Extracto
LIN28B está involucrado en "troncalidad" y la génesis tumoral, regulando negativamente la maduración de los
7 let-
miembros de la familia de microARN. En este estudio, hemos demostrado que la expresión LIN28B promueve la migración y la recurrencia de cáncer de colon. reacciones en cadena de la polimerasa de inmunohistoquímica y la transcripción inversa se realizaron para detectar la expresión LIN28B en microarrays de tejidos de cáncer de colon, tejidos resecados quirúrgicos incluidos en parafina y las células cancerosas. La pérdida de la función, se realizaron análisis de migración y proliferación de delinear las posibles funciones de LIN28B en el cáncer de colon. LIN28B se upregulated en el tejido de cáncer de colon en comparación con mucosa normal, y su sobreexpresión correlaciona con la supervivencia del paciente reducida y el aumento de la recurrencia del tumor. supresión LIN28B inhibió la migración de las células de cáncer de colon SW480 y facilitó la citotoxicidad inducida por oxaliplatino en SW480 y las células de cáncer de colon HCT116. En conclusión, la sobreexpresión LIN28B contribuye a la génesis de tumores de colon, y LIN28B puede servir como una herramienta de diagnóstico y diana terapéutica para el cáncer de colon
Visto:. Pang M, Wu G, X Hou, Hou N, Liang L, G Jia , et al. (2014) LIN28B promueve la migración de colon El cáncer y la recurrencia. PLoS ONE 9 (10): e109169. doi: 10.1371 /journal.pone.0109169
Editor: Yuan-Soon Ho, de la Universidad de Medicina de Taipei, Taiwán
Recibido: 6 Julio, 2014; Aceptado: 28 Agosto 2014; Publicado: 31 Octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Pang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Departamento de Salud Pública de la provincia de Sichuan (110167). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Lin28
fue identificado inicialmente en
C. elegans
y se demostró que era responsable de la sincronización de desarrollo [1]. Lin28 induce pluripotencia cuando se expresa en fibroblastos somáticos junto con
Oct4
,
Sox2
y
KLF4
.
LIN28B
, como un homólogo de
Lin28
, se clonó en primer lugar de y quedó demostrado que se sobreexpresa en células de carcinoma hepatocelular humano y muestras clínicas en 2006 [2]. LIN28B es una proteína de unión al ARN regulado por el desarrollo que promueve la génesis de tumores mediante el bloqueo del procesamiento post-transcripcional del supresor tumoral primaria /pre
let-7
microARN [3], [4]. La capacidad de LIN28B para regular
let-7
, un
de buena fe
supresor de tumores, es consistente con su papel en el desarrollo de regulación de la proliferación y diferenciación celular. Curiosamente, varios estudios revelaron que
LIN28B
sí mismo es también un objetivo de
let-7 Buscar miembros de la familia, incluyendo el miR-125 ter [5]. Además de
let-7
, LIN28B también puede unirse al mRNA de marcadores de células madre intestinales, como
LGR5
y
PROM1
[6]. En resumen, LIN28B promueve la transformación fundamentalmente evitando
let-7
. La competencia entre LIN28B y
let-7
pueden ser críticos para la biología celular normal y pueden acelerar el desarrollo de tumores una vez que se perturba este equilibrio.
LIN28B
se hypermethylated en los tejidos somáticos [ ,,,0],7], y su reactivación aberrante puede promover la génesis tumoral [8]. LIN28B frecuencia se sobreexpresa en varios tipos de cáncer, especialmente los tipos avanzados, tales como el carcinoma hepatocelular progresiva [2], [9], cáncer epitelial de ovario [10], tumores de células de tumor y el germen de Wilm [9]. Además de ser blanco de microRNAs antecedentes, LIN28B se activa por varias vías oncogénicas. C /N-Myc induce la expresión LIN28B en varios modelos tumorales de ratón y humanos, lo que resulta en
let-7
la represión y la proliferación celular [11], [12].
MYCN
amplificación también se traduce en LIN28B sobreexpresión [10], y se ha informado de que c-Myc está relacionado con el cáncer de intestino grueso esporádico y familiar poliposis coli [13], lo que implica un papel para LIN28B en el cáncer de colon.
a pesar de los grandes logros de la cirugía, la quimioterapia y el desarrollo de fármacos moleculares dirigidas novedosos, tales como bevacizumab (Avastin), la incidencia de cáncer de colon sigue aumentando [14]. Cada año, los tumores del colon son responsables de 655, 000 muertes a nivel mundial. Debido a
Let-7
funciona como un supresor del crecimiento potencial de las células de cáncer de colon humano [15], se analizó la expresión LIN28B en tejidos de cáncer de colon para determinar el equilibrio entre LIN28B y
let-7
expresión . Se examinó la expresión LIN28B en los tumores de cáncer de colon humano a través de los microarrays de tejidos y encontramos que LIN28B se reguló de manera significativa en el tejido tumoral en comparación con la mucosa colónica normal. A fin de analizar la supervivencia de pacientes con cáncer de colon, se seleccionó una cohorte adicional de los pacientes postoperatorios con registros detallados de patología y los datos de seguimiento de 2004 a 2009. Como era de esperar, la sobreexpresión LIN28B correlacionado con la reducción de la supervivencia del paciente y una mayor probabilidad de recurrencia del tumor . Además, hemos encontrado que el silenciamiento LIN28B inhibe la migración de células SW480 y SW480 sensibilizado y las células de cáncer de colon HCT116 a la citotoxicidad inducida por oxaliplatino.
Pacientes y métodos
análisis del tejido tumoral
Las muestras de carcinomas de colon humanos y dos puntos normales se obtuvieron de una matriz de carcinoma de colon humano del tejido (CO2161, US Biomax), que contenía 204 adenocarcinomas, 4 cánceres de células en anillo de sello y 8 normales muestras de mucosa de colon. información clínica detallada, incluyendo el estado de diferenciación y clasificación TNM, también se proporciona para cada muestra. Una serie adicional de 149 muestras de carcinoma de colon se recogió a partir de muestras que habían sido extirpados quirúrgicamente en 2004 a partir de consentir los pacientes en el Hospital Nanfang (Universidad Médica del Sur, Guangzhou, China), de acuerdo con un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional. Cada uno de estos casos fue seguido, en detalle, hasta junio de 2009. Se confirmó la calificación TNM para las muestras de ambas cohortes. En total, 357 tumores de cáncer de colon y 8 muestras de colon normales se utilizaron para el análisis IHC. La información detallada de todos los tumores de los pacientes y se proporciona en la Tabla 1. El protocolo de estudio fue aprobado por la junta de revisión ética del Hospital Nanfang. Hemos obtenido el consentimiento informado por escrito de todos los participantes en el estudio. Todos los procedimientos se realizaron de conformidad con la Declaración de Helsinki y las políticas pertinentes en China
Dos patólogos anotó el LIN28B intensidad de la tinción de acuerdo con la siguiente escala:. Una puntuación de 0/1 se utilizó para significar intensidad débil /bajo LIN28B (0-25% tasa positiva); una puntuación de 2 representado intensidad intermedia (25-50% tasa positiva); y una puntuación de 3 se utilizó para la tinción de alta intensidad (& gt; 50% tasa positiva). Los tumores de los grados 1, 2 y 3 son equivalentes a los tumores clasificados como bien diferenciado, moderadamente diferenciado o pobremente diferenciados, respectivamente, utilizando microscopía.
Registro pruebas de rango (Mantel-Cox y Breslow) se realizaron para comparar la supervivencia y distribuciones de recurrencia de los diferentes grupos de intensidad (0-2 vs. 3). La correlación entre la intensidad de la tinción y la supervivencia o la repetición se determinó mediante un análisis de chi-cuadrado, y un intervalo de confianza del 95% se calculó para determinar la significación estadística.
Cultivo de células
El SW480, Caco2 y líneas celulares de cáncer de colon HCT116 se adquirieron de ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) y se cultivaron en la modificación de medio de Eagle de Dulbecco (DMEM; Gibco, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS; Hyclone, Sur Logan, UT, EE.UU.). Todas las líneas celulares se mantuvieron en un 5% de CO
2, atmósfera húmeda.
oligorribonucleótidos
Un siRNA-LIN28B específico y un control negativo pequeños ARN (NC) se construyeron mediante Genepharma ( Shanghai, China). LIN28B- y GAPDH-específicos cebadores se sintetizaron por Takara (Takara Biotecnología, Dalian, China).
Transfección de células
oligorribonucleótidos de ARN se transfectaron usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante . Entre 50 y 100 nM de los oligonucleótidos de ARN se utilizaron para cada transfección.
semi-cuantitativa con transcripción inversa reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) y reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (QRT-PCR)
El ARN total fue extraído por medio de reactivo TRIzol (Invitrogen) y luego se trató con DNasa I (Tiangen Biotech, Pekín, china). El ADNc para la qRT-PCR fue sintetizado con el kit de reactivos PrimeScript RT y de la gDNA Borrador (Takara). El procedimiento de amplificación de PCR para GAPDH fue como sigue: 94 ° C durante 3 min; 30 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 30 s; y un alargamiento a la terminal en 72 ° C durante 5 min. La amplificación de LIN28B se realizó como sigue: 95 ° C durante 2 min; 30 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 58 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 30 s; y una etapa final a 72 ° C durante 5 min. Los ensayos de QRT-PCR se realizaron con el kit SYBR PrimeScript RT-PCR (Takara) para GAPDH y LIN28B.
inmunotransferencias
fracciones proteína citosólica se prepararon usando tampón RIPA (Beyotime Biotechnology, Haimen, China). Los anticuerpos utilizados para las inmunotransferencias fueron específicos para LIN28B (1:10, ab71415; Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.) y GAPDH (G9295; Sigma-Aldrich, EE.UU.). Western blots y IHC se realizaron de acuerdo con procedimientos estándar.
análisis de migración
células SW480 (1 × 10
4 células en 100 l de medio libre de suero), que había sido transfectadas con el NC o si-LIN28B, se colocaron en la cámara superior de las placas de cultivo Transwell (8 micras; BD Biosciences, San Jose, CA). La cámara inferior se llenó con 600 l de medio acondicionado. Después de 24 horas, las células que no habían migrado a la cámara inferior se retiraron de la superficie superior de la membrana Transwell con un hisopo de algodón. Se fijaron las células migradas en la superficie de la membrana inferior, se tiñeron con 0,1% de cristal violeta y la imagen.
La viabilidad celular análisis
SW480 o HCT116 células, que habían sido transfectadas con cualquiera de la NC o Si- LIN28B, se sembraron por triplicado en placas de 96 pocillos a una concentración de 1 x 10
4 células por pocillo. Después de que las células se habían adherido a las placas, se incubaron con diferentes concentraciones de oxaliplatino (por ejemplo, 100, 10, 1, 0,1, 0,01 y 0,001 g /ml; Jiangsu Hengrui Medicina Co., Ltd., Jiangsu, China) para 4 horas y se transfirieron a medio completo durante 20 horas. En el punto de tiempo indicado, se añadió 10 l de solución de CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Japón) a cada pocillo, y se incubaron las células durante 3 horas a 37 ° C. La absorbancia (A) se registró a 450 nm usando un lector de placas. El experimento se realizó por triplicado, y la relación de inhibición de las células se determinó utilizando la siguiente ecuación: (1 - grupo de prueba grupo A /control A) x 100%. El IC
50 (50% concentración inhibidora) El valor se calculó utilizando el software (método Logit) específico.
El análisis estadístico
Se realizó una prueba de log rank para comparar las distribuciones de supervivencia y recurrencia para los diversos grupos de intensidad (0-2 frente a 3). La correlación entre la intensidad de la tinción y la supervivencia o la repetición se determinó de acuerdo con un análisis de Chi-cuadrado, donde los valores de p inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Un intervalo de confianza del 95% se calculó para la confirmación de la significación estadística.
Resultados
LIN28B fue aumentada en carcinomas de colon
Para examinar las posibles funciones para LIN28B en el cáncer de colon, nos primera comparación entre la expresión de la proteína LIN28B 208 muestras de tumor y 8 muestras de mucosa normal no emparejado de un microarray de tejido utilizando IHC. La intensidad de la tinción de LIN28B fue marcado por dos patólogos que desconocían la información clínica. De acuerdo con informes anteriores [6], [16], LIN28B se sobreexpresa significativamente en los tejidos tumorales en comparación con tejidos normales (Fig 1, p & lt;. 0.001).
IHC mostró que LIN28B se upregulated marcadamente en los tejidos tumorales en comparación con la mucosa normal, lo que demuestra muy poca expresión LIN28B. Se presentan gráficos representativos.
sobreexpresión LIN28B correlaciona con la supervivencia del paciente reducida y un alto riesgo de recurrencia
Los datos de los pacientes que se sometieron a cirugía (TNM I-III, incluido en parafina quirúrgica resecada tejidos) se analizaron adicionalmente mediante pruebas de rangos logarítmicos para investigar la influencia de la sobreexpresión LIN28B sobre la supervivencia y la recurrencia del paciente. Este análisis reveló una correlación entre la baja intensidad de la tinción LIN28B partir de muestras de grado TNM I y tumores II y el aumento de la supervivencia del paciente (Mantel-Cox p & lt; 0,01; Breslow, p & lt; 0,01) y una menor probabilidad de recurrencia del tumor (Mantel-Cox p & lt ; 0,01; Breslow p & lt;.. 0,01) (Fig 2)
(A) mayor intensidad de tinción LIN28B de la etapa I, II y III los cánceres de colon se correlacionaron con reducción de la supervivencia del paciente. (B) La expresión de alto LIN28B estaba relacionado con una mayor probabilidad de recurrencia del tumor (p & lt; 0,01; prueba de log rank).
En conjunto, nuestros resultados ponen de manifiesto que la expresión LIN28B está estrechamente relacionado con la supervivencia global del paciente y la recurrencia de cáncer de colon.
células SW480 y HCT116 la pérdida de función de las sensibilizado LIN28B a la citotoxicidad mediada por oxaliplatino
7 let-supresor de miembros de la familia microARN
tumorales son conocido para regular la quimiosensibilidad [17], mientras que promueve la malignidad LIN28B principalmente mediante la inhibición
let-7
la biogénesis. Por lo tanto, tratamos de determinar si LIN28B podría influir en la quimiosensibilidad al oxaliplatino. Se examinó la expresión LIN28B en tres líneas celulares de cáncer de colon mediante RT-PCR y Western Blot (Fig. 3A). Se seleccionaron las células HCT116 y SW480 para su uso en estos experimentos debido a su bajo y alto nivel de expresión Lin28, respectivamente. El oxaliplatino induce citotoxicidad dependiente de la concentración en estas células (Fig. 3B). El IC
50 valor de oxaliplatino fue 6,23 ± 0,75 mg /ml para las células HCT116, y esto se incrementó en un 30% a 10,7 ± 2,26 mg /ml en las células SW480. Este hallazgo sugiere que las diferencias en la expresión de LIN28B pueden servir para modular la quimiosensibilidad en células de cáncer de colon. Para comprobar esta hipótesis, se construyó LIN28B-siRNA y controlar los pequeños ARN. La eficiencia de la si-LIN28B se determinó en ambas líneas celulares (Fig. 4A-D), y luego se realizó un análisis CCK-8 para explorar las interacciones entre el si-LIN28B y oxaliplatino en células HCT116 y SW480. Los resultados indicaron un efecto sinérgico entre si-LIN28B y oxaliplatino (Fig. 3C-D), lo que sugiere que la orientación de LIN28B puede ser capaz de sensibilizar a las células de cáncer de colon a la terapia con oxaliplatino.
(A) RT- PCR y análisis de Western blot evaluados los niveles de expresión en LIN28B Caco2, SW480 y células HCT116. células SW480 y HCT116 (B) se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron con las concentraciones indicadas de oxaliplatino. La viabilidad celular se evaluó mediante un kit de ensayo de CCK-8 después de 72 h de exposición al control de drogas o diluyente. IC
50 valores se calcularon después de ajuste de curvas usando el software XLfit. células (C-D) HCT116 y SW480 se transfectaron con NC o si-LIN28B 24 h antes de oxaliplatino tratamiento (IC
50 valor). La tasa de inhibición, normalizado a NC, se calculó utilizando CCK-8 absorbancia a los puntos de tiempo indicados. Los datos se representan como la media del cambio pliegue ± SE (n = 3; prueba t de Student).
(A-B) RT-PCR y Western blot análisis confirmaron la eficacia de sh-LIN28B desmontables en las células HCT116 y SW480. (C-D) Un análisis de QRT-PCR confirmó también la regulación a la baja de LIN28B ARNm en estas células. Los datos se representan como la media ± SE. (N = 3; Estudiante de
t-test
) guía empresas
regulación a la baja de LIN28B reprimió la migración de las células SW480
como LIN28B sobreexpresión se correlaciona con la recurrencia del tumor y la supervivencia del paciente, el próximo tratado de explorar si la expresión LIN28B influye en la migración de las células de cáncer de colon. Derribaron la expresión LIN28B utilizando siRNA, y el análisis Transwell indicó que la supresión de LIN28B inhibió significativamente la migración de las células SW480 (Fig. 5).
Las células fueron transfectadas con 50 nM NC o si-LIN28B y estuvimos permitido a migrar a través de una cámara Transwell. Se presentan gráficos representativos.
Discusión
, se cree que varios genes relacionados con la troncalidad, que se refieren a los genes como oncofetal promover la génesis tumoral en la re-expresión en células somáticas. La presencia de CD133
+ células madre de cáncer o células iniciadoras del cáncer puede explicar la metástasis, recurrencia y quimio-resistencia de cáncer de colon [18], [19].
Let-7
está implicado en la regulación de la autorrenovación y la tumorigenicidad de las células iniciadoras del cáncer de mama [20], y también se reprime en células de cáncer de colon [15]. LIN28B sobreexpresión se sabe que contribuyen a la carcinogénesis mediante el bloqueo de la biogénesis de
let-7
, lo que nos llevó a evaluar si el equilibrio entre LIN28B y supresores de tumor promotor de tumores
let-7
era alterado en el cáncer de colon [21]. Se encontró que la expresión LIN28B se upregulated en los tejidos tumorales de colon, y esta expresión se correlacionó con una menor supervivencia del paciente, y una mayor probabilidad de recurrencia. Además, el silenciamiento de LIN28B sensibilizado células de cáncer de colon a la citotoxicidad inducida por oxaliplatino e inhibió su migración
in vitro
.
Lin28
se expresa en diferentes poblaciones de células madre, aunque su expresión en tejidos somáticos diferenciados terminalmente es escasa. Recientemente, cuando se expresa en combinación con
Oct4
,
NANOG
y
Sox2, se mostró Lin28
para actuar como un reemplazo para
c-Myc
a reprogramar fibroblastos somáticas humanas a pluripotencia [22]. Como un homólogo de Lin28,
LIN28B
ha sido clonado a partir principalmente carcinomas hepatocelulares, y su sobreexpresión se ha demostrado para promover la proliferación de células de cáncer [2]. La activación de los resultados LIN28B en la reducción de la represión
let-7
objetivos, como
HMGA2
,
DICER1
[10],
KRAS
[23 ] y
c-Myc
, y la activación de las correspondientes vías de señalización oncogénicas. Curiosamente,
LIN28B
y su regulador de aguas arriba
c-Myc
[12] son también objetivos de
let-7
; en consecuencia, un
c-Myc-LIN28B-let-7
eje, o bucle de realimentación, que pueden servir para reprimir el crecimiento del tumor, pueden existir. Por lo tanto, la pérdida de control sobre este eje puede acelerar el crecimiento del tumor
Como se mencionó anteriormente,
LIN28B
está regulado por varios factores oncogénicos.; miembros de la
MYC
familia, incluyendo
C-Myc
,
N-Myc
y
MYCN
, puede activar LIN28B, lo que sugiere que
LIN28B
es un objetivo importante de
MYC
y puede explicar por qué
LIN28B
puede reemplazar
c-Myc
para la reprogramación de células somáticas en la pluripotencia. La
c-Myc
factor de transcripción puede ser activado por el
Wnt /APC
vía, que está desregulado en el cáncer de colon [24].
APC
alteraciones genéticas, si no se hereda, representan las primeras alteraciones moleculares durante el desarrollo del cáncer colorrectal, mientras que las alteraciones estructurales de la
myc, ras, p53
,
MCC
y
DCC
genes son considerados para representar los eventos finales de los años [25]. En resumen, nuestros resultados ponen de manifiesto la existencia de un previo
Wnt /APC CD -
Myc CD -
LIN28B CD -
let-7
vía en la carcinogénesis de colon . Nos piensan que
Wnt /APC CD -
Myc
activación de la vía es el evento inicial y que el
LIN28B-let-7-c-Myc /LIN28B
bucle de retroalimentación acelera de colon carcinogénesis. Sin embargo, se necesitan más estudios para verificar el papel de este bucle de retroalimentación en la carcinogénesis.
La metástasis y la recurrencia son las principales razones de la disminución en la supervivencia global entre los pacientes con tumores malignos. Por lo tanto, es de gran interés para ser capaz de predecir la metástasis tumoral y la recurrencia en una etapa temprana. Por otra parte, la predicción de la recurrencia del tumor en estadio II /III pacientes puede guiar a la quimioterapia adyuvante. Los métodos mejorados para la identificación de los pacientes en estadio II en un alto riesgo de recurrencia [26], que se basa en las características únicas de cada tumor, pueden resultar en miles de vidas salvadas cada año. Además, las técnicas para la identificación de pacientes en estadio III que se encuentran en un bajo riesgo de recurrencia de la enfermedad después de la cirugía puede prescindir de estas personas desde el costo, el tiempo y la toxicidad asociada a la quimioterapia [27]. En nuestro estudio, la intensidad de tinción LIN28B (& gt; 50%) se correlacionaron con una menor supervivencia del paciente. Es importante destacar que la expresión LIN28B podría predecir la recurrencia de TNM grado II /III tumores después de la resección quirúrgica.
Si bien este manuscrito estaba en preparación, un estudio de King et al. informó que LIN28B promueve la progresión del cáncer de colon y metástasis tanto
in vivo
[16] y
in vitro
través de
let-7
-dependiente y mecanismos -independiente [6]. Nuestros datos son consistentes con estos resultados, y también sugieren que la detección de la expresión de LIN28B podría ayudar a determinar el esquema adecuado de la quimioterapia adyuvante en pacientes con TNM grado II y III carcinomas de colon.
En conclusión, nuestros datos sugieren un papel importante para
LIN28B
en la carcinogénesis de colon. LIN28B expresión se demostró para predecir la supervivencia del paciente, lo que implica que
LIN28B
puede ser una diana terapéutica útil para moleculares novedosas.