Extracto
Aplicaciones
leucocitos niveles globales de metilación del ADN están siendo consideradas actualmente como biomarcadores de susceptibilidad al cáncer y se han asociado con el riesgo de varios tipos de cáncer. En este estudio, el objetivo fue examinar la asociación entre elementos nucleares largos períodos de actividad (línea 1) los niveles de metilación, como un biomarcador de la metilación del ADN a nivel mundial en el ADN de células sanguíneas, y el riesgo de cáncer de células renales.
Diseño Experimental
LINE-1 metilación del ADN genómico con bisulfito convertido aislado de leucocitos se cuantificó mediante pirosecuenciación medido por triplicado, y promedió en 4 sitios CpG. Se evaluaron un total de 328 casos y 654 controles RCC frecuencia igualada (02:01) en la edad (± 5 años), el sexo y el centro de estudios, a partir de un estudio de casos y controles a gran escala realizado en Europa central y oriental.
resultados
LINE-1 los niveles de metilación fueron significativamente mayores en los casos de CCR con una media de 81,97% (rango intercuartil [RIC]: 80,84-83,47) en comparación con el 81,67% (IQR: 80,35-83,03) entre los controles ( p = 0,003, Wilcoxon). En comparación con el LINE-1 metilación cuartil más bajo (Q1), las RUP ajustados para aumentar cuartiles de metilación fueron los siguientes: O (Q2) = 1,84 (1,20-2,81), O (Q3) = 1,72 (1,11-2,65) y O ( Q4) = 2,06 (1,34-3,17), con un p-tendencia = 0,004. La asociación fue más fuerte entre los fumadores actuales (p-tendencia y lt; 0,001) que los ex fumadores o nunca (p-interacción = 0,03). Para eliminar la posibilidad de sesgo de selección en los controles, la relación entre LINE-1 metilación y el tabaquismo fue evaluado y confirmado en un análisis caso solamente, también.
Conclusiones
Los niveles más altos de LINEA -1 metilación parece estar asociada positivamente con el riesgo de CCR, especialmente entre los fumadores actuales. Otras investigaciones utilizando ADN tanto previas y posteriores de diagnóstico genómico se justifica para confirmar los hallazgos y será necesario determinar si las diferencias observadas se producen antes de, o como resultado de la carcinogénesis
Visto:. Liao LM, Brennan P, van Bemmel DM, Zaridze D, Matveev V, Janout V, et al. (2011) Niveles LINE-1 metilación en el ADN de leucocitos y riesgo de cáncer de células renales. PLoS ONE 6 (11): e27361. doi: 10.1371 /journal.pone.0027361
Editor: Bernard W. Futscher, La Universidad de Arizona, Estados Unidos de América
Recibido: 27 Junio, 2011; Aceptado: 14 Octubre 2011; Publicado: 4 de noviembre 2011
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramural de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional del Cáncer, División de Epidemiología del Cáncer y Genética (Bethesda , MD, EE.UU.). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Región específica hipermetilación y la hipometilación global del ADN están asociados con la carcinogénesis [1]. hipermetilación aberrante del ADN tiende a ocurrir en regiones promotoras ricas en CpG y está asociada con el silenciamiento transcripcional de genes, tales como genes supresores de tumores [2]. Por el contrario, en todo el genoma hipometilación del ADN se produce principalmente en secuencias repetitivas de ADN, como las regiones heterochromatic y retrotransposones [3]. Varios estudios han observado una asociación entre los niveles de metilación de ADN de leucocitos y el riesgo de la vejiga, de mama, y el cáncer colorrectal [4], [5], [6], [7]. Sin embargo, la asociación entre los niveles de metilación global y cáncer de células renales (CCR) aún no ha sido evaluado.
Elementos
nucleares largos períodos de retrotransposones (no-LTR) no largo terminal de repetición (LINE-1) son que representan alrededor del 17% del genoma humano, con ~500,000 elementos normalmente dispersos por todo el genoma humano [3], [8]. elementos LINE-1 son típicamente fuertemente metiladas en los tejidos normales, mientras que LINE-1 hipometilación se ha informado en los tejidos de cáncer [9]. La cuantificación de la metilación CpG dentro de los elementos LINE-1 es un ensayo de alto rendimiento de bajo costo que se ha utilizado ampliamente como un proxy de la metilación de citosina mundial (5MeC) niveles [10], [11]. Varios estudios de casos y controles han sugerido que los niveles de LINE-1 metilación medidos en el ADN de leucocitos podría ser un biomarcador potencial de la susceptibilidad al cáncer y la inestabilidad genómica; Sin embargo, la relación entre LINE1 y otros biomarcadores de estado global de metilación como Alu [12] sólo se está empezando a ser explorado en grandes estudios bien diseñados de riesgo de cáncer [13], [14], [15], [16]. Por otra parte, las relaciones entre los niveles de metilación en los tejidos y muestras de ADN recogidas de tejidos proxy de forma no invasiva tampoco están bien entendidos.
La incidencia de CCR, la neoplasia maligna más común de cáncer renal, varía en todo el mundo [17], con algunas de las tasas más altas se producen en Europa del Este [18], [19] y central. El hábito de fumar, la obesidad y la hipertensión están bien establecidos los factores de riesgo para el CCR, pero éstos representan sólo aproximadamente el 50% de los casos [19]. Para explorar la posible influencia de la metilación global como un factor de riesgo de CCR, se compararon LINE-1 en los niveles de metilación en el ADN de leucocitos en un subconjunto de casos de RCC y controles inscritos en un estudio de casos y controles en múltiples centros. Hemos examinado el potencial efecto de modificación de la línea germinal por los polimorfismos comunes y conocidos factores de riesgo de CCR. Por último,
BVS
inactivación de genes en el tejido tumoral RCC es con frecuencia (hasta 91%) observada.
BVS
alteración, ya sea a través de la hipermetilación del promotor o alteraciones de la secuencia, se considera un evento temprano y frecuente en la carcinogénesis renal y se ha utilizado como un marcador biológico de la heterogeneidad del tumor renal. Por lo tanto, se evaluaron LINE-1 los niveles de metilación entre los subgrupos de casos heterogéneos para examinar si
BVS
alteración en el ADN tumoral podría ser modificadas por los niveles de metilación en el ADN genómico globales. > resultados
la mayoría de los participantes en el estudio eran de la República Checa, con una proporción ligeramente mayor entre los casos. Los casos eran más propensos que los controles para tener un índice de masa corporal mayor (p = 0,07) y tienen una menor ingesta de vegetales (p = 0,01; Tabla 1). Las distribuciones de la edad, el tabaquismo y la hipertensión referida fueron comparables entre los casos y controles.
El uso de modelos de regresión lineal, se evaluó la contribución de las características de los participantes seleccionados hipótesis de ser asociado con 1 LINE-niveles de metilación entre los controles (n = 654; Tabla 1). Entre los controles, los machos tenían estadísticamente significativamente más altos LINE-1 los niveles de metilación (mediana = 81.89%) que las mujeres (mediana = 81,29%; p = 0,0003). Los individuos que informaron tener hipertensión también se asociaron con mayores niveles estadísticamente significativos de LINE-1 metilación (media = 82,03%) que los que no lo hicieron (media = 81,46%; p = 0,04). Una diferencia significativa entre los centros también se ha detectado en los controles (p = 0.01), que se ajustará en nuestros modelos. No hay tendencias claras en LINE-1 los niveles de metilación según la edad, el tabaquismo, se detectaron IMC o el consumo de verduras entre los controles. La distribución de LINE-1% 5MeC entre los casos también se proporciona en la Tabla 1 para la comparación
En general, la mediana de LINE-1 los niveles de metilación fueron significativamente mayores en los casos de RCC 81,97%. (Rango intercuartil: 80,84-83,47) comparó al 81,67% (rango intercuartil: 80,35-83,03) entre los controles (p = 0,003, Wilcoxon, Tabla 1). En comparación con los individuos de la más baja LINE-1 metilación cuartil, los individuos en el cuartil más alto se asociaron con un mayor riesgo 2 veces mayor de RCC (p para la tendencia = 0,004, Tabla 2). La OR ajustada para el CCR en asociación con un aumento del 1% en general LINE-1 metilación fue de 1,10 (IC del 95%: 01.03 a 01.19; p = 0,008). La metilación varió ligeramente a través de cada uno de los cuatro sitios CpG secuenciados, con la mediana más baja% 5MeC observó en el cuarto locus (mediana de los casos: 78,4%, controles: 78,2%) y los niveles más altos en la primera locus (mediana de los casos: 85,4 %, controla: 84,8%). En comparación con los controles, los casos tuvieron estadísticamente significativamente mayor% 5MeC en cada locus (p-valores que van desde & lt; 0,0001 a 0,05, Wilcoxon). Superior% 5MeC en el locus 1 demostró la asociación más fuerte con el riesgo de CCR (OR = 1,24, IC del 95%: 1,14 a 1,35); Sin embargo, se observaron tendencias similares al alza en los otros tres loci (locus 2: OR = 1,07, IC del 95%: 0,99 a 1,14; locus 3: OR = 1,06, IC del 95%: 1,00 a 1,13; locus 4: OR = 1,05; IC del 95%: 0,99 a 1,11) guía empresas
En el análisis estratificado por el consumo de tabaco, el aumento del riesgo con el cuartil más alto 5MeC LINE-1% (Q4) fue más pronunciado entre los fumadores actuales (O
Q4 = 6,48; IC del 95%: 2,68 a 15,67; p-tendencia & lt; 0,0001) que entre los ex fumadores o nunca (p-interacción = 0,03; Figura 1). Una asociación positiva con el riesgo de CCR se restringió de manera similar a los fumadores actuales a través de loci individuales (Tabla S1). Para explorar más a fondo la interacción entre el tabaquismo y LINE-1 de alta% 5MeC (2T-4T), se realizó un análisis de casos y sólo para asegurarse de que la asociación no se debió a una serie de control que no era representativa de la población de estudio en relación con el consumo de tabaco. En comparación con los casos de RCC que nunca fueron fumadores, se observaron desviaciones positivas de multiplicatividad para los casos de RCC que eran o ex (IOR IC = 1,83, 95%: 0,69 a 4,83) o fumadores actuales (IOR IC = 2,47, 95%: 0,91 a 6,70 ; p-tendencia = 0,06). Esto indicaría que la relación del aumento de la metilación global y el CCR es más fuerte entre los fumadores actuales que nunca habían fumado. En ambos análisis, el consumo de tabaco y LINE-1 los niveles de metilación parecen modificar la contribución del otro factor de riesgo. análisis estratificados adicionales por sexo, índice de masa corporal, la ingesta de vegetales, y la hipertensión auto-reporte no dio lugar a ninguna diferencia significativa (datos no mostrados)
.
odds ratios y los intervalos de confianza del 95% para la asociación entre LINE-1 metilación niveles y RCC, ajustado por sexo, edad, centro, índice de masa corporal, presión arterial alta y la ingesta de vegetales.
para evaluar si la variación común en determinados genes implicados en el metabolismo de un carbono y el tabaco modificó la asociación observada , se realizaron análisis estratificados por siete variantes funcionales en cinco genes (
MTHFR, MTR, TYMS, GSTM1, España y
GSTTI
). Dos variantes genéticas,
MTHFR
c.1298A & gt; C y
MTR c.2756A & gt; G, España parecía influir en la asociación entre LINE-1 los niveles de metilación y el riesgo de RCC (Tabla 3). Se ha observado una fuerte tendencia positiva entre los cuartiles de metilación LINE-1 y el riesgo de CCR entre los que lleva al menos una copia del alelo menor de C
MTHFR
c.1298A & gt; C (p-tendencia = 0,0009; p interacción = 0,15). Aumento del riesgo con mayores niveles de LINE-1 metilación se limita a aquellos con el genotipo AA de
MTR c.2756A & gt; G gratis (p-tendencia = 0,004; p = 0,19 interacción) y no fue significativa entre aquellos lleva al menos una copia del alelo menor. Ninguna de estas dos variantes principales demostraron efectos estadísticamente significativas, que ha sido publicado previamente [20].
Debido a
BVS
inactivación de genes es un evento temprano frecuente en RCC que se ha utilizado para definir subgrupos moleculares de los cánceres renales [21], se exploró si la metilación global está relacionada con un determinado subconjunto de casos de RCC definido por el mecanismo a través del cual
BVS
inactivación de genes en el ADN del tumor se produce. Definimos subgrupos RCC como tener
BVS
inactivación de genes a través de mecanismos epigenéticos (hipermetilación del promotor), los mecanismos genéticos (cambios en la secuencia de codificación que darían lugar a una proteína alterada (es decir, mutaciones sin sentido, deleciones, inserciones, mutaciones del sitio de empalme) o tumores de tipo salvaje (los que no observables
BVS
inactivación). Entre un subconjunto de casos de CCR en la que estaba disponible en los datos
BVS
metilación del promotor o estado de alteración genética en el tejido somático (n = 144 ), el riesgo de tener una alteración en
BVS
aumentó con el aumento de los cuartiles de metilación (O
Q2 = 1,26 IC del 95%: 0,34 a 4,64; O
Q3 = 1,62, IC del 95% : 0,42-6,18; y O
Q4 = 2,57; IC del 95%:.. 0,68 a 9,72; p-tendencia = 0,12) Aunque se necesitan más casos sugestivos, para evaluar completamente esta asociación
Discusión
Este estudio evaluó el papel de LINE-1 metilación en el ADN de sangre periférica como un proxy para la metilación global en el tejido del tumor renal. en nuestro estudio, el aumento de LINE-1% 5MeC se asoció con un mayor riesgo de CCR. Superior LINE-1% los niveles 5MeC parecían ser un fuerte factor de riesgo para el desarrollo de CCR en los fumadores actuales que en los antiguos o que nunca han fumado. Además, los resultados de nuestro estudio sugieren una posible interacción entre LINE-1 metilación y
MTHFR
c.1298A & gt; Cand
MTR c.2756A & gt;. G
con CCR
la asociación se observó contrasta con lo que se ha observado en otros estudios epidemiológicos del cáncer. hipometilación del ADN Global en el tejido tumoral ha sido observada, pero varía ampliamente dentro y entre los tipos de cáncer [7], [22]. hipometilación del ADN global del ADN de leucocitos, medido por el contenido 5MeC%, se ha asociado con un mayor riesgo de cáncer en varios estudios recientes de casos y controles, incluyendo un gran estudio de casos y controles de cáncer de vejiga [4], [6], [7]. En varios estudios de casos y controles, los niveles más bajos de LINE-1 se ha asociado con un mayor riesgo de tumores testiculares [14], y gástrico [13], de cabeza y cuello [16], y el cáncer de vejiga [15]. Sin embargo, un pequeño estudio de cáncer de mama no encontró diferencias en los niveles de 5MeC% LINE-1 entre los casos y controles, pero significativamente más bajos niveles 5MeC% entre los casos [5]. Este mismo estudio también se observó que los niveles de 5MeC% y% 5MeC LINE-1 (ambos medidos en el ADN de leucocitos) no se correlacionan bien [5].
están disponibles en el impacto de los niveles de metilación del ADN global en datos limitados tumores renales y son difíciles de comparar debido a los diferentes métodos de evaluación de la metilación. A lo mejor de nuestro conocimiento, no hay datos disponibles sobre la correlación entre el estado global de la metilación en el suero y en el tejido renal. Entre los estudios de metilación del promotor, un estudio informó que el estado de metilación del promotor de
Wnt
genes medidos en el suero corresponde generalmente el de correspondientes muestras de tumores renales [23], mientras que la proporción de casos en que la metilación del promotor de la específica relacionada con el cáncer genes detectados en el suero emparejados con la metilación del mismo marcador en los tumores varió de 0 a 60% [24]. Unos pocos estudios han detectado un aumento global de la metilación en el tejido RCC. Arai et al. informaron de que los perfiles de metilación del ADN en todo el genoma, incluyendo la hipermetilación mundial, determinados a partir de tejido renal normal adyacente están altamente asociados con la agresividad de la correspondiente RCC [25]. Un pequeño estudio realizado por Minardi et al. observado un aumento significativo en la metilación global en los tejidos tumorales con el aumento del grado de RCC [26]. Dos estudios experimentales han descrito
LINEA
-1 estado de metilación en muestras de tejido de la CRC. Chalitchagorn et al. demostrado que LINE-1 metilación varió significativamente entre los diferentes tipos de tejidos, pero observó ninguna diferencia en
LINEA
-1 niveles hipometiladores entre CCR y los tejidos renales [9]. Otro estudio observó una ausencia de hipometilación de LINE-1 secuencias a través de diferentes etapas y grados de RCC, que estaba en contraste con otros carcinomas uroteliales [27]. En conjunto, estos estudios sugieren que el RCC puede carecer de la asociación típica con la metilación del ADN observado en otros tipos de cáncer; Sin embargo, dados los métodos de evaluación utilizados variable, se necesitan más estudios.
A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer estudio para encontrar una asociación con más bajos en lugar de LINE-1 los niveles de metilación más altos (medidos en leucocitos ADN) y el riesgo de cáncer. Phokaew et al. casos esporádicos observados de hipermetilación en LINE-1 loci entre las líneas celulares de cáncer [28]. la hipermetilación específica de LINE-1 también se ha informado en el crecimiento excesivo y diferenciación anormal de tejido de la placenta [29]. Aunque se espera que los niveles de metilación LINE-1 para proporcionar una evaluación rápida y fácil de metilación mundial, se estima que sólo un tercio de la metilación del ADN genómico que se producen en los elementos repetitivos [11]. También es posible que RCC tiene una relación inusual con la metilación dentro de elementos repetitivos en comparación con otros tipos de cáncer. Por último, hasta que nuestros hallazgos se replican también se mantiene la posibilidad de que la asociación se observó podría deberse al azar. La asociación observada parece algo robusto y consistente a través de nuestros análisis sugieren que estos resultados no se debían a la casualidad; Sin embargo, este hallazgo requiere la replicación en una segunda población de estudio.
En nuestra evaluación de los factores predictivos de LINE-1 en los niveles de metilación en el ADN de leucocitos, el sexo era la única característica que se asocia fuertemente con la variación en los niveles. Los hombres tenían niveles LINE-1 metilación significativamente mayores que las hembras, lo que está de acuerdo con otros estudios [14], [15], [16], [30], [31], [32], [33]. Auto-reporte de la hipertensión también se asoció con LINE-1 los niveles de metilación más altas, pero no ha sido evaluado previamente en estudios publicados. La edad se considera generalmente estar asociados inversamente con el aumento de la metilación global de [34]; Sin embargo, la edad no se correlacionó con los niveles de metilación LINE-1 en nuestro estudio o en varios estudios anteriores [9], [16], [31], [32], [35], [36]. El tabaquismo se ha asociado tanto con la hipermetilación del promotor y la hipometilación genómica en el ADN del tumor [16], [37]. Sin embargo, no se observó una asociación entre el consumo de tabaco y LINE-1 los niveles de metilación en el ADN de leucocitos, lo cual es consistente con los resultados de otros estudios [15], [16], [31], [32]. La falta de asociación entre 1 LINE-niveles de metilación en la sangre con diversas características de nuestro estudio fue generalmente similar a lo que se ha observado en otros estudios; Sin embargo, cabe señalar que nuestros controles pueden no ser representativos, ya que eran los controles basados en el hospital.
El fumar ha sido previamente vinculado a los niveles globales de metilación en el tejido tumoral [16], [37]. Con base en los datos de nuestro estudio y otros, sin embargo, no parece haber una relación bien definida con respecto al ADN genómico aislado de la sangre [15], [16], [31], [32]. Teniendo en cuenta los datos contradictorios sobre la asociación entre los niveles de tabaquismo y de metilación, es posible que el efecto de los agentes carcinógenos fumadores en estado de metilación puede ser diferente entre diferentes tipos de tejidos. En nuestros datos, el riesgo asociado con una mayor 5MeC% de LINE-1 parece ser mayor en los fumadores actuales, lo que sugiere una interacción entre el tabaquismo y LINE-1 hipermetilación. Cabe señalar que los informes anteriores de esta población de estudio no observaron un efecto principal de fumar, presumiblemente debido a alguna fuente de selección de control de polarización [38]. Sin embargo, nos dimos cuenta que entre los tres cuartiles más altos de LINE-1, tabaquismo actual se asoció con un aumento en el riesgo de CCR en comparación con los no fumadores. Para hacer frente a la polarización, se realizó un análisis de casos y solamente lo que minimiza cualquier posible sesgo de selección de la utilización de controles basados en el hospital. Estos resultados fueron similares entre los casos y confirmó que los fumadores actuales que están muy metilado dentro de LINE-1 tienen un mayor riesgo de CCR que las no fumadores que están muy metilado. Existen varios mecanismos posibles para cómo el fumar afecta el estado de metilación del ADN, como indirectamente a través de una mayor inflamación sistémica o daño doble hebra a la ruptura, o directamente a través de la expresión alterada de ADN metiltransferasas, pero el mecanismo exacto es poco conocido [39].
Como genes implicados en el metabolismo de un carbono se han asociado con los niveles de metilación global y RCC, se realizaron análisis exploratorios utilizando genotipo de datos disponibles para evaluar si los polimorfismos modifican la asociación entre LINE-1 los niveles de metilación y el riesgo de RCC. En el presente estudio, los resultados de dos variantes genéticas
MTHFR
c.1298A & gt; Cand
MTR c.2756A & gt; G
eran sugerentes. Otros estudios de metilación global y cáncer no se han observado diferencias notables en el riesgo de cáncer por estas variantes [4], [13], [15].
Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio para evaluar LINEA- 1 los niveles de metilación en el ADN de leucocitos y el riesgo de CCR. A pesar de que se ha seleccionado un subconjunto de la totalidad del estudio de casos y controles, este estudio tiene suficiente poder estadístico para detectar asociaciones y ellos no fueron diferentes al grupo en su conjunto. Una limitación es que este estudio de casos y controles incluidos los controles y el ADN de los casos se recogió antes del tratamiento aún después del diagnóstico basados en el hospital. No se detectó diferencias sustanciales en LINE-1 los niveles de metilación de los grupos de enfermedades entre los controles, o por estadio y el grado de los casos. Esto sugiere que la progresión de la enfermedad es menos probable que hayan afectado a nuestros resultados. El análisis de casos y sólo se llevó a cabo, elimina el potencial sesgo de selección que se produce con el uso de controles basados en el hospital, y apoyó la asociación observada en el análisis estratificado. Aunque los niveles de LINE-1 metilación se consideran como un proxy para la metilación del ADN mundial general, las dos medidas no son totalmente intercambiables y pueden ser diferentes de medición aspectos de la metilación global. De todos modos, muchos estudios han demostrado que el uso de LINE-1 los niveles de metilación en la sangre puede proporcionar un marcador útil para la enfermedad y ofrecerían un método simple, no invasivo para identificar individuos en riesgo de CCR
.
En resumen, nuestros resultados sugieren que los LINE-1 en los niveles de metilación en el ADN de leucocitos están asociados positivamente con el riesgo de CCR y pueden servir como un biomarcador para el CCR susceptibilidad. Investigaciones para determinar si la metilación en el ADN genómico mundial refleja las alteraciones epigenéticas en el tejido renal son necesarias para provocar aún más el papel de la epigenética y RCC. Para abordar estas cuestiones, los futuros estudios en muestras de ADN recogidas de forma prospectiva serán necesarios, así como los estudios diseñados para hacer frente a la interacción aparente entre el estado de metilación y el consumo de tabaco relacionado con el riesgo de CCR.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
el protocolo de estudio fue aprobado por los comités éticos pertinentes y las juntas de revisión institucional de todos los centros participantes, la Agencia Internacional para la Investigación sobre el cáncer (IARC) y el Instituto Nacional del cáncer (NCI) en el Institutos nacionales de Salud. Todos los sujetos de estudio y sus médicos siempre y consentimiento informado por escrito.
Población de estudio
El Estudio de Cáncer Renal en Europa Central y del Este (CEERCC) es un estudio de casos y controles basado en el hospital del cáncer renal (1.097 casos y 1.555 controles) que se llevó a cabo en siete centros en Europa Oriental y central (Moscú, Rusia; Bucarest, Rumania; Lodz, Polonia, y Praga, Olomouc, Ceske Budejovice y Brno, República Checa). La población de estudio se ha descrito anteriormente [40]. En pocas palabras, recién diagnosticado y confirmado histológicamente casos de cáncer renal, pero no la pelvis renal (CIE-0-2 código C64) entre las edades de 20 y 79 años fueron reclutados a partir de 1999 a través de las historias clínicas revisadas 2003. personal médico capacitado y se extrajo información sobre la fecha y el método de diagnóstico, la clasificación histológica, estadio y grado tumoral. controles elegibles fueron seleccionados de los pacientes ingresados en el mismo hospital que los casos de enfermedades no relacionadas con el tabaquismo o trastornos genitourinarios (a excepción de la hiperplasia benigna de próstata) y fueron a los casos relativos a la edad, el sexo, y centro de estudios igualado en frecuencia. No enfermedad única compuesta por más de 20% del grupo de control. Todos los casos y los controles reclutados eran caucásicos. Las tasas de respuesta en cada centro oscilaron entre 90,0 a la del 98,6% de los casos y desde 90,3 a la 96,1% de los controles. Estandarizados cuestionarios de frecuencia alimentaria y de estilo de vida se administraron personalmente por personal capacitado [38], [41].
Se recogieron muestras de sangre y se almacenaron a -80 ° C y posteriormente enviadas al Instituto Nacional del Cáncer (NCI). ADN genómico fue extraído de la capa leucocitaria por el método de fenol cloroformo estándar en el laboratorio NCI. Para evaluar la metilación global, hemos seleccionado un subconjunto de casos de RCC y controles con una gran cantidad de ADN disponible (≥10 g) y los datos sobre
BVS
estado utilizando los siguientes criterios coincidentes. Los controles fueron seleccionados al azar y la frecuencia de concordancia (2:1) sobre la edad (± 5 años), el sexo y el centro de estudios (si es posible) para obtener el poder suficiente (90% para detectar un menor de 1,80). Todos los sujetos de este estudio proporcionaron consentimiento informado por escrito. Este estudio fue aprobado por las juntas de revisión institucional del Instituto Nacional del Cáncer, la Agencia Internacional para la Investigación sobre el Cáncer (IARC), y cada centro participante.
Genotipado
ensayos de genotipado se realizaron a en genotipado del NCI . Los siguientes polimorfismos funcionales de un solo nucleótido (SNP) dentro de tres genes fueron considerados en este estudio debido a su papel en la prestación de los precursores necesarios para la síntesis y reparación del ADN, así como la metilación del ADN: 5,10 metilentetrahidrofolato reductasa (
MTHFR
; c.1298A & gt; C,
c.677C & gt; T): perfil, metiltransferasa 5-metiltetrahidrofolato-homocisteína (
MTR; c.2756A & gt; G
), y timidilato sintetasa (
TYMS ; Ex8 + 157C & gt; T, Ex8 + 227A & gt; G
). El glutatión S-transferasa mu 1 (
GSTM1
) y glutatión S-transferasa theta 1 (
GSTT1
) supresiones se seleccionó también a causa de las asociaciones anteriores con riesgo de CCR y su papel en el metabolismo de fase II . métodos experimentales específicos se han descrito previamente (http://snp500cancer.nci.nih.gov) [20], [42].
La cuantificación de LINE-1 los niveles de metilación
LINE-1 los niveles de metilación se cuantificaron usando un ensayo de pirosecuenciación en EpigenDx (Worcester, MA) [43], [44], [45]. Nuestro ensayo está diseñado para examinar el estado de metilación en cuatro sitios CpG en el promotor de la región LINE-1 (GenBank Nº de acceso: M80343, -605, -593, -590 y -583 pb del ATG de ORF1) [16], [46]. Brevemente, 500 ng de ADN de leucocitos fue bisulfato tratados y purificados utilizando el Zymo metilación del ADN Kit (Zymo investigación, Orange, CA). Bisulfato de ADN tratado se purificó y se eluyó en tampón de elución de 20 l. Cada PCR contenía 50 ul de tampón 10X PCR, 3,0 mM de MgCl
2, 200 mM dNTPs, 0,2 M cebadores, 1,25 U de ADN polimerasa (HotStar, Qiagen Inc., Alameda, CA) 1.25 U, y ~ 10 ng de ADN convertido con bisulfito . La polimerasa se activó por incubación a 95 ° C durante 10 min seguido de 34 ciclos de 95 ° C para 15 segundos, 45 ° C durante 30 seg y 72 ° C durante 30 seg. Se dejó que la reacción para extender durante 5 min a 72 ° C. Un cebador biotinilado universal, se utilizó en la reacción inicial de PCR para permitir el aislamiento de la amplificación, seguido de la desnaturalización y la liberación de un solo producto hebra para pirosecuenciación [47]. Los productos de PCR (10 l) se secuenciaron utilizando el sistema de SA PSQ96 pirosecuenciación (pirosecuenciación Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante (Qiagen) pirosecuenciación. El estado de metilación en cada uno de 4 loci se analizó individualmente como un /C SNP utilizando el software QCpG T (pirosecuenciación Qiagen). El estado de metilación en los cuatro loci se promedian en conjunto para proporcionar un estado general ciento 5MeC. A pyrogram de ejemplo se incluye como datos complementarios (Figura S1). Porcentaje de la metilación del ADN dentro de LINE-1 se midió por triplicado.
Análisis estadísticos
LINE-1 5MeC mediciones por triplicado se promediaron juntos. carreras individuales con & gt; 7,5% de bisulfito valores de citosina no convertidos y muestras con un coeficiente de variación (CV) & gt; 10% fueron excluidos de nuestro análisis (n = 19). Se realizó un análisis de sensibilidad, con exclusión de las personas con CV & gt; 5%. Esta exclusión no resultó en una diferencia significativa en las estimaciones de riesgo por al menos 10% y por lo tanto estos sujetos permanecieron en los análisis. Después de estas exclusiones, estaban disponibles en 982 muestras (328 casos y 654 controles RCC) de datos. Las diferencias entre los casos y los controles fueron probados utilizando importancia para las pruebas de rangos con signos de Wilcoxon. Para identificar los posibles factores determinantes de LINE-1 los niveles de metilación y /o factores que podrían modificar la asociación entre LINE-1 los niveles de metilación y el riesgo de cáncer renal, modelos de regresión lineal se utilizaron para evaluar las diferencias entre los controles en relación con las características seleccionadas. Se utilizó la distribución de LINE-1 media 5MeC% entre los controles para determinar los puntos de corte para los cuartiles. Para evaluar la asociación entre los niveles de LINE-1 metilación y RCC, modelos de regresión logística, ajustado por los factores de apareamiento, el estado del tabaco, índice de masa corporal, la ingesta de vegetales y la hipertensión referida, se utilizaron para estimar la odds ratio (OR) y los intervalos de confianza del 95% (IC 95%). Las pruebas de tendencia se calcularon mediante el modelado de una variable codificada 0, 1, 2 y 3 para cada cuartil. También el modelo LINE-1 como un valor continuo. Para evaluar el potencial efecto de la modificación LINE-1 metilación, análisis estratificados por el consumo de tabaco, sexo, índice de masa corporal, la ingesta de vegetales, la hipertensión y la percepción subjetiva de los SNPs seleccionados se llevaron a cabo. variantes funcionales comunes dentro de
MTHFR, MTR, TYMS, GSTM1, España y
GSTT1
fueron evaluados para la asociación con LINE-1 metilación. El alelo homocigoto importante fue codificado como el grupo de referencia, y los genotipos de alelos homocigotos y heterocigotos menores se combinaron entre sí debido al pequeño número de sujetos homocigotos para los alelos de menor importancia. Un análisis de casos y solamente la evaluación de la interacción entre el tabaquismo y LINE-1 los niveles de metilación también se llevó a cabo para proporcionar una estimación de la modificación del efecto (interacción O: IOR) que no sería influenciado por sesgos de selección entre nuestros controles. Los IOR representan la salida del efecto conjunto de fumar y LINE-1 metilación del esperado bajo un modelo multiplicativo sobre el riesgo de CCR. Todos los análisis se realizaron utilizando SAS versión 9.1. (SAS Institute, Cary, NC).
Apoyo a la Información
Figura S1.
de ejemplo pyrogram Manifestación niveles LINE-1 metilación.
doi: 10.1371 /journal.pone.0027361.s001 gratis (DOC)
Tabla S1.
análisis estratificado por niveles e Individual posición LINE-1 fumar. La odds ratio y los intervalos de confianza del 95% para la asociación entre los niveles de metilación LINE-1 y RCC, ajustado por sexo, edad, centro, índice de masa corporal, presión arterial alta y la ingesta de vegetales
doi: 10.1371. /journal.pone.0027361.s002 gratis (DOC)