Extracto
Antecedentes
niveles de metilación de repeticiones genómicas tales como elementos de nucleótidos intercalados largos (LINE-1) son representativos de la situación global de la metilación y juegan un papel importante en el mantenimiento de la estabilidad genómica. El objetivo del estudio fue evaluar LINE-1 estado de metilación en el cáncer colorrectal (CCR) en relación con la progresión maligna y adenomatosa, la heterogeneidad del tejido, y TNM-etapa.
Metodología /Principales conclusiones
DNA se recogió mediante microdisección por láser de captura (LCM) de lo normal, adenoma, y tejido de cáncer de 25 pacientes con TisN0M0 y de 92 pacientes con CRC primaria de diversos TNM-etapas. Las secciones de tejido incluidas en parafina fueron tratados por
In situ
bisulfito de sodio modificación del ADN (SBM). LINE-1 índice de hipometilación (LHI) se midió por análisis cuantitativo absoluto de alelos metilados (AQAMA) PCR en tiempo real; un índice mayor indica una mayor hipometilación. LHI en condiciones normales, mesenquimales cáncer, adenoma, y el tejido CRC era 0,38 (SD 0,07), 0,37 (SD 0,09), 0,49 (SD 0,10) y 0,53 (SD 0,08), respectivamente. LHI fue significativamente mayor en el tejido adenoma en comparación con su epitelio contigua normal (
P
= 0,0003) y el tejido mesenquimal cáncer (
P
& lt; 0,0001). LHI no difirió significativamente entre adenoma y el tejido de cáncer precoz de la etapa Tis (
P
= 0.20). LHI elevado con una mayor T-etapa (
P Hotel & lt; 0,04), fue significativamente mayor en los ganglios positivos que los pacientes de CRC con ganglios negativos (
P
= 0,03), y fue significativamente mayor en estadio IV que todas las otras etapas de la enfermedad (
P Hotel & lt; 0,05).
Conclusión /Importancia
mediante el uso de
celular
SBM y LCM in situ la selección hemos demostrado la aparición temprana de LINE-1 desmetilación durante el cambio adenomatosa de las células epiteliales colorrectales y demostramos que LINE-1 desmetilación progresión es lineal en relación con la progresión de la TNM-etapa
Visto:. Sunami e, de Maat M, Vu A, Turner RR, Hoon OSD (2011) LINE-1 hipometilación Durante primarios de colon progresión del cáncer. PLoS ONE 6 (4): e18884. doi: 10.1371 /journal.pone.0018884
Editor: Chun-Ming Wong, Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 12 Octubre, 2010; Aceptado: March 24, 2011; Publicado: 14 de abril 2011
Derechos de Autor © 2011 Sunami et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los estudios recibieron el apoyo de la Fundación Familia Weil (los Ángeles, CA) y la Leslie y Susan Gonda (Goldschmied) Fundación (los Ángeles, CA). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Aproximadamente el 17-18% del genoma humano está formado por el elemento de nucleótidos intercalados largo (LINE-1) se repite. Aproximadamente 500.000 truncado y 3000 a 5000 de longitud completa LINE-1 secuencias están presentes en todo el genoma [1]. En las células somáticas normales, LINE-1 están fuertemente metiladas, la restricción de las actividades de los elementos retrotransposal y por lo tanto la prevención de la inestabilidad genómica [2], [3]. secuencias LINE-1 son moderadamente CpG ricos, y los CpG metilados la mayoría se encuentran en la región 5 'y pueden comportarse como promotores internos [2]. LINE-1 estado de metilación se cree que representan el estado de metilación del ADN en todo el genoma, ya LINE-1 secuencias son muy repetidos, retrotransposones humanos ampliamente intercalados. Varios estudios han demostrado una relación de importantes eventos genómicas en la carcinogénesis colorrectal en LINE-1 metilación. Por ejemplo, 18q pérdida de heterocigosidad (LOH) (+) del cáncer colorrectal (CCR) muestran una LINE-1 metilación nivel inferior media [4]. Una relación inversa se ha informado entre LINE-1 metilación y la inestabilidad de microsatélites (MSI) + /isla CpG methylator fenotipo (CIMP) + /BRAF mutación V600E CRC [5], [6]. Recientemente se ha informado de una correlación inversa significativa entre los niveles de LINE-1 metilación y el número total de aberraciones cromosómicas, incluyendo tanto las pérdidas y ganancias de los tumores del estroma gastrointestinal (GIST) [7]. En cuanto a CRC, Bariol et al. reveló que el nivel global de la hipometilación del ADN fue mayor en las lesiones neoplásicas (incluyendo pólipos hiperplásicos y adenomas) que en la mucosa normal [8].
Un problema importante en la evaluación de LINE-1 estado de metilación en el CCR es que CRC es muy heterogéneo y contiene varias células infiltrantes tales como las células del estroma, linfocitos, y los vasos sanguíneos. El componente del estroma y el alcance de la infiltración de linfocitos varía mucho entre los CRC. Esta heterogeneidad puede confundir el análisis molecular, especialmente de LINE-1 estado de metilación, como LINE-1 es metilado en las células normales. Con el fin de obtener interpretaciones precisas, por lo que es necesario aislar específicamente a las células tumorales de las muestras de tejido. etapa temprana CRC análisis del tumor primario sin microdisección histopatología dirigida para la evaluación del estado de metilación genómica no es exacta. Esto es particularmente una cuestión problemática en la evaluación de la progresión de la CRC y al comparar adenoma de tejido de cáncer. técnicas robustas y precisas para este tipo de análisis no existan; Por lo tanto, hemos desarrollado un enfoque práctico. Hemos utilizado microdisección por láser de captura (LCM) para cosechar las células de interés directamente sin contaminación de las células no cancerosas. Sodio modificación con bisulfito (SBM) de ADN genómico es un método comúnmente utilizado para discernir el estado de metilación de las islas CpG [9]. métodos de preformas convencionales resultan en 84% a 96% de pérdida de ADN de la muestra [10]. Esta pérdida significativa de la plantilla de ADN requiere grandes volúmenes de muestra de tejido de partida. Para reducir la pérdida de muestra de ADN a partir de células recogidas por LCM, hemos desarrollado un
protocolo
SBM in situ. El ADN se modifica mientras las células fijas capturadas se adjuntan en la tapa LCM
.
Se han reportado numerosos estudios identificar aberraciones epigenéticas asociadas-CRC como región promotora hipermetilación de los genes supresores de tumores. Otra característica alteración en el CCR sobre el estado de metilación del ADN es la hipometilación mundial [11], [12]. La progresión de LINE-1 nivel de hipometilación durante el desarrollo de CRC malignidad y la progresión de la enfermedad no se ha evaluado rigurosamente. La determinación de la histopatología asociada con el inicio de la pérdida de LINE-1 metilación y la tendencia de LINE-1 metilación a lo largo del eje de la progresión de la enfermedad en estadio podría aclarar aún más el papel de LINE-1 hipometilación en la enfermedad CRC. En este estudio, LCM,
In situ
SBM, y la cuantificación absoluta de alelos metilados (AQAMA) se utilizaron en combinación en muestras de pacientes con adenomas que contiene
In situ
adenocarcinoma invasivo (Tis) y los pacientes con CCR avanzado más. Esto permitió un análisis preciso exitosa de LINE-1 en los niveles hipometiladores durante la progresión tumoral primario entre T-etapas progresivas, ganglios positivos frente a la enfermedad de ganglios negativos, y distante metastásico en comparación con la enfermedad local y locorregional.
Resultados
AQAMA linealidad para LINE-1 metilación nivel de evaluación
en primer lugar, se evaluó la exactitud de AQAMA en la evaluación de los distintos niveles de LINE-1 metilación. La principal ventaja de AQAMA es que la medición cuantitativa de alelos metilados y no metilados se lleva a cabo en una sola reacción PCR, proporcionando un excelente control en comparación con dos reacciones de PCR separadas para análisis alelo metilado y no metilado. La cuantificación es absoluto con las curvas de calibración para determinar el número de copias. Para un control negativo, la reacción de ensayo contenía ADN de control no metilado universal que fue sintetizado como se describe en un estudio publicado anteriormente [13]. Para un control positivo, se utilizó ADN de control metilado universales extraído de linfocitos de sangre periférica de un donante sano y se trató con
SEIC metiltransferasa.
Para este estudio, hemos preparado mezclas de paso a paso de la norma cDNA metilado y no metilado y los midió como muestras con nivel de metilación desconocido. La linealidad del ensayo AQAMA de LINE-1 nivel de metilación (Figura 1) se evaluó mediante el coeficiente de linealidad de Pearson: 0,99 (
P Hotel & lt; 0,001), que mostró una alta precisión en la discriminación LINE-1 diferencias de nivel de metilación.
Parcela de medidas (cajas) y esperada (x) los valores que muestra la precisión del ensayo AQAMA LINE-1.
Optimización de
ajustes de
SBM in situ
LCM se realizó para cosechar células de interés (Figura 2a) para obtener una representación precisa de las células en cuestión para el éxito de medición AQAMA. Se probaron tres áreas de tejido diferentes muestras de 10
4, 10
5 y 10
6 m
2 cosechadas a partir de 4 micras de espesor incluido en parafina archivo de tejidos (turba). A través del análisis, se estableció que el 2 × 10
5 m
2 de 4 resultados TURBOSO micras de espesor en unos 10
5 número de copias de ADN LINE-1. Esto proporcionó niveles reproducibles significativas de ADN metilación de ensayo LINE-1. Después de LCM,
In situ
SBM fue optimizado de una manera similar como se realiza en los estudios previos de SBM en diapositiva utilizando la amplificación secuencia genómica específica [14]. Los tipos de conversión de ADN modificado por
In situ
SBM fueron 18,4 ± 14,9%, 87,8 ± 7,8% y 94,4 ± 2,1% en el ajuste de incubación de 60 ° C durante 2, 4 y 8 horas, respectivamente (Figura 2b). Los tipos de conversión aumentó con el aumento de duración de la incubación, con lo que después de 8 horas se alcanzó aproximadamente 95%. El rendimiento de ADN total (modificado y DNA no modificado) no disminuyó al aumentar el tiempo de incubación hasta 8 horas (figura 2c). A partir de estos resultados, un entorno de incubación de 60 ° C durante 8 horas fue elegido como óptimo para
In situ
SBM.
A muestra específica de recogida de las células diana por LCM. B y C muestran los resultados de la tasa de conversión de ADN (%) y para el contenido de ADN (× 10
4: número de copias), respectivamente, en 8 muestras diferentes en 3 diferentes períodos de incubación.
línea- 1 los niveles hipometiladores durante CRC progresión
se seleccionaron veinte y cinco pacientes con lesiones TisN0M0 con presencia de lo normal, adenoma (grado bajo o intermedio) y las células de cáncer de Tis en la misma sección de tejido. Uso de LCM, se recogieron cuatro muestras de tejido diferentes (mucosa, adenoma, cáncer, y el tejido normal mesenquimales cáncer) de cada paciente.
In-situ
SBM y el ensayo AQAMA LINE-1 se realizaron en cada muestra. El nivel de LINE-1 hipometilación (LHI) se calculó como Q
unmeth /(Q
unmeth + Q
met), donde Q
unmeth y Q
metanfetamina son los números de copias absolutas de no metilado y no metilado LINE-1, respectivamente. En la mucosa normal adyacente a las lesiones tumorales y mesénquima cáncer, la media LHI era 0,382 y 0,366, respectivamente. No hubo diferencias de LHI entre mesénquima cáncer y mucosa normal adyacente al tumor. LHI fue significativamente mayor en el adenoma y cáncer de tejido contiguo de fase temprana que en la mucosa normal (media LHI = 0,49, 0,52, y 0,38, respectivamente) (Figura 3). A partir de estos resultados, se concluye que LINE-1 hipometilación se produce en la etapa temprana de CRC tumorigénesis. Además, estos experimentos demostraron la necesidad de utilizar procedimientos detallados para la recogida de ADN en el análisis de LINE-1 los niveles de metilación, como el aislamiento de la célula diana, por LCM. Sobre la base de esto, LCM se utilizó para la recogida de muestras de ADN para todos los experimentos en nuestros estudios.
LINE-1 la hipometilación y el tejido heterogeneidad
En el análisis de LHI de lo normal, mesenquimales cáncer, adenoma, y el tejido CRC, fue 0,38 (SD 0,07), 0,37 (SD 0,09), 0,49 (SD 0,10) y 0,53 (SD 0,08), respectivamente. Para probar si hay heterogeneidad de LINE-1 hipometilación dentro de un tumor, se seleccionaron 20 tumores T3N0 para el análisis. se recogió la muestra de ADN de la superficie luminal y el sitio invasional más profundo de cada tumor. LHI de estos dos loci se compararon (Figura 4). La media fue de 0,58 LHI en la superficie y 0,54 en los loci más profundo. LHIS fueron similares en la superficie y en lo más profundo del territorio y de la heterogeneidad de los tumores LINE-1 hipometilación no se observó.
Los valores medidos en LHI tumores T3N0 CRC que comparan células obtenidas de la zona del tumor luminal superficie para el tumor invasión profunda zona.
LINE-1 hipometilación y la etapa CRC
para evaluar la alteración de LINE-1 en los niveles hipometiladores de acuerdo con la progresión del tumor, se analizó la correlación entre los estadios de Dukes y LHI. Dukes A (n = 38), Dukes B (n = 18), y Dukes C (n = 29) se seleccionaron muestras (Figura 5c). El LHI media en Dukes A, B, y C fue de 0,533, 0,607, y 0,621, respectivamente. Dukes B y C tumores mostraron significativamente mayor que los tumores LHI Dukes A. La relación entre LINE-1 metilación y T-etapa (T1 (n = 24), T2 (n = 21), T3 (n = 21), y T4 (n = 26)), así como N-etapa (N0 ( n = 57) y N1 (n = 35)) se analizaron. Se evaluó el aumento de LHI de acuerdo con la invasión tumoral (Figura 5a) y la diferencia de LHIS entre los casos de ganglios linfáticos positivos y negativos (Figura 5b). La media LHI de T1, T2, T3, y T4 fue 0,50, 0,58, 0,60, y 0,65, respectivamente. LHI fue significativamente mayor (
P
= 0,03) para los casos con ganglios linfáticos positivos (LHI = 0,64) que los ganglios linfáticos negativos (LHI = 0,54). La predicción del estado ganglionar sería el más clínicamente relevante y, por tanto, se analizó una curva de funcionamiento del receptor (ROC) para distinguir si la metástasis de nodo positivo puede ser un indicador de pronóstico de la CRC primario por medio de LHI (Figura 6). avance T-etapa correlacionó significativamente con el aumento LHI (
P
= 0,01). También se analizaron los casos con enfermedad distante propagación (Dukes D, n = 6), y estos casos mostraron significativamente mayor en comparación con LHI Dukes C CRC (
P
= 0,05) por sí sola y para todas las demás fases de Duke (
P Hotel & lt; 0,0001). Un ROC fue trazada para mostrar la exactitud de la predicción de afectación ganglionar por LHI (Figura 6). Esto demostró que el valor predictivo tenía una sensibilidad de 0,77, con una especificidad de 0,62. No fue significativamente menor para LHI en el lado derecho del colon frente del lado izquierdo (
P Hotel & lt; 0,05). Sin embargo, no se observaron diferencias significativas entre LHI para el estado de diferenciación o de género.
A, B y C se muestran las diferencias entre el estadio de Duke, estadio T y N-etapa, respectivamente.
el eje x representa 1-especificidad y la sensibilidad del eje y. El área bajo la curva (AUC) se calculó a 0,69. P = 0,003.
Estos análisis mostraron una relación lineal positiva entre la progresión de LINE-1 hipometilación y la progresión tumoral del carcinoma colorrectal.
Discusión
La alteración de la metilación del ADN patrones ha sido estudiado en muchos tipos de cáncer [15]. Hipermetilación de regiones promotoras específicas de genes asociados con el cáncer y la hipometilación del ADN a nivel mundial durante la progresión tumoral se ha demostrado ahora como una propiedad importante de los cánceres [16], [17]. La hipometilación de la repetición de ADN LINE-1 que forma el 20% del genoma se ha sugerido como un sustituto de la hipometilación del ADN mundial [5], [18], [19], [20]. Yang et al. mostró que la metilación de todo el genoma puede ser estimado por la evaluación [21]. repeticiones Alu son Sines, más compleja y diversa que las líneas. los ensayos de metilación fiables para estudiar Alu no están bien fundamentadas. Un representante método exacto para el fenómeno de metilación global no existe; Sin embargo, LINE-1 puede servir también como un sustituto.
LINE-1 hipometilación no es específico para las células cancerosas, y alrededor de un tercio de LINE-1 no está metilado en la mucosa normal y las células mesenquimales del cáncer [22], [23]. Por tanto, la posible contaminación de DNA ejemplar que consiste en cáncer junto con las células mesenquimales, tales como fibroblastos o linfocitos, puede causar resultados inexactos. Por esta razón, especialmente en relación con el análisis de metilación LINE-1, el aislamiento precisa de las células diana es muy importante. Para minimizar la contaminación y obtener células de único interés, hemos integrado con éxito en LCM LINE-1 metilación análisis en este estudio. Se evaluó
in-situ
SBM combinado con LCM como un enfoque para mejorar la eficiencia del ensayo de metilación del ADN, que permite la evaluación de células de histopatológicamente definido de determinadas regiones de objetivo de desarrollo CRC etapa primaria muy temprana. Un estudio reciente ha proporcionado alguna evidencia de que los resultados son comparables si se utiliza macrodissection o LCM [24]. Sin embargo, esto depende de la sensibilidad del ensayo altamente. El concepto de LCM, sin embargo, es el estado de la técnica y superior a macrodissection cuando se desea pequeña muestra de tejido de entrada específicos para el análisis de ADN. En primer lugar, cuando las lesiones en etapa temprana pequeños necesitan ser evaluados y sólo pequeñas áreas de células cancerosas específicas están disponibles para el análisis, la microscopía guiada celular pick-up ofrece precisión y control del ADN de la muestra de entrada. En segundo lugar, LINE-1 metilación no es específico del cáncer y, como nuestros resultados muestran, se encuentra en el tejido del estroma del cáncer. Con la comprensión actual de la microambiente tumoral y la heterogeneidad del estroma del tumor, es muy importante llevar a cabo análisis de LCM para la recuperación de ADN específico de tejido. Además, se espera LINE-1 metilación de variar en las células adyacentes "normales" de un tumor primario ya que el análisis de patología microscopía de luz no siempre es precisa para identificar la transformación celular cáncer en etapa temprana.
In-situ
SBM fue diseñado basado en el tobogán de SBM [14], que fue adaptado a partir de un concepto según lo informado por Nuovo et al [25]. On-deslizante SBM es un procedimiento potente para el análisis de metilación utilizando turba; sin embargo, después de diapositivas SBM la muestra se vuelve demasiado adhesivo a la lámina de vidrio, por lo que es difícil para LCM para capturar de manera eficiente las células diana a veces.
In-situ
SBM elimina las numerosas etapas de aislamiento y purificación de ADN de SBM clásico, que son la principal causa de pérdida de ADN en la evaluación de pequeñas cantidades de DNA a partir del número limitado de células. Nuestro estudio describe
In situ
tratamiento de células /tejidos directamente por el ensayo de bisulfito integrado con LCM. Una limitación del ensayo es que el análisis de estado de metilación de las células individuales todavía sigue siendo difícil debido a la naturaleza degradante de ADN del protocolo de SBM y el ADN limitado para el análisis de metilación.
LCM combinación,
in situ
SBM, y el ensayo AQAMA, LINE-1 hipometilación se demostró en baja para adenoma grado intermedio, una fase temprana de la tumorigénesis colorrectal como se muestra anteriormente [5], [6]. Una disminución significativa en LINE-1 metilación se midió comparando adenoma con el epitelio normal adyacente. No hay diferencia significativa se demostró cuando el adenoma se comparó con el tejido contiguo canceroso etapa Tis que también se informó recientemente en por Kwon et al [26]. Este resultado difiere de los estudios realizados por Ibrahim et al. y por Irahara et al. que se encuentran diferencias significativas entre LHI de adenomas colorrectales y CRC [24], [27]. Es importante señalar que estos estudios no especifican el TNM-etapa de las muestras. La diferencia no significativa entre los tejidos adenoma y cáncer en nuestro estudio se explica por el uso de un grupo heterogéneo de tejidos de cáncer de la fase más temprana del cáncer (
In situ
carcinoma, Tis). Nuestros resultados confirman que los niveles de LINE-1 metilación varían en diferentes TNM-etapas. Cuando LHI en adenomas se compararon con muestras más avanzada etapa de CRC en nuestro estudio de las diferencias fueron significativas (datos no mostrados). Esto demuestra que no metilado LINE-1 no puede desempeñar un papel importante durante el proceso cuando las células de adenoma de ganar su primera actividad invasiva.
El aumento de la heterogeneidad encontrada en las lesiones más grandes, avanzados es una indicación de que existen subgrupos de CRC que son capaces de mantener la metilación de LINE-1. Por otra parte, se observó que dos casos Dukes etapa D tenían un LHI de 0,9 que sólo se ha visto en este subgrupo. La heterogeneidad es un problema clínico conocido como resultado de la enfermedad varía ampliamente para los pacientes de CRC con el mismo TNM-etapa. La diversidad de los LHIS dentro de las diversas etapas en nuestro estudio puede reflejar esto. Los mecanismos que controlan el mantenimiento de LINE-1 metilación y cómo influyen en la progresión del tumor sigue siendo desconocido.
En un estudio a gran escala por Baba et al [28], una relación con la etapa de la enfermedad ha sido descrita con mayor LINEA- 1 desmetilación en la enfermedad más avanzada, aunque las diferencias fueron muy menor. También, de acuerdo con los resultados del estudio, los niveles de línea de metilación fueron más altos en la enfermedad en estadio II en comparación con la etapa I. Este estudio analiza las secciones de tejidos enteros sin usar microdisección. Una de las razones de que las diferencias eran pequeñas y de la etapa II se observó mayor LINE-1 metilación puede ser el grado de contaminación del ADN de células mesenquimales en el ADN de la muestra. Nuestros resultados demuestran que no sólo la mucosa normal adyacente, sino también las células mesenquimales en el cáncer, muestran alrededor de un tercio de LINE-1 hipometilación. Esto apoya nuestra énfasis que el aislamiento de células diana específica es necesaria. Valor pronóstico de LINE-1 los niveles de metilación en el CCR ha informado [29]; Sin embargo, la variación entre los tumores puede ser el resultado de la contaminación componente estromal /mesenquimales [30].
Nuestro estudio muestra una relación lineal positiva clara por etapas de pérdida de LINE-1 metilación a T-, N-, como así como M-etapa. Los niveles de LINE-1 desmetilación, por tanto, pueden ser útiles en varias situaciones clínicas. análisis preoperatoria de material de biopsia CRCs que puede predecir T-etapa (Tis vs. T1 o T1 vs. T2) puede ser de utilidad para decidir si la resección endoscópica (es decir transanal escisión de la mucosa de los cánceres rectales) se puede intentar frente a la cirugía de resección abierta, que se asocia con tasas de morbilidad /mortalidad mucho más altas. predicción N-etapa se podría utilizar para seleccionar a los pacientes de CRC para probar la eficacia de la terapia neoadyuvante. Por otra parte, la predicción M-etapa puede ser utilizado como un biomarcador de emprender nuevas imágenes preoperatorias metastásico con PET-TAC, además del tratamiento estándar. Para evaluar si el material de biopsia tumoral preoperatoria desde el lado luminal es representativa, se evaluó la heterogeneidad del tumor. La comparación entre la parte más profunda y la superficie del tumor reveló que la heterogeneidad del tumor de LINE-1 estado de metilación es relativamente sutil. Los resultados sugieren que las muestras de biopsia de CRC recogidos durante la colonoscopia son representativos y pueden ser utilizados para la evaluación de análisis de estado de metilación LINE-1 de un tumor. La media LHI difirió significativamente entre el nodo y el nodo positivo CRC negativos; con lo cual el análisis ROC mostró resultados discriminatorios. No hubo superposición de valores entre la LHI N + y categorías N0 y la sensibilidad y especificidad fueron relativamente bajas. Esto también se observó para T y la discriminación M-etapa. Se necesitan estudios más amplios para determinar la utilidad de LHI como un único biomarcador o combinación con otros biomarcadores.
En conclusión, el estudio demostró que el estado de metilación LINE-1 se correlaciona con el estadio patológico de CCR. Por otra parte, es necesario su análisis preciso con técnicas de LCM o equivalentes, como las células tumorales mesenquimales de tejido que rodea claramente favorable pueden influir en los resultados. El inicio de LINE-1 desmetilación ocurre muy temprano, cuando la mucosa colorrectal normal, se convierte en un adenoma con displasia de bajo o intermedio. Los resultados mostraron una correlación lineal clara y significativa de la progresión de la pérdida de metilación LINE-1 elemento hasta la progresión de la enfermedad de CRC (Figura 7) con respecto a T- así como N- y M-etapa. Estos hallazgos sugieren que la pérdida continua de metilación genómica durante el desarrollo del CRC, lo que indica que los altos eventos epigenómicos y por lo tanto genómicas son las características clave de la progresión del tumor.
Materiales y Métodos
Medición de LINEA- 1 hipometilación
El estado de metilación de LINE-1 se evaluó mediante el ensayo AQAMA para la evaluación precisa de los niveles de metilación de la isla CpG [31]. Antes de realizar el ensayo de AQAMA LINE-1 estado de metilación, SBM se aplicó en cada muestra de ADN como se ha descrito anteriormente [32]. AQAMA requiere uno hacia adelante y un cebador inverso que amplificar la secuencia diana independiente del estado de metilación, como los de avance y retroceso conjuntos de cebadores no contienen CpG. El estado de metilación se evalúa por dos molécula que contiene sondas de surco estrecho de unión (MGB) (Applied Biosystems): una metilación específicos y uno específico de no metilación. El cebador 3 'del cebador 5, la sonda específica de metilación y la sonda específica de no metilación son las siguientes: 5'-GGGTTTATTTTATTAGGGAGTGTTAGA-3' (hacia adelante), 5'-TCACCCCTTTCTTTA ACTCAAA-3 '(hacia atrás), FAM-5' -TGCGCGAGTCGAAGT-3'-MGB-BHQ y VIC-5'-TGTGTG AGTTGAAGTAGGG-3'-MGB-BHQ. La mezcla de reacción para cada PCR AQAMA constaba de plantilla de ADN, 0,4 mol /L de cebador directo e inverso, 1,4 unidades de
iTaq
ADN polimerasa (Bio-Rad, Hercules, CA), 350 mmol /L de cada desoxinucleótido trifosfato y 0,025 pmol de cada sonda MGB con 5 mmol /l de Mg
2 +. La amplificación por PCR se realizó con activación por calor pre-ciclo de la ADN polimerasa a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 15 s, recocido y extensión a 60 ° C durante 60 seg. Se determinó el número de copias absoluto en cada muestra utilizando una curva estándar establecida mediante la amplificación de seis duplicados alícuotas de plantillas con números de copias conocidos (10
* 6-10
* 1 copias). Hemos descrito previamente los métodos para la síntesis de la muestra estándar del número de copias conocido en el ensayo AQAMA [31]. Para un control negativo, la reacción de ensayo contenía ADN de control no metilado universal que fue sintetizado como se describe en un estudio publicado anteriormente [13]. Para un control positivo, se utilizó ADN de control metilado universales extraído de linfocitos de sangre periférica de un donante sano y se trató con
SEIC metiltransferasa
. Brevemente,
LICE metiltransferasa
ha tratado, bisulfito modificado, ADN de PBL de donantes se amplificó por PCR con el conjunto de cebadores para crear la muestra estándar para LINE-1 totalmente metilado. Para la construcción de la muestra estándar para LINE-1 no metilado se utilizó ADN de control no metilado universales, preparado como se describe anteriormente [13]. El producto de PCR completamente metilado y no metilado se ligó en un pCR 2.1-TOPO vector de clonación (Invitrogen); los clones se transformaron en
Escherichia coli DH5
-a células; y se ampliaron las culturas como se describe anteriormente [33]. Los plásmidos que contienen el gen diana se purificaron y se cuantificaron por espectrofotometría UV. Esto se utilizó para hacer serie de dilución del número de copias conocido para construir las curvas de calibración para la cuantificación absoluta. Todos los ensayos de PCR cuantitativa se realizaron de forma ciega sin conocimiento de la identidad de la muestra. Los valores medios se calcularon a partir de las reacciones por triplicado. LINE-1 índice de hipometilación (LHI) de cada muestra se calcula de la siguiente manera: LINE-1 LHI = número de copias no metilado /(número de copias metilado + número de copias no metilado)
LCM
LCM era. utilizado para la recogida de muestras de ADN para todos los experimentos en nuestro estudio. Principios y base técnica de LCM se describen en detalle por Fend F et al. [34]. Las células se recogieron con un sistema de LCM que alberga un sistema de cámara digital que detecta las celdas seleccionadas. Esto permite que la misma cantidad de micrómetros cuadrados de células pueden ser recogidos para cada muestra.
In-situ optimización ensayo
SBM
Para medir LINE-1 índice de hipometilación después de microdisección mediante LCM, desarrollamos el
in situ procedimiento
SBM basado en la técnica SBM previamente introducida en la diapositiva.
In-situ
SBM fue diseñada para analizar el estado de metilación de los genes en la pequeña cantidad de ADN obtenido a partir fijados con formol y turba.
In-situ
SBM tiene como objetivo eliminar el aislamiento y purificación de ADN pasos que se realizan antes de la SBM real en el procedimiento clásico que es la principal causa de pérdida de ADN.
In-situ
SBM contiene tres pasos; desnaturalización del ADN, SBM y la recogida de ADN modificado. En primer lugar, las células fueron microdissected de secciones de tejido desparafinados y rehidratados que se pegan en la tapa utilizada en LCM se incuban en /L de NaOH 0,2 mol a temperatura ambiente durante 15 min. A continuación, las muestras en la tapa se incuban en solución de bisulfito de sodio /L 3 mol con 0,5 mmol /L hidroquinona (pH 5) en la oscuridad. Tres ajuste de incubación se ensayaron con respecto a los tipos de conversión (la tasa de modificación de la citosina en uracilo) y los rendimientos de ADN modificado y el ajuste de la incubación de 60 ° C durante 8 horas fue elegido como óptimo (véanse los resultados de sección). Después de la incubación, las muestras en la tapa se enjuagaron con agua destilada, empapado en /L de NaOH 0,3 mol durante 15 min a desulfonate las citosinas modificados, y luego desalaron en agua destilada a 60 ° C durante 2 horas. Finalmente, se añadieron 50 l de tampón de lisis que contiene 4 mg de proteinasa K, 2,5% de Tween 20, 50 mmol /L Tris, y 1 mmol /L EDTA en la tapa y se incubó a 50 ° C durante 24 horas, seguido por la desactivación de calor de proteinasa K a 95 ° C durante 10 min. En cada reacción AQAMA posterior, se utilizó 1-2 l de lisado como molde sin purificación de ADN.
Declaración de Ética
TURBOSO muestras de CRC se obtuvieron de pacientes que fueron sometidos a colectomía o proctectomía entre 1995 y 1998 en el Instituto de San Juan Health Center /John Wayne del cáncer, Santa Mónica, CA. El estudio fue revisado y aprobado por el Consejo /John Wayne Cancer Institute Centro de Salud de San Juan de Revisión Institucional (IRB) y el IRB occidental. Se obtuvo consentimiento escrito de los pacientes.
especímenes TURBA CRC
Todas las muestras de tejido fueron fijadas en formalina al 10% durante 24 horas y embebidos en parafina. Para LCM seguido por
In situ
SBM y LINE-1 metilación análisis por AQAMA, secciones (4 m) se cortaron con un micrótomo de cada bloque de turba. Las células se recogieron con el sistema automatizado LCM Veritas® (Life Technologies). Una de las ventajas de este sistema es que permite el control de los micrómetros cuadrados de células que son recogidos para cada muestra. Para evaluar las diferencias de LINE-1 estado de metilación entre la mucosa normal, adenoma, el cáncer y el tejido conectivo mesenquimales cáncer, 25 muestras de CCR precoz en adenoma (TisN0M0) fueron seleccionados por un patólogo (RRT), especializada en el CCR que contenía los cuatro de éstos categorías de tejidos. Para estudiar la alteración maligna, 94 muestras de CRC resecado quirúrgicamente se adquirieron para investigar la alteración de LINE-1 estado de metilación de acuerdo con la progresión del cáncer. LCM se realizó en ambos grupos de estudio. Se analizó la correlación entre el estadio clínico-patológicas tales como el estadio T, estado ganglionar y el estadio de Dukes y LINE-1 índice de metilación.
El análisis estadístico
Todos los datos se expresan como media +/- SD, y porcentajes según el caso.