Extracto
El cáncer de próstata (CaP) la mortalidad se debe a tumores altamente agresivos que se caracterizan por la metástasis y la resistencia a la terapia, y esta agresividad es mediada por numerosos factores, incluyendo la activación de las vías de supervivencia estrés en el microambiente tumoral pro-inflamatoria. LEDGF /p75, conocido también como el autoantígeno DFS70, es una transcripción estrés co-activador implicado en el cáncer, el VIH-SIDA, y la autoinmunidad. Esta proteína es el blanco de autoanticuerpos en algunos subconjuntos de pacientes con CaP y condiciones inflamatorias, así como en algunos individuos aparentemente sanos. LEDGF /p75 se sobreexpresa en CaP y otros tipos de cáncer, y promueve la resistencia a la muerte celular inducida por la quimioterapia a través de la transactivación de las proteínas de supervivencia. Presentamos en este estudio que la sobreexpresión de LEDGF /p75 en células de CaP atenúa la necrosis inducida por el estrés oxidativo, pero no la apoptosis inducida por estaurosporina. Este hallazgo es coherente con la observación de que mientras que LEDGF /p75 se escindió con fuerza en células apoptóticas en un fragmento p65 que carece de actividad de supervivencia estrés, se mantuvo relativamente intacto en las células necróticas. La sobreexpresión de LEDGF /p75 en células de CaP condujo a la regulación por incremento de los niveles de transcripción y proteínas de la tiol-oxidorreductasa ERp57 (también conocida como grp58 y PDIA3), mientras que su agotamiento llevó a ERp57 downregulation transcripción. ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina y la transcripción reportero mostraron LEDGF /p75 unión y la transactivación del promotor ERp57, respectivamente. El análisis inmunohistoquímico reveló significativamente elevada co-expresión de estas dos proteínas en los tejidos de tumor de próstata clínicos. Nuestros resultados sugieren que LEDGF /p75 no es un inhibidor de la apoptosis, sino más bien un antagonista de la necrosis inducida por el estrés oxidativo, y que su sobreexpresión en CaP conduce a ERp57 upregulation. Estos hallazgos son de importancia para aclarar el papel del /p75 vía de supervivencia estrés LEDGF en el CaP
Visto:. Un Basu, Cajigas Du-Ross CK, Rios Colon-L, M Mediavilla-Varela, Daniels-Wells TR, Leoh LS, et al. (2016) LEDGF /p75 La sobreexpresión atenúa el estrés oxidativo inducido por necrosis y regula al alza la oxidorreductasa ERp57 /PDIA3 /grp58 en el cáncer de próstata. PLoS ONE 11 (1): e0146549. doi: 10.1371 /journal.pone.0146549
Editor: Mohammad Saleem, Hormel Institute, Universidad de Minnesota, Estados Unidos |
Recibido: 8 Septiembre, 2015; Aceptado: 19 de diciembre de 2015; Publicado: 15 Enero 2016
Derechos de Autor © 2016 Basu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH 5R25GM060507, 5P20MD001632 y 5P20MD006988, y por Loma Escuela de Medicina del Centro de disparidades de Salud y Medicina Molecular de la Universidad Linda. CKCD, MMV, LRC, y SRM fueron apoyados por becas de formación de postgrado cargo a la subvención R25GM060507. SAM fue apoyada por una investigación de prácticas de formación médica en virtud de concesión 5P20MD006988. HB es empleado de una empresa comercial de Novartis Oncología Farmacéutica. Los proveedores de fondos (NIH, Novartis) prestado apoyo en forma de salarios para los autores (CAC, CKCD, MMV, LRC, SRM, SAM, HB), pero no tuvo ningún papel adicional en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis, la toma publicar, o la preparación del manuscrito. Las funciones específicas de estos autores se articulan en la sección "autores contribuciones"
Conflicto de intereses:. Uno de los autores, HB, es empleado por una empresa comercial de Novartis Oncología Farmacéutica. Novartis prestado apoyo en forma de salario por HB, pero no tuvo ningún papel adicional en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Esta afiliación comercial no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El cáncer de próstata (CaP) es la segunda causa principal de muerte por cáncer entre los hombres en el Estados Unidos, que afecta de manera desproporcionada a los hombres afroamericanos en comparación con otros grupos raciales /étnicos [1]. la iniciación y progresión del CaP se ha relacionado con la inflamación crónica y un aumento del daño oxidativo en esta glándula [2,3]. Como mecanismo de la supervivencia en este entorno estresante, células de CaP activan las vías de supervivencia de estrés que promueven propiedades agresivas tumorales, incluyendo la resistencia a la muerte celular y la quimioterapia [4-6]. Lente epitelio factor de crecimiento derivado de 75 kD (LEDGF /p75) es una oncoproteína emergente que promueve la supervivencia de células de mamífero en presencia de factores de estrés ambiental que aumentan el daño oxidativo celular [7-14]. También conocido como p75 transcripción co-activador, PC4 y proteínas que interactúan SFRS1 (PSIP1), y denso autoantígeno moteado fino de 70 kD (DFS70), esta proteína multifuncional ha ganado importancia en el estudio de cáncer, VIH-SIDA, la autoinmunidad, y el ojo enfermedad (revisado en refs. [9,10]). A medida que el celular co-factor clave para la integración del VIH en la cromatina de acogida, LEDGF /p75 ha atraído considerable atención en la última década, y vigorosos esfuerzos están actualmente en forma de apuntar a esta proteína para el tratamiento del VIH-SIDA [15].
El papel emergente de LEDGF /p75 como el estrés oncoproteína ha sido descubierto por varios estudios de nuestro grupo y otros que documentan su sobreexpresión en diversos tipos de cáncer humano, y su capacidad para inducir características asociadas con la agresividad del tumor en las células del cáncer [10 -14,16-19]. Además, LEDGF /p75 se expresa de forma aberrante en las leucemias humanas, e interactúa con el complejo de transcripción Menin-MLL (leucemia de linaje mixto) para activar la expresión de genes y la leucemia [20,21] asociados con el cáncer. El potencial de LEDGF /p75 como un objetivo prometedor para el tratamiento del cáncer se ha destacado por estudios que muestran que su inhibición o regulación a la baja atenúa las propiedades agresivas de las células del cáncer [14,17,19,21,22]
.
Nuestro grupo y otros han demostrado previamente que LEDGF /p75 es el blanco de una respuesta de autoanticuerpos en un subconjunto de pacientes con CaP, así como en individuos aparentemente sanos y pacientes con diversas condiciones inflamatorias crónicas ([23], también revisado en refs. [9, 10]). También se informó de que LEDGF /p75 se sobreexpresa en los tumores de próstata y que esta sobreexpresión promueve CaP resistencia de las células a la muerte celular lisosomal independiente de caspasas inducida por la administración de los taxanos docetaxel (DTX), el estándar de oro para la quimioterapia CaP [11,13,23] . Curiosamente, la regulación positiva LEDGF /p75 se produce naturalmente durante la selección de células de CaP DTX resistente [24]. En concordancia con estas observaciones, varios estudios mostraron que la sobreexpresión LEDGF /p75 en células de cáncer promueve la resistencia a fármacos que inducen daño oxidativo del ADN y la muerte celular lisosomal [12-14,18,25], lo que lleva un grupo para referirse a esta proteína como una "guardián de la estabilidad lisosomal en el cáncer humano" [14]. La tensión de las funciones de protección de LEDGF /p75 parecen estar mediados por su capacidad para participar en la reparación del ADN y transcriptionally activar las proteínas de supervivencia de estrés tales como la proteína de choque térmico 27 (Hsp27), peroxiredoxin 6 (PRDX6), y factor de crecimiento vascular endotelial C (VEGF -C) [18,26-30].
Hemos observado previamente que la sobreexpresión LEDGF /p75 en células de CaP no protege contra la apoptosis dependiente de caspasa provocada por TRAIL (factor de necrosis tumoral relacionados con la apoptosis ligando que induce), una inductor de la muerte del receptor vía apoptótica [13] bien caracterizado. TRAIL, estaurosporina (STS), y otros inductores de la apoptosis conduce a la caspasa-3 escisión mediada de LEDGF /p75 en un fragmento p65 prominente que carece de actividad pro-supervivencia y aumenta la muerte de las células en condiciones de estrés [22,23,30]. Además, la escisión de la caspasa-3 mediada de LEDGF /p52, la variante corta de corte y empalme alternativo de LEDGF /p75, genera un fragmento de p35 que abroga la actividad transcripcional de LEDGF /p75 [30]
.
Debido a su escisión y la inactivación durante la apoptosis, LEDGF /p75 no puede actuar como un inhibidor de la apoptosis clásica sino más bien como un protector de aguas arriba del ADN y la integridad lisosomal bajo un estado aumentado de estrés oxidativo celular. Por lo tanto, nos centramos en el presente estudio que investiga la capacidad de LEDGF /p75 para proteger las células de CaP contra la necrosis inducida por el estrés oxidativo, y contribuir a la regulación positiva de la proteína del retículo endoplasmático de 57 kD (Erp57) en el CP. ERp57, también conocida como proteína regulada de glucosa de 58 kD (grp58) y familia de proteínas disulfuro isomerasa Un miembro 3 (PDIA3), es una multi-funcional tiol oxidorreductasa y una proteína chaperona responsable de mantener el plegamiento apropiado de las glicoproteínas recién sintetizados [31 , 32]. Nuestros resultados indican que la sobreexpresión LEDGF /p75 atenúa oxidativo muerte celular necrótica inducida por el estrés y contribuye a ERp57 upregulation en el contexto de CaP.
Materiales y Métodos
Los estudios con anticuerpos humanos, de células de cáncer líneas y tejidos de la próstata se realizaron bajo la aprobación de la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Loma Linda.
líneas celulares, anticuerpos y reactivos
el metastásico líneas celulares de cáncer de próstata DU145 (Cat.#HTB -81) y PC3 (Cat.#CRL-1435), el de próstata línea K-ras transformado de células epiteliales RWPE-2 (Cat.#CRL-11610), derivada de la línea normal de las células de próstata RWPE-1, y la célula de osteosarcoma línea U2OS (Cat.#HTB-96) se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Las células fueron cultivadas según lo recomendado por los proveedores en una incubadora humidificada con 5% de CO
2 a 37 ° C. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anticuerpos monoclonales de ratón anti-β-actina (1: 5000, Sigma-Aldrich) y anti-ERp57 (1: 200, Enzo Life Sciences); policlonal de conejo anti-LEDGF /p75 (1: 1000, Bethyl Laboratories Inc); policlonal de cabra anti-Lamin B anticuerpo C-20 (1: 1000 de Santa Cruz Biotechnology.); autoanticuerpo humano a la topoisomerasa I (1: 100, Topo I), una especie de regalo del Dr. Ing M Tan (Instituto de Investigación Scripps, La Jolla, CA); anti-LEDGF /p75 anticuerpo policlonal de conejo Scripps-Ab5087 (1: 1000), también donado por el Dr. Ing M. Tan; y peroxidasa de rábano picante (HRP) marcado con anticuerpos IgG secundarios (1: 5000, ThermoFisher Scientific). peróxido de terc-butilo de hidrógeno (TBHP), un peróxido orgánico, se adquirió de Sigma-Aldrich. STS y N-acetil-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-metil-cumarina (Ac-DEVD-AMC, caspasa-3 fluorogénico /7 sustrato) fueron adquiridos de Axxora. La amplia cetona inhibidor de caspasa benzylocarbonyl-Val-Ala-Asp-fluorometil (z-VAD-fmk) se adquirió de Biomol Internacional.
muerte celular y la viabilidad Ensayos
La muerte celular se indujo por tratamiento con los agentes citotóxicos TBHP (50, 75, 100 y 150 mM) o STS (4 M) durante un máximo de 24 h. En algunos experimentos las células se preincubaron con 100 mM de z-VAD-fmk durante 1 h antes de la exposición a estos agentes. La morfología celular se visualizó en un microscopio Olympus IX70 equipado con modulación Hoffmann Contraste (Olympus americano) y un sistema de imágenes para comer digital (instrumentos de diagnóstico). Para determinar la viabilidad celular, las células sembradas en placas de 96 pocillos (3 x 10
4 células por pocillo) fueron tratados con TBHP o STS, se lavaron con tampón fosfato salino (PBS) y se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 1 hora a 4 ° C. Las células fueron lavadas tres veces con agua destilada y solución Accustain Crystal Violet (Sigma-Aldrich) (1: 4) se añadió a cada pocillo seguido de incubación durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron con agua destilada para eliminar el exceso de tinte y después se secaron a temperatura ambiente. ácido acético (10% v /v) se añadió a cada pocillo durante 10 minutos y la absorbancia se midió a 570 nanómetros (nm) utilizando un lector de microplacas μQuant (Bio-Tek Instruments).
DAPI (4 ', se utilizó 6-diamidino-2-fenilindol) tinción para visualizar la cromatina condensada o fragmentada en células tratadas con TBHP o STS. Brevemente, se sembraron células (3 x 10
4) en 8 pocillos Lab-Tek
® Permanox
® cámara de diapositivas (ThermoFisher Scientific), tratados después de 24 h con los diferentes agentes citotóxicos, se lavaron con PBS y, a continuación fija y se permeabilizaron con una solución de metanol /acetona (3: 1 v /v) durante 10 minutos a -20 ° C. La solución de fijación se retiró y los portaobjetos se incubó a temperatura ambiente durante 5-10 minutos para el secado. Los cubreobjetos se montaron utilizando medio de montaje Vectashield que contiene DAPI (Vector Laboratories). DAPI y se visualizó usando Olympus BX50 microscopio de fluorescencia y las imágenes se obtuvieron con un sistema de punto de imagen (instrumentos de diagnóstico).
Se realizaron ensayos de actividad de caspasa como se describe anteriormente [30]. Brevemente, las células se sembraron en placas de 96 pocillos negras, de fondo transparente (3 x 10
4 células por pocillo). A la conclusión del tratamiento con TBHP o STS, las células se incubaron con 50 l de tampón caspasa 3X [HEPES 150 mM pH etileno 7,4, cloruro de sodio 450 mM, cloruro 150 potasio, mM de cloruro de 30 magnesio, 1,2 mM de glicol-bis (2 -aminoethylether) -
N
,
N
,
N '
,
N' tetraacético gratis (EGTA), sacarosa al 30%, 10% CHAPS, y 1,5% NP-40], en presencia de ditiotreitol 30 mM (DTT), phenylmethanesulphonylfluoride 3 mM (PMSF), y 75 mM del sustrato peptídico fluorogénico Ac-DEVD-AMC (caspasa-3/7) para 2 h a 37 ° C. Esto fue seguido por la incubación de las células a temperatura ambiente durante 12 h, y la medición de la absorbancia a 360 nm de excitación de y emisión de 460 nm en una microplaca fluorescente lector FLx800 (Bio-Tek Instruments). Doblar la actividad se determinó mediante la normalización a uno los valores de absorbancia de las células no tratadas, de control.
Medición de especies reactivas del oxígeno
La generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) se evaluó sobre la base de la oxidación intracelular de 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCFH-DA, Invitrogen) para formar el compuesto fluorescente 2', 7'-dicholorofluorescein (DCF). Las células se sembraron en una placa de 6 pocillos a una densidad de 3 x 10
4 células por pocillo, se cultivaron durante 24 horas, y luego tratados con TBHP o STS para un máximo de 12 h. DCFH-DA (0,5 M) se añadió luego a las células, seguido de incubación durante 20 minutos a 37 ° C. Las células se lavaron con PBS y después se resuspendieron en 0,5 ml de PBS. La intensidad de fluorescencia se determinó mediante citometría de flujo usando un citómetro FACSCalibur (BD Biosciences).
cuantitativa en tiempo real PCR
Quantitative PCR en tiempo real (qPCR) se llevó a cabo como se describe anteriormente [24]. Brevemente, el ARN total fue extraído de las células utilizando el RNeasy más mini kit (Qiagen). ARN (0.5μg) fue trancribed inversa en ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc iScript (BioRad). qPCR se realizó en la MyiQ en tiempo real sistema de detección de PCR con cebadores utilizando iQ SYBR Green Supermix (BioRad) según las recomendaciones del fabricante. Las secuencias de cebador para LEDGF /p75 y ERp57 fueron diseñados utilizando el software Primer3 y sintetizados comercialmente por Integrated DNA Technologies (IDT) (Tabla 1). valores de ARNm diana se normalizaron usando gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) mRNA y los datos se expresaron en relación a los valores normalizados de los controles correspondientes. Las muestras fueron analizadas en tres experimentos independientes, cada uno por triplicado.
Generación de células de CaP con sobreexpresión estable o el agotamiento de LEDGF /p75
ADNc LEDGF /p75 fue clonado previamente en nuestro laboratorio en el plásmido de expresión de mamíferos pcDNA3.1 (Invitrogen) [22]. En resumen, tanto pcDNA3.1 vector vacío y pcDNA3.1-
LEDGF /p75
plásmidos se transfectaron en células RWPE-2 y PC3 utilizando el método de Fugene 6 (Roche). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se trataron con tripsina y se sembraron en placas de 6 pocillos. La selección de transfectantes estables se consiguió mediante la adición de G418 (330μg /ml) (ThermoFisher Scientific) a los cultivos celulares. Las colonias supervivientes se expandieron y la expresión de LEDGF /p75 en las células transfectadas de forma estable con el vector vacío o pcDNA3.1-
LEDGF /p75
fue confirmada por qPCR e inmunotransferencia.
células PC3 con sobreexpresión estable o el agotamiento de LEDGFp75 utilizando vectores virales fueron donaciones generosas de Profesores Zeger Debyser y Rik Gijsbers (Universidad Católica de Lovaina, Bélgica). Sobreexpresan las células PC3 se generaron mediante la transducción con vectores retrovirales que codifican cDNA de longitud completa LEDGF /p75 como se ha descrito anteriormente [24,33] células PC3 con depleción estable de LEDGFp75 se generaron utilizando intensificado lentiviral interferencia de ARN basado en vectores como se describe anteriormente [34] . En pocas palabras, se utilizó horquilla corta (sh) ARN para derribar de forma estable mientras LEDGFp75 shSCR sirvió como control no interferente shRNA. Se seleccionaron las células transducidas con zeocina (200 mg /ml) y LEDGF /sobreexpresión de p75 o el agotamiento de los clones seleccionados se evaluó por qPCR e inmunotransferencia.
ARN de interferencia mediada desmontables de LEDGF /p75 en células de CaP
caída transitoria de LEDGF /p75 en células de CaP se logró mediante la entrega de ARN inhibidores cortas específicas (siRNAs) en las células usando el método de Oligofectamine (Invitrogen, Life Technologies), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, LEDGF /p75 siRNA (siLEDGF /p75) y un dúplex revueltos siRNA (SISD, control negativo) fueron diseñados como se describe anteriormente [24] y sintetizadas por IDT. La secuencia /p75 siLEDGF correspondía a los nucleótidos 1340-1360 (5'-AGACAGCAUGAGGAAGCGAdTdT-3 ') con respecto al primer nucleótido del codón de iniciación del marco de lectura abierto LEDGF /p75. Esta secuencia corresponde a una región en el C-terminal de LEDGF /p75 que no es compartida por su corta variante de empalme LEDGF /p52 alternativa. La secuencia de SISD era 5'GCGCGCUUUGUAGGAUUCGdTdT-3 '. Las células fueron transfectadas con siRNAs 40 nM y se cultivaron durante 72 horas antes del análisis.
células de CaP Docetaxel resistente
El docetaxel (DTX) PC3 -resistant (PC3-DR) y DU145 (DU145-DR líneas de células) fueron desarrollados mediante el cultivo de las células PC3 y DU145 en presencia de DTX en un modo de escalada de dosis [35]. Las células que sobrevivieron al cultivo inicial en 1 nM DTX se pasaron 4 veces antes de aumentar la concentración de DTX a 5,5 nM y posteriormente a 11 nM. Las células resistentes se mantuvieron continuamente en 11 nM DTX.
Análisis de inmunotransferencia
La inmunotransferencia se llevó a cabo esencialmente como se describe anteriormente [24]. Brevemente, las proteínas en lisados de células enteras de células de CaP se separaron mediante SDS-PAGE (NuPAGE 4-12%, ThermoFisher Scientific) seguido de la transferencia a difluoruro de polivinilo (PVDF) membranas (Millipore). Las membranas fueron bloqueadas con solución de leche en polvo al 5% preparada en tampón TBS-T (20 mM Tris-HCl, pH 7,6, NaCl 140 mM, 0,1% de Tween 20) y se sondaron con anticuerpos primarios. Después de varios lavados con TBS-T, las membranas se incubaron con peroxidasa de rábano picante apropiada (HRP) conjugado con anticuerpos secundarios y se lavó de nuevo varias veces con TBS-T. Las bandas de proteínas se detectaron mediante quimioluminiscencia mejorada (ThermoFisher Scientific Pierce).
Kinetworks ™ Estrés /proteína de choque térmico de pantalla
El estrés /Heat Shock Protein pantalla Kinetworks ™ (Kinexus Bioinformática Corporation) se utilizó para cuantificar y comparar los niveles de expresión de 25 diferentes proteínas de estrés y choque térmico en inmunotransferencias de lisados de células enteras de RWPE-2 células que sobreexpresan de forma estable células LEDGF /p75 y de control transfectadas de forma estable con el vector pcDNA vacío. Esta plataforma fue un servicio de matriz basada en anticuerpos para la detección simultánea de múltiples proteínas de estrés en los lisados celulares que estaba disponible en el mercado en el momento en que iniciamos este estudio. Los lisados celulares se probaron por inmunotransferencia frente a un panel de anticuerpos de proteínas de choque de esfuerzo /calor [36]. procedimientos de inmunotransferencia y cuantificación de inmunoreactividad proteína de estrés individuales se realizaron por Kinexus.
basada en luciferasa de transcripción del reportero ensayos
ERp57 promotor (
ERp57pr
) reportero ensayos de transcripción basados en la luciferasa se realizado como se describe anteriormente [30]. Brevemente, RWPE-2, PC3 y DU145 células fueron co-transfectadas con el vector de expresión que codifica LEDGF /p75 (pcDNA3.1-
LEDGF /p75
) o vector vacío (pcDNA3.1), y el reportero vector (pLightSwitch vector vacío, o pLightSwitch-
ERp57pr
) (Conmutación de Genómica /activo Motif). A las 48 horas después de la transfección, se lisaron las células y ensayos de luciferasa se realizaron utilizando el Luciferase Assay Reagent LightSwitch (Conmutación de Genómica /Activo Motif). U2OS células fueron transfectadas con un vector de expresión LEDGF /p75 diferente, pCruzHA-
LEDGF /p75
, o está vacío pCruzHA, y el ensayo de luciferasa en estas células se realizó utilizando el sistema de ensayo de luciferasa de Promega. unidades de luz relativas se obtuvieron en un luminómetro MicroLumatPlus Lb 96V (Berthold Tech), y los valores de luciferasa se normalizaron a la concentración de proteína de los lisados de las células co-transfectadas con vectores vacíos y pLightSwitch-
ERp57pr
. Estudiante de
t-test
análisis se realizó utilizando Microsoft Excel. Los experimentos se repitieron al menos tres veces por triplicado.
Ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina
Estos ensayos se llevaron a cabo esencialmente como se describe anteriormente [37]. Brevemente, las células PC3 y U2OS se fijaron en 1% de formaldehído durante 10 minutos y se sometieron a inmunoprecipitación de cromatina de ensayo (CHIP) utilizando el kit de chip-expresa enzimática (Active Motif). Anti-LEDGF /anticuerpos p75 (A300-848A, Bethyl) se utilizó para inmunoprecipitar los complejos de proteínas-cromatina. cromatina inmunoprecipitada fue entonces digerido enzimáticamente. PCR se realizó usando cebadores específicos para amplificar el promotor ERp57 (Tabla 1). Tanto G (IgG) de anticuerpos y la entrada de la cromatina inmunoglobulina no específica se utilizaron como controles.
inmunohistoquímica (IHC) El análisis de microarrays de tejidos de cáncer de próstata
CaP humano microarrays de tejidos (TMA), disponible en el mercado se utilizaron de Novus Productos Biológicos y nos Biomax Inc. para el análisis IHC de LEDGF /p75 y ERp57. Tres CaP TMA diferentes (dos de los Estados Unidos Biomax Inc. y uno de Novus Biologicals) se utiliza para aumentar el tamaño de la muestra. En resumen, hemos adquirido desde US Biomax la PR807 y PR807a TMA, cada uno de los núcleos individuales que contienen de 3 casos libres de enfermedad de tejido normal, 7 casos de tejidos adyacentes normales, y 50 casos de tejidos con CaP. También utilizamos el IMH-303 TMA (Novus Productos Biológicos), que contiene 40 núcleos de tejido de CaP y 9 tejidos adyacentes normales emparejados. Los fabricantes de estos TMA provistos sólo limitan la información básica clinicopatológica (edad, sexo, estadio tumoral en algunos casos) corresponde a los núcleos de tejido, sin identificación del paciente. No había información disponible en la raza o el origen étnico del paciente, tipo de tratamiento, las instituciones que recogen los tejidos, el seguimiento de rutinas, y las técnicas de manipulación de tejidos. Los pacientes limitada datos de seguimiento relacionados con el TMA nos impidieron realizar un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier y otra correlación clínica análisis.
TMA fueron teñidas utilizando una i6000 biogénica de auto-Stainer (BioGenex Corporation) como se ha descrito anteriormente [11]. En pocas palabras, embebidos en parafina secciones de tejido en los TMA diapositivas se deparaffinized y los portaobjetos se someten a recuperación del antígeno. La actividad peroxidasa endógena se inactivó mediante tratamiento con peróxido de hidrógeno al 3% en 10% de metanol, y Power Block
© reactivo de bloqueo universal (Biogenex Corp.) se usó para bloquear la unión de proteína no específica. IHC tinción de LEDGF /p75 se realizó utilizando el anticuerpo policlonal de conejo Scripps-Ab5087, que es específico para LEDGF /p75 y no reacciona con la variante de empalme corto LEDGF /p52 [11]. IHC tinción de ERp57 se realizó utilizando el anticuerpo monoclonal de ratón anti-ERp57 (Enzo Life Sciences). TMA diapositivas se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios, se lavaron y después se incubaron con Multi-link
© anticuerpo secundario biotinilado (Biogenex Corp.), seguido de incubación con peroxidasa Label supersensible estreptavidina acoplada
© (Biogenex Corp.). La inmunotinción se detectó por la activación de peroxidasa de la 3-amino-9-ethycarbazole (AEC) cromógeno (Biocare Médica). TMA se counterstained ligeramente con hematoxilina (Sigma) y se monta con Permount (ThermoFisher Scientific). Para la muestra de control negativo, el anticuerpo primario se omitió y se sustituyó con el conejo o suero pre-inmune del ratón. Las secciones de tejido fueron examinados bajo un microscopio Olympus BX50, y las imágenes fueron adquiridas mediante un Spot RT3
TM cámara digital (instrumentos de diagnóstico).
inmunote~nido TMA se anotó ciegamente para LEDGF inmunorreactividad /p75 por un patólogo certificado por la junta (HORA). Se utilizó un sistema de puntuación de 4 niveles (0 = negativo, 1 = débil, 2 = moderada, 3 = fuerte) para evaluar la intensidad de la tinción. Se consideró que los tejidos con puntuaciones de 0-1 a tener baja intensidad de tinción, mientras que no se consideran tejidos con puntuaciones de 2-3 para tener una alta intensidad de tinción. Las muestras de tejido que mostraron baja calidad fueron excluidos de los análisis. Estos estudios se realizaron en proceso de aprobación por la Junta de Revisión Institucional
El análisis estadístico de los datos IHC y su relación con los resultados clínicos de los pacientes se realizó utilizando el paquete de software SAS. (versión 9.2; SAS Institute). Para facilitar el análisis estadístico, las muestras de tejido se agruparon en dos categorías basadas en sus puntuaciones. tinción "Bajo" se determinó como agrupados puntuaciones de intensidad de tinción de 0 y 1, mientras que la tinción de "alto" se había acumulado puntuaciones de 2 y 3. Correlación entre los niveles de expresión de LEDGF /p75 y ERp57 en el tumor y el control (libre de enfermedad + normales normal adyacente tejidos) se determinó mediante la prueba de Chi-cuadrado. Los valores de probabilidad por debajo de 0,05 se consideraron significativos.
Resultados
LEDGF /sobreexpresión de p75 atenúa oxidativo necrosis inducida por el estrés, pero no la apoptosis inducida por estaurosporina en células de CaP
TBHP, una mayor homólogo estable de peróxido de hidrógeno que se utiliza ampliamente en modelos de estrés inducida por necrosis oxidativo [38-40], y los STS inductor de apoptosis fueron expuestos a células de CaP para activar necrótico y la muerte celular por apoptosis, respectivamente. Ambos agentes reducen la viabilidad celular en la línea celular de próstata RWPE-2 (Fig 1A). Sin embargo, mientras que las células tratadas con STS presentan las características clásicas de apoptosis se caracteriza por la formación de ampollas y la condensación de la cromatina y la fragmentación, las células tratadas con TBHP mostraron la típica morfología necrótica que se caracteriza por hinchazón citoplasmática y núcleos condensados sin fragmentación de la cromatina (Figura 1B y 1C). El tratamiento con STS condujo a un aumento dependiente del tiempo en la actividad de caspasa-3, consistente con la inducción de apoptosis, mientras que el tratamiento con TBHP no condujo a la caspasa-3 de activación (Fig 1D). Lamin B, un clásico sustrato de la caspasa-3, se escindió en su firma fragmento apoptótico de 45 kD durante STS inducida por apoptosis, pero no durante la muerte celular inducida por TBHP (Fig 1E), coherente con nuestra observación anterior de que esta proteína no se escinde durante la muerte celular necrótica [41]. En conjunto, estos resultados fueron consistentes con la evidencia disponible que TBHP es un fuerte gatillo de la muerte celular necrótica inducida por el estrés oxidativo [38-40].
A. RWPE-2 células fueron tratadas con 100 mM TBHP o 4 M STS para inducir necrosis o apoptosis, respectivamente. La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de cristal violeta. B. Los cambios en la morfología celular asociados con necrosis o apoptosis en las células RWPE-2 tratados con TBHP o STS, respectivamente, durante 24 horas. C. morfología nuclear de RWPE-2 células tratadas (como en el panel B) visualizados por tinción con DAPI. D. actividad de caspasa 3 se midió después del tratamiento con TBHP o STS. E. Escisión del Lamin B en su firma apoptótica 45 kD fragmento se detectó por inmunotransferencia en RWPE-2 células tratadas con STS pero no en las células tratadas con TBHP. Las líneas indican las bandas correspondientes a las proteínas intactas y que la flecha indique el fragmento de escisión. F. inmunotransferencia que muestra la sobreexpresión estable de LEDGF /p75 en RWPE-2-
LEDGF /p75
clones en comparación con RWPE-2
Vec
(pcDNA3.1 vacío vector) clones y RWPE- untransfected 2 células. ensayo de violeta viabilidad G. Crystal que muestra que la sobreexpresión de LEDGF /p75 en RWPE-2 células promueve la resistencia a la muerte celular inducida por TBHP pero no STS. Cada gráfico representa la media de al menos 3 experimentos independientes realizados por triplicado (*
P. & Lt; 0
05)
.
valores P se determinaron en comparación con el control de Student utilizando
t-test
. Los datos representan la media de al menos experimentos independientes.
Para determinar si LEDGF /p75 antagoniza la necrosis inducida por TBHP, generamos RWPE-2 células que sobreexpresan de forma estable esta proteína (Figura 1F). Estas células muestran una atenuación significativa de la muerte celular necrótica inducida por TBHP comparación con las células transfectadas de forma estable con el vector pcDNA3.1 vacío (Fig 1G). Como era de esperar, la sobreexpresión LEDGF /p75 no atenúa la apoptosis inducida por la STS (Figura 1G), muy probablemente debido a su escisión por caspasas [22,23,30].
reproducido y ampliado estos hallazgos en la médula células de CaP metastásico, PC3. Al igual que en nuestras observaciones en RWPE-2 células, el tratamiento de las células PC3, ya sea con o STS TBHP redujo la viabilidad celular de una manera dependiente del tiempo (Fig 2A). Como era de esperar, zVAD- FMK, un inhibidor de las caspasas de amplio atenuado la apoptosis inducida por la STS, pero no tuvo efectos inhibitorios sobre la necrosis inducida por TBHP (figura 2A). Aunque zVAD-fmk atenuó significativamente la apoptosis mediada por STS, no inhibió completamente la muerte celular como el tiempo progresó (Fig 2A), consistente con observaciones anteriores de que STS induce la muerte celular independiente de caspasas o necroptosis en condiciones de caspasa-comprometidos en ciertas líneas celulares [ ,,,0],42,43]. De acuerdo con nuestras observaciones en RWPE-2 células, las células PC3 tratadas con STS exhibieron la formación de ampollas en característica y extensa condensación de la cromatina y fragmentación asociada con la apoptosis, mientras que las células tratadas con TBHP exhiben hinchazón citoplasmática sin fragmentación nuclear (Figura 2B y 2C). Como era de esperar, el tratamiento con STS, pero no con TBHP, condujo a la activación de caspasa-3 (Fig 2D).
A. células PC3 se trataron con 100 TBHP M o 4 M STS para inducir necrosis o muerte celular por apoptosis, respectivamente, en presencia y ausencia del inhibidor de caspasa de amplio zVAD-fmk. La viabilidad celular se evaluó a los 6, 12, 24 h post-tratamiento y, a las 6 h de tratamiento más 18 h de recuperación. B. Los cambios en la morfología celular asociados con necrosis o apoptosis en células PC3 tratadas con TBHP y STS, respectivamente, por 24 h. C. morfología nuclear de células PC3 visualizados por tinción con DAPI. D. actividad de caspasa 3 se midió después del tratamiento con TBHP o STS. E. Escisión de Topo I en su firma de apoptosis (70 kD) y necróticas (70 kD y 45 kD) fragmentos se detectó por inmunotransferencia en células PC3 tratadas con STS o TBHP, respectivamente (panel superior). La escisión de LEDGF /p75 en su firma fragmento apoptótico (65 kD) se detectó en células tratadas con STS pero no en las células tratadas con TBHP (panel inferior). ß-actina se utilizó como control de carga.