la gama de hibridación como los siguientes pasos: (1) La transcripción inversa con por Invitrogen Superíndice kit de síntesis de ADNc-; (2) el etiquetado ds-cDNA con NimbleGen de un color kit de marcaje de ADN; (3) hibridación de matriz utilizando el Sistema de hibridación NimbleGen y seguido de lavado con la NimbleGen lavar kit de amortiguación; (4) de barrido de matriz utilizando el escáner de microarrays Axon GenePix 4000B (Molecular Devices Corporation). Las imágenes escaneadas (formato TIFF) fueron importados en el software NimbleScan (versión 2.5) para la alineación de la red y el análisis de datos de expresión. Doblar los aumentos de la expresión génica se calcularon en comparación con el control del vehículo.
Métodos estadísticos
A menos que se indique lo contrario, la media ± SD se presentan en su caso. de Student no pareada
t-test o
una manera ANOVA se utiliza en su caso para determinar las probabilidades estadísticas.
P
valor inferior a 0,05 se consideró significativo.
Resultados
LC tratamiento inhibe selectivamente el crecimiento de células de cáncer
in vivo
y
in vitro
ha sido bien conocido que la mayoría de células cancerosas dependen de la glucólisis para la generación de ATP. Para confirmar aún más que en nuestros sistemas de células, se utilizaron varias líneas celulares de cáncer para probar si oligomicina podría inhibir la producción de ATP. Se muestra el resultado en las células cancerosas representativas. Se encontró que en presencia de L-glucosa en el medio de cultivo, oligomicina agota rápidamente la producción de ATP, mientras que en la presencia de D-glucosa en la oligomicina medio de cultivo no afectó a la generación de ATP (Fig. 1
a
). Desde L-glucosa no se puede usar para producir la producción de ATP [10], este resultado implica que las células cancerosas se basan principalmente en la glucólisis D-glucosa para la producción de ATP, de acuerdo con informes anteriores [4], [5]. A continuación se investigó si el tratamiento LC podría aumentar la producción de ATP intracelular en las células cancerosas. En consonancia con nuestra predicción, el tratamiento LC no pudo aumentar aún más la producción de ATP en tanto HepG2 hepática y cáncer de células SMMC-7721 (Fig. 1
b
). Sin embargo, en contraste con el efecto en las células cancerosas, oligomicina, cuando se añade en timocitos de ratón en cultivo con D-glucosa, la generación de ATP a tiempo dependiente inhibida (Fig. 1
c
) mientras LC aumentó de manera eficiente el contenido de ATP intracelular en diferentes puntos de tiempo bajo esta condición (Fig. 1
d
). Estos resultados confirman que LC es capaz de generar ATP en timocitos de ratón normales, pero no en HepG2 hepática y células de cáncer de SMMC-7721.
(a) Las células cancerosas son resistentes a la oligomicina en presencia de D-glucosa ( 2 g /L), pero no L-glucosa (2 g /L). células de cáncer de HepG2 humanos se cultivaron en presencia o ausencia de cualquiera de D-glucosa o L-glucosa en el medio de cultivo y se trataron con diversas dosis de oligomicina (0,1, 0,25, 0,5. 1,0 mg /ml) durante 6 h y el contenido de ATP se juzgado. La media + SD (n = 3). *
P Hotel & lt; 0,01,
frente
control. DM: DMSO. (B) LC no aumenta el contenido de ATP intracelular en las células cancerosas. células HepG2 hepática y SMMC-7721 humanos se cultivaron en el medio de cultivo normal, respectivamente, y tratados con diferentes dosis de LC para 6 h, se detectó el contenido de ATP. LC: L-carnitina. (C) Thymotytes son sensibles a oligomicina en presencia de D-glucosa (2 g /L). timocitos de ratón fueron tratados con oligomicina (1 mg /ml) para diferentes puntos de tiempo (1, 3, 6, 9 h), se detectó el contenido de ATP total. (D) LC aumenta de manera eficiente el contenido de ATP celular. timocitos de ratón fueron tratados con LC (1 mM) durante diversos tiempos, se assassed contenido de ATP celular. Veh:.
Vehículo
A continuación se compararon los efectos de LC en el tejido normal y el crecimiento del cáncer
in vivo
. los ratones Balb /c normales o ratones Balb /c desnudos inoculados con células cancerosas HepG2 fueron
i.p.
. inyectado con LC (400 mg /kg) durante 15 días, excepto días 8, seguido de la terminación del experimento. Este programa de dosis es una dosis tolerada para Balb /c ratones desnudos. peso de los órganos y el peso del tumor de cada ratón tratado por LC o control se compararon. Se encontró que el tratamiento LC inhibió más de 70% del crecimiento del cáncer, mientras que el mismo tratamiento disminuyó a menos de 20% del desarrollo normal de los órganos y el peso corporal (Fig. 2
a
).
(a) LC inhibe selectivamente el crecimiento tumoral HepG2 en comparación con los tejidos normales. /C ratones desnudos BALB fueron
s.c.
. inoculado en la axila izquierda de cada ratón con células HepG2 (1 × 10
6 células /ratón). Cuando el tamaño del tumor alcanza 50-75 mm
3, los ratones desnudos fueron
i.p.
. inyectados con 400 mg /kg para consecutivos 15 días. ratones BALB /c normales fueron tratados como los ratones desnudos. Se detectaron cuerpo y peso de los órganos. B. W: peso corporal. La media + SD (n = 8). *
P Hotel & lt; 0,01, **
P Hotel & lt; 0,05,
frente
cada control, respectivamente. % De inhibición = peso corporal o peso de los órganos en el grupo LC-tratado /peso medio del cuerpo u órgano de peso en el grupo control × 100. (B) LC inhibe la proliferación celular HepG2 de una manera dependiente de la dosis. células HepG2 fueron tratadas con varias dosis de LC (1,25, 2,5, 5, 10 mM) durante 24 h o 48 h, la proliferación celular se detectó mediante el ensayo de MTS. La media + SD (n = 3). *
P Hotel & lt; 0,01, **
P Hotel & lt; 0,05, en comparación con el control. (C) LC induce la detención del ciclo celular en la fase Go /G1. células HepG2 fueron tratados con diferentes dosis de LC durante 24 h, el ciclo celular se detectaron mediante citometría de flujo. Se muestran resultados representativos. (D, e) LC induce ligeramente la muerte celular. las células HepG2 se expusieron a varias dosis de LC durante 24 h y apoptosis de las células se detectó por citometría de flujo. Resumen de los datos se muestra en (d), y su Representante imágenes de flujo se muestra en (e). ** P & lt; 0,05, versus control. (F) LC no afecta drásticamente la viabilidad celular de timocitos. timocitos de ratones fueron tratados con diferentes dosis de LC (2,5, 5, 10 mM) durante 24 h, la viabilidad celular se detectó mediante ensayo y número de células MTS fue recuento.
A continuación, se investigaron los efectos de la LC sobre la proliferación celular por el ensayo de MTS. Se encontró que dependiendo de la dosis LC disminución de la viabilidad de células HepG2 (Fig. 2
b
), asociada con la detención del ciclo celular en la fase G0 /G1 (Fig. 2
c
) y los bajos niveles de muerte celular (Fig. 2,
d
y
e
). Estos resultados implican que la inhibición de la proliferación celular inducida predominantemente LC pero ligeramente inducen la muerte celular en las células cancerosas. Finalmente, en los timocitos normales de ratón, LC tenía poco efecto sobre la viabilidad de timocitos y recuento de células dentro de 24 h de tratamiento (Fig. 2
f
). Estos resultados confirman que la LC induce selectivamente la citotoxicidad de células de cáncer en
in vitro
y
in vivo
.
tratamiento de LC induce la expresión de p21
CIP1 gen, ARNm y proteínas en las células cancerosas
a continuación se determinó el mecanismo molecular de cómo LC podría inhibir selectivamente el crecimiento del tumor. Para ello, el perfil de expresión génica se investigó en células HepG2 después de tres dosis de tratamiento LC (2,5, 5, y 10 mM) durante 24 h. se resumieron todos los genes regulados y hacia abajo-regulados (veces de incremento al menos 2 o disminución en todas las tres dosis) después del tratamiento LC (datos no mostrados). Entre los genes regulados, p21
CIP1 gen pero no p27
gen Kip1, dos importantes genes asociados con la regulación del ciclo celular, se encontró que era altamente y dependiente de la dosis expresadas (Fig. 3
a
). Los efectos del tratamiento sobre LC p21
CIP1 y p27
Kip1 niveles de mRNA se viene determinada por PCR en tiempo real. las células HepG2 se cultivaron con o sin LC (2,5, 5, 10 mM), ya sea para 12 h o 24 h, el ARN se prepararon a partir de las células. Después del tratamiento con LC, el p21
CIP1 nivel de ARNm aumentó dependiente de la dosis tanto a las 12 h y 24 h Tiempo y p21
CIP1 nivel de ARNm es relativamente más alta después de un tratamiento de 12 h de tratamiento de 24 h, mientras que p27
ARNm Kip1 no mostró mucho cambio en estos dos puntos de tiempo (Fig. 3
b
). Para determinar los niveles de proteína de p21
CIP1 y p27
kip1, ensayo de transferencia Western se realizó en las células HepG2 tratadas. Los resultados mostraron que después del tratamiento con diversas dosis de LC durante 48 h, p21
kip1 aumentaron los niveles de proteína en una forma dependiente de la dosis en líneas celulares de cáncer HepG2 (Fig. 3
c
,
izquierda
). estudio más dinámica en las células HepG2 mostró que después del tratamiento con LC (5 mM) durante 12, 24, 36 y 48 h, p21
CIP1 tiempo aumentó de forma dependiente (Fig. 3
c
,
medio). En SMMC7721 células tratamiento LC también aumentó la expresión de proteína p21 en una forma dependiente de la dosis similar a en las células HepG2 (Fig. 3
c
,
derecho
). Inesperadamente, la proteína p27 aumentó en ambos modales de la dosis y dependientes del tiempo después del tratamiento LC (Fig. 3
c
) a pesar de que p27
kip1 nivel de ARNm es estable, lo que sugiere que LC podría inhibir la degradación de p27 proteína. Para investigar más a fondo el efecto de la LC sobre los efectos aguas abajo de p21
CIP1 y p27
Kip1, se detectaron niveles de unphosphorylated Rb y Rb fosforilada (Phos-Rb). Se encontró que el tratamiento LC disminuyó ligeramente proteína Rb pero disminuyó dramáticamente proteína Phos-Rb (Fig. 3
d
). Estos resultados demostraron que LC induce selectivamente p21
cip1 expresión.
(a) LC induce p21
cip1 la expresión génica, pero no p27 y GAPDH. células HepG2 fueron tratados con LC (2,5, 5,0, 10 mM) durante 24 h; Se recogieron las células para el análisis de perfil de expresión génica. En el chip genético, hay 2 sondas para p21
CIP1 y 1 sonda para p27
Kip1. Todas las veces el aumento de p21
CIP1 y p27
Kip1 expresión génica
frente
de control se muestran. (B) dependiente de la dosis LC induce p21
expresión del ARNm de p27 CIP1 pero no
Kip1 en las células HepG2. células HepG2 se incubaron con diferentes concentraciones de LC (2,5, 5, 10 mM), ya sea para 12 h o 24 h; Se recogieron las células para el ensayo de ARNm de p21
CIP1 y p27
Kip1 por PCR en tiempo real. Las veces de aumento de la LC-tratada
se demostró control frente
. La media + SD (n = 3). *
P Hotel & lt; 0,01, **
P Hotel & lt; 0,05, comparado con el control. (C) LC dependiente de la dosis y dependiente del tiempo induce p21
cip1 la acumulación de proteínas en células de cáncer HepG2. HepG2 y SMMC7721 células fueron tratadas con varias dosis de LC durante 48 h o HepG2 células fueron expuestas a 5 mM de LC para 12, 24, 36, 48 h; proteínas p21 y p27 se detectaron por transferencia de Western. dependiente de la dosis (d) LC disminuye la fosforilación de Rb. células HepG2 fueron tratados con LC durante 48 h; Rb y Rb fosforilado se detectándose por Western blot. Se muestran las imágenes típicas del Oeste (izquierda) y se cuantificó la intensidad de la banda (a la derecha).
tratamiento LC aumento de la acetilación de histonas en células cultivadas
Sobre la base de la teoría de Warburg, la hipótesis de que el suplemento de LC en las células cancerosas perturbaría la acetilación de las proteínas. Los informes anteriores han demostrado que la acetilación de histonas por inhibidores de HDAC inducida selectivamente p21
CIP1 expresión, pero no p27
Kip1 [14], [15]. Nuestros resultados han demostrado que la LC induce selectivamente p21
cip1 expresión, pero no p27
kip1 (Fig. 2). Por lo tanto, se investigaron los efectos de la LC en la acetilación de histonas y la acumulación de proteínas de lisina acetilada en células cultivadas. HepG2, SMMC-7721 células cancerosas y timocitos de ratones fueron tratados con LC. Como se muestra en la Fig. 4,
a
y
b
, LC aumentó la acetilación de las histonas H3 y H4 en una dosis-y tiempo-dependiente en las células cancerosas HepG2. LC también podría inducir la acumulación de proteínas de lisina acetilada, tanto en las células cancerosas SMMC-7721 y HepG2 (Fig. 4
c
). En la cultura de timocitos primaria, dependiente de la dosis LC aumentó la acetilación de histonas similar al de las células cancerosas (Fig. 4
d
). Estos resultados sugieren que el tratamiento LC aumentó proteína acetilación (histona) en células cultivadas.
(a) LC induce dosis-dependiente de la acumulación de histonas acetiladas. las células HepG2 se expusieron a LC (1,25, 2,5, 5,0 mM) durante 48 h, acetilado histonas H3 y H4 se detectaron por transferencia de Western. GAPDH se utilizó como control de carga. (B) LC induce tiempo de forma dependiente de la acumulación de histonas acetiladas. células HepG2 fueron tratados con LC (5 mM) para diferentes puntos de tiempo (12 h, 24 h, 36 h, 48 h) y se detectaron histonas acetiladas. (C) tratamiento LC aumenta la acumulación de proteína de lisina acetilada en HepG2 humana y células de cáncer de SMMC-7721. HepG2 humanos y células SMMC-7721 fueron tratados con LC (10 mM) durante 12 h, y luego se recogieron las células por transferencia de Western para detectar proteínas acetilados con anticuerpo de lisina acetilada. (D) LC aumenta la dosis depentently acumulación de histonas acetiladas en timocitos de ratón. timocitos de ratón fueron tratados con LC durante 24 h, la acetilación de histonas se detectó por Western blot. Se utilizó buty (1 mM) como un control positivo.
LC inhibe directamente la actividad de la HDAC
in vitro Opiniones y en células cultivadas
Desde LC induce la acetilación de histonas, que luego investigó si la LC podría afectar directamente a las actividades de la HDAC. Se estableció por primera vez un modelo computacional de acoplamiento. La estructura cristalina de una proteína HDAC-como de la bacteria hipertermofílico
Aquifex aeolicus Vaya con el inhibidor de HDAC TSA ha informado [16]. La estructura muestra la posición del átomo de zinc esencial que está implicado en la catálisis de la clase I /II HDAC. La estructura química de LC y el modelo de acoplamiento de complejo (L-carnitina y HDAC) se muestran en la Fig. 5,
a
y
b
, y su interacción CDOCKER Energía y Energía de enlace eran -29,01 -85,79 y kcal /mol, respectivamente. Higo. 5
b
muestra que un átomo de oxígeno del anión carboxilo y un átomo de oxígeno de las interacciones de coordinación con iones hidroxilo forma de zinc, con distancias de 2.696 Å y 2.640 Å, respectivamente. Este modelo de interacción es diferente en comparación con ACT ligando original con sus dos átomos de oxígeno del anión carboxilo coordinada de cinc iónico. El anión carboxilo forma un enlace de hidrógeno débil con Gly310, con la distancia de 2.966 Å, y el hidroxilo forma un enlace de hidrógeno con Tyr312, con la distancia de 1.839 Å. Además, el (CH
3)
3 N
grupo + situado en una puerta de entrada hidrófobo y interactuado con la superficie hidrófoba compuesta de las cadenas laterales de Leu21, Ile100, Phe152, Phe208 y Leu275. Además, el grupo formado interacciones cationes π con los anillos de benceno de Phe152 y Phe208. Este modelo predice que la CL tiene el potencial para interactuar con los sitios activos de la HDAC.
(a) La estructura química de la LC se muestra. Como se muestra en la Fig. Como se muestra en la Fig.