Extracto
LIV-1, un transportador de zinc, es una molécula efectora aguas abajo de los factores de crecimiento solubles. Esta proteína se ha demostrado para promover epitelial a mesenquimal transición (EMT) en pancreático humano, de mama y células de cáncer de próstata. A pesar de la implicación de LIV-1 en el crecimiento del cáncer y la metástasis, no ha habido ningún estudio para determinar el papel de LIV-1 en la progresión del cáncer de próstata. Por otra parte, no había una clara delimitación del mecanismo molecular subyacente función LIV-1 en las células cancerosas. En la presente comunicación, se halló una mayor LIV-1 en la expresión, PIN, el cáncer de próstata metastásico humano primario y óseo benigno. Nos caracteriza el mecanismo por el cual LIV-1 conduce EMT cáncer de próstata humano en una células de cáncer de próstata refractario a los andrógenos (ARCAP) cáncer de próstata modelo de metástasis ósea. LIV-1, cuando se sobreexpresa en ARCAP
E (células derivadas de ARCAP con fenotipo epitelial de las células), promovido EMT de forma irreversible. LIV-1 sobreexpresado ARCAP
células E tenían niveles elevados de HB-EGF y metaloproteinasas de matriz (MMP) actividades enzimáticas 2 y MMP 9 proteolítica, sin afectar a la concentración intracelular de zinc. La activación de las MMP dio como resultado el derramamiento de factor de heparina de crecimiento de unión-epidérmica (HB-EGF) de ARCAP
células E que provocaban crecimiento epidérmico constitutiva del receptor del factor (EGFR) fosforilación y su cinasa regulada por señal extracelular aguas abajo (ERK) de señalización. Estos resultados sugieren que LIV-1 está implicada en la progresión del cáncer de próstata como una diana intracelular de señalización del receptor de factor de crecimiento que promueve EMT y metástasis del cáncer. LIV-1 podría ser una atractiva diana terapéutica para la erradicación del cáncer preexistente humano de próstata y metástasis ósea y de tejidos blandos
Visto:. Lue HW, Yang X, Wang R, W Qian, Xu rzh, Lyles R, et al. (2011) LIV-1 promueve el cáncer de próstata epitelio-mesenquimal transición y la metástasis a través de HB-EGF vertimiento y EGFR mediada por ERK señalización. PLoS ONE 6 (11): e27720. doi: 10.1371 /journal.pone.0027720
Editor: Wafik S. El-Deiry, Instituto de Cáncer de Penn State Hershey, Estados Unidos de América
Recibido: 22 Junio, 2011; Aceptado: 23 de octubre de 2011; Publicado: 16 de noviembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Lue et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo está apoyado por becas de investigación y 2PO1CA098912 5RO1CA122602 (LWKC) de los Institutos nacionales de la Salud Instituto /Nacional del cáncer (http://www.nih.gov) y W81XWH-07-0172 (LWKC) del Departamento de Defensa de los Estados Unidos (http://cdmrp.army.mil/pcrp). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
LIV-1, una proteína de superficie celular y un mediador candidato de la molécula de señalización provocada por factores de crecimiento, se ha asociado con varios procesos biológicos importantes, al servir como un transportador para el zinc y otros iones [1], [ ,,,0],2], [3], [4], [5]. Como prototipo de la LIV-1 subfamilia de transportadores postal de metal [5], [6], LIV-1 comparte estructura secundaria con los transportadores de ZIP y puede tener la capacidad para el transporte de iones metálicos. LIV-1 ha demostrado ser un mediador aguas abajo de transductor de señal y activador de la transcripción 3 (STAT3) y Snail, cooperando con el caracol en la represión de epitelial marcador de E-cadherina (E-cad) la transcripción de genes [7]. LIV-1 también ha demostrado ser un socio interactuar para el receptor de estrógeno (ER) en los tejidos sensibles a las hormonas [3], [8]. En la línea celular de cáncer de mama ER-positivo ZR-75-1, LIV-1 de transcripción es inducida por los estrógenos [9]. En los tumores de mama, LIV-1 de expresión se asocia con la condición de ER [10], [11], y se correlaciona positivamente con la propagación del cáncer a los ganglios linfáticos regionales [12]. En el cáncer de cuello de útero, la expresión de LIV-1 ha demostrado ser más alta en el tumor que los tejidos normales; supresión de LIV-1 proliferación celular significativamente inhibido, la formación de colonias RNAi mediada, y la reducción de la capacidad migratoria e invasiva de las células HeLa [13]. LIV-1 también se ha informado a ser elevados en carcinoma de páncreas clínica e inducida EMT en las células de cáncer de páncreas [14]. En el pez cebra, LIV-1 es esencial para la localización nuclear de caracol, un factor de transcripción principal promover transición epitelial a mesenquimal (EMT), causando la migración de la organización de gástrula células [15]. LIV-1 por lo tanto es un cofactor obligatoria la regulación de los genes asociados a EMT [14], [15], [16].
El valor diagnóstico y pronóstico potencial de la LIV-1 en el cáncer de próstata humano no ha sido investigado. Dado que el zinc juega un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis de las células epiteliales de próstata [17], y el caracol es una célula clave factor de transcripción que controla el cáncer de próstata EMT [18], [19], [20], LIV-1 puede ser un participante activo en la promoción de la EMT durante la progresión del cáncer de próstata y metástasis óseas. En este estudio, se determinó el nivel de LIV-1 en líneas celulares de cáncer de próstata humano y muestras de tejido clínicos para definir la relación entre LIV-1 y de la próstata la progresión del cáncer y la metástasis. El modelo de célula de la progresión del cáncer de próstata humano ARCAP se utilizó para evaluar el papel de LIV-1. Nuestro estudio encontró que LIV-1 sobreexpresión promueve EMT de células de cáncer de próstata y facilita su metástasis al hueso y los tejidos blandos. La investigación adicional reveló que mecanicista LIV-1 sobreexpresión podría regular al alza HB-EGF y MMP2 y MMP9 expresión. Este último podría enzimáticamente Cleave unida a la membrana HB-EGF, para producir solubles HB-EGF que constitutivamente activa a través de EGFR aumento de la fosforilación de EGFR y su señalización de ERK aguas abajo. Los resultados de este estudio demuestran que anormalmente mejorada LIV-1 de expresión es un marcador de la progresión del cáncer de próstata, y se activan LIV-1 es responsable de la activación constitutiva de EGFR que acciona EMT. LIV-1 podría ser una nueva diana terapéutica atractiva para la inhibición de la EMT cáncer de próstata y metástasis ósea y de tejidos blandos.
Materiales y Métodos
Ética declaración
Todo el trabajo con animales se llevó a cabo de acuerdo con las directrices nacionales e internacionales pertinentes, y fue aprobado por el Comité de Cuidado y uso de Animales Institucional (IACUC) de la Escuela de Medicina de la Universidad Emory de (Permiso número 254-2008).
líneas celulares y cultivo celular
cáncer de próstata humano ARCAP
e y ARCAP
M células (células derivadas de ARCAP con fenotipo epitelial y mesenquimal, respectivamente) se establecieron en nuestro laboratorio [21]. Las células fueron cultivadas en T-medio (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con suero bovino fetal 5% (FBS, Atlanta Biológicos, Lawrenceville, GA). células HEK293 de riñón embrionario humano se obtuvieron de American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se cultivaron en DMEM (Invitrogen) suplementado con 10% FBS. RPMI-1640 se adquirió de Invitrogen (Carlsbad, CA). Todos los medios de cultivo se suplementaron con penicilina (100 U /ml) y estreptomicina (100 mg /ml). Los cultivos celulares se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada suplementada con 5% de CO
2.
Los anticuerpos y reactivos
anticuerpo policlonal de conejo contra la LIV-1 fue generada en nuestro laboratorio. Se inmunizaron conejos mediante protocolo de inmunización estándar con péptido conjugado KLH-CPDHDSDSSGKDPRNS, correspondiente a los residuos 146-161 de la proteína H-1 (número de acceso de GenBank NM_012319). La sangre se tomó 2 semanas después de la cuarta impulso y IgG se purificaron y se prueba para la reactividad inmunológica específica. anticuerpo policlonal a E-cadherina (E-cad), anticuerpo monoclonal al anticuerpo vimentina y fosfo-EGFR fueron adquiridos de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA). El anticuerpo monoclonal de N-cadherina (N-cad) y EGFR eran de BD Transduction Laboratories (San Diego, CA). Los anticuerpos para p44 /42 MAP quinasa y las isoformas fosforiladas eran de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). El anticuerpo monoclonal de ß-actina fue de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
similar a la insulina factor de crecimiento 1 (IGF-1) y factor de crecimiento transformante-β1 (TGF-β1) se compraron de Diagnostic Systems Laboratories (Webster, TX). el factor de crecimiento epidérmico (EGF) era de I + amp; D Systems (Minneapolis, MN). Tirfostina AG1478, U0126 y la MMP-2/9 inhibidor III se obtuvieron de los laboratorios Alomone (Jerusalem, Israel), Cell Signaling Technology (Danvers, MA), y Calbiochem (Darmstadt, Alemania), respectivamente.
La transfección
región codificante para el consumo humano LIV-1 de ADNc de longitud completa se clonó y se confirmó mediante secuenciación de ADN. El cDNA fue clonado aguas abajo de un promotor temprano de citomegalovirus en el vector de expresión de mamífero pcDNA3.1 /V5-His (Invitrogen). HEK293 y ARCAP
E células se sembraron a 3 × 10
5 células por pocillo en placas de 6 pocillos 24 horas antes de la transfección. Las células fueron transfectadas con 4 g de la construcción de expresión LIV-1 usando Lipofectamine 8 l 2000 (Invitrogen). Para aislar clones que sobreexpresan de forma estable ARCAP LIV-1, transfectadas
células E fueron tratados con G418 (600 mg /ml) 2 días después de la transfección. Cuatro clones individuales que sobreexpresan la proteína H-1 (LIV#8,#12,#14 y#17) y dos clones transfectados con el vector de control (CON1 y CON2) fueron utilizados para los estudios.
siRNA desmontables
LIV-1 siRNA se adquirió de Invitrogen. ARCAP
M células se sembraron a 3 × 10
5 células por pocillo en placas de 6 pocillos durante 24 horas. Las células se transfectaron con 2,5 l de 20 mM LIV-1 siRNA o igual cantidad de control universal siRNA, utilizando Lipofectamine 8 l 2000 por pocillo. Las células se recogieron y se analizaron 48 horas después de la transfección.
análisis de expresión semicuantitativo con reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR)
El ARN total se aisló a partir de células cultivadas utilizando el RNeasy Mini Kit ( Qiagen, Valencia, CA). De cada muestra, se utilizó la misma cantidad de ARN (2 g) en la reacción de síntesis de ADNc de primera cadena con el kit de síntesis de cDNA superíndice primer capítulo (Invitrogen). Volúmenes iguales de ADNc (3 l) de cada reacción se utilizaron para el análisis de PCR utilizando genes específicos de pares de cebadores de oligonucleótido: 5'-GCAATGGCGAGGAAGTTATCT-3 'y 5'-CTATTGTCTCTAGAAAGTGAG-3' para LIV-1; 5'-TGCCCAGAAAATGAAAAAGG-3 'y 5'-GTGTATGTGGCAATGCGTTC-3' para E-cad; ; 5'-CCATCACTCGGCTTAATGGT-3 'y 5'-GATGATGATGCAGAGCAGGA-3' para N-cad; 5'-CGAAAGGCCTTCAACTGCAAAT-3 'y 5'-ACTGGTACTTCTTGACATCTG-3' para el caracol; 5'-TGCCCGGCGGAATCTCCTGA-3 'y 5'-GATGCAGGAGGGAGCCCGGA-3' para HB-EGF; 5'-GCTGTCTGCGTGGTGGTGCT 3 'y 5' TGGTGTGGTGGGTCCAGGGC -3 'de EGF; y 5'-TTAGCACCCCTGGCCAAGG-3 'y 5'-CTTACTCCTTGGAGGCCATG-3' para GAPDH. Las reacciones se iniciaron con una incubación de 4 minutos a 94 ° C, seguido de 30 ciclos a 94 ° C durante 30 segundos, 55 ° C durante 30 segundos, y 72 ° C durante 1 minuto. La reacción se completó con una extensión de 7 minutos a 70 ° C durante 7 minutos. Los productos de PCR se visualizaron después de la electroforesis a través de un gel de agarosa al 1,2% y se tiñeron con bromuro de etidio (0,5 mg /ml).
Western blotting
Las células en 80% de confluencia fueron lisadas en un conjunto de células tampón de lisis como se informó anteriormente [22]. Los lisados se incubaron en hielo durante 30 minutos y se centrifugaron a 10.000 rpm a 4 ° C durante 10 minutos. De cada muestra, 35 g de proteína en el sobrenadante se resolvió mediante SDS-PAGE y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa (BioRad, Hercules, CA), que fue bloqueada en 5% de leche desnatada en PBST (NaCl 137 mM, fosfato 12 mM, 2,7 KCl mM, y 0,1% de Tween 20) a temperatura ambiente durante 20 minutos y se incubaron con anticuerpo primario a 4 ° C durante la noche. A continuación, las membranas se lavaron tres veces en PBST y se incubaron con anticuerpo secundario de rábano picante conjugado con peroxidasa durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de cinco lavados en PBST, las señales específicas se detectaron por incubación de la membrana con el reactivo ECL (Amersham-Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
Medición de la concentración intracelular de zinc
Se utilizaron dos métodos para determinar concentración intracelular de zinc. Para preparar las muestras para el ensayo de zinc intracelular total por el espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS), las células se cultivaron a 80% de confluencia se tripsinizaron y se lavaron en PBS, y luego incubadas en 300 l de ácido nítrico al 70% a 37 ° C durante 2 horas. Las células se colocaron después en ácido nítrico 2% y se sometieron a ICP-MS con un instrumento Varian. Una curva estándar se generó con diluciones en serie de normas de instrumentos zinc. Para preparar las muestras para el ensayo de zinc lábil intracelular por el método fluorométrico, las células se sembraron a 3 × 10
5 células por pocillo en placas de 6 pocillos el día antes de la medición. Las células se cargaron con 2 M de FluoZIN-03 a.m. (Invitrogen) durante 1 hora en Opti-MEM que contiene 0,02% de Pluronic F127 (Invitrogen). Después de lavar en PBS, las células cargadas se incubaron en libre de indicador de Opti-MEM durante 30 minutos. La fluorescencia de la FluoZin-3 se midió utilizando un Victor PE
3 V lector de placas.
rasguño de la cicatrización de heridas ensayo
ARCAP células M transfectadas transitoriamente con LIV-1 siRNA o control universal siRNA se utilizaron para determinar el comportamiento migratorio. Las células se rascaron suavemente y poco a poco con una punta de pipeta 10 l a través del centro del pozo 48 horas después de la transfección. Después de rascarse, el pocillo se lavó suavemente dos veces con medio para eliminar las células separadas. El pozo se rellena con medio fresco. Las fotografías fueron tomadas 48 horas después del rascado. Se documentaron varios puntos de vista de cada pocillo, y se llevaron a cabo tres experimentos independientes.
ensayos
migración trans-bien y de invasión
Para realizar un ensayo de migración trans-Bueno, 2,5 × 10
4 las células en la cámara superior de placas Transwell de 24 pocillos de 8 micras de tamaño de poro (BD Biosciences) se incubaron durante 16 horas en medio completo que se añadió a la cámara inferior. Las células fueron fijadas con formalina y se tiñeron con 0,5% de cristal violeta. Las células no migradas dentro de la cámara se eliminaron en muestras de secreciones. El cristal violeta para las células que migran se solubilizó en tampón de Sorenson (citrato de sodio 0,1 M y 50% de etanol, pH 4,2) y se midió la absorbancia a OD
590. El ensayo de invasión se realizó utilizando cámaras de invasión BD BioCoat Matrigel (BD Biosciences, de 8 micras de tamaño de poro). Se utilizaron los mismos procedimientos descritos anteriormente, excepto los filtros se pre-recubrieron con 100 l de Matrigel a una dilución 1:04 en medio RPMI-1640.
Evaluación de los potenciales de tumorigénicas y metastásicas
El funcional papeles de LIV-1 en la formación de tumores de próstata y metástasis se evaluaron como se informó anteriormente [23]. Para evaluar el crecimiento local del tumor, los ratones macho atímicos 4 semanas de edad (Ncr-nu /nu, Instituto Nacional del Cáncer, Frederick, MD) fueron inoculados por vía subcutánea con ARCAP
células E (1 × 10
6 en 50 l PBS) establemente transducidas con LIV-1. dimensión del tumor se midió con un calibrador en días 23, 32, 43, y 50 después de la inyección, y el volumen del tumor se calculó como la longitud x anchura x altura x 0,5236 [24]. Para evaluar las metástasis del cáncer, los ratones macho atímicos se inocularon con intracardiacally ARCAP
células E (2 × 10
6 en 100 l de PBS) de forma estable transducidas con LIV-1 a los ventrículos izquierdos. Los animales fueron observados durante 4 meses para el desarrollo de las lesiones metastásicas. Las metástasis óseas se registraron mediante radiografía de rayos X y la metástasis de tejidos blandos fueron confirmados por histopatología
La inmunohistoquímica (IHC) de los microarrays de tejidos (TMA)
Los tejidos normales y enfermos de próstata analizadas eran de.: 1) Una medida TMA con los tejidos normales de la próstata a partir de 4 hombres sanos; cáncer emparejado, benignos y los tejidos de PIN de los casos de cáncer de próstata 12; emparejado tejidos benignos y cáncer en 11 casos; emparejado PIN y el cáncer de 1 caso; hiperplasia benigna de próstata (BPH) a partir de 2 casos; y el cáncer de próstata metástasis ósea de los casos de cáncer de próstata 3. 2) Una medida TMA consistió en 47 tejidos de metástasis óseas de los pacientes de cáncer 11 de próstata. 3) Cuatro TMA conteniendo cada uno 66 casos de cáncer de próstata y trastornos de la próstata benigna (US Biomax. Rockville, MD)
.
El protocolo de IHC para la evaluación de la expresión génica se ha comunicado [22]. Brevemente, las muestras fueron deparaffinized, rehidratada y se someten a recuperación del antígeno. Después de bloquear la peroxidasa endógena, las muestras se incubaron con anticuerpo primario a 4 ° C durante la noche, seguido de una incubación de 30 minutos con el reactivo de DakoCytomation EnVision + HRP. Se detectaron señales mediante la adición de diaminobencidina como cromógeno y hematoxilina por counterstaining. suero de conejo pre-inmunización sirvió como control negativo. tinción IHC fue marcado por dos investigadores de forma independiente con base en cuatro intensidades de tinción de 0 a +++ como se informó anteriormente [22].
Gelatina zymography
Todos los reactivos zimografía de gelatina se compraron de Invitrogen. Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 libre de suero durante 24 horas y se recogió el medio acondicionado. La proteína en el medio se concentró con un AmiconUltracel 30 KDa de filtro (Millipore, Billerica, MA). Cantidades iguales de proteína (10 mg /muestra) se mezclaron con 2 x tampón de muestra Novex Tris-glicina SDS, y se fraccionó en un gel de gelatina al 10% en condiciones no reductoras. A continuación, el gel se incubó a 37 ° C en tampón durante 30 minutos renaturalización y en el desarrollo de tampón durante 30 minutos. Por último, el gel se tiñó en SimplyBlue Safestain, y se cuantificaron las bandas que representan la actividad gelatinasa de MMP2 y MMP9.
ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (
ELISA
) para HB-EGF
Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 libre de suero durante 24 horas. El medio acondicionado se recogió y se analizó la concentración de HB-EGF con el kit Human HB-EGF Duoset ELISA (R & amp; D Systems), siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Cada muestra de tres experimentos independientes se ensayó por triplicado.
El análisis estadístico
Para analizar la posible asociación entre la expresión de la proteína de próstata y la progresión del cáncer LIV-1 de la neoplasia benigna, normales /intraepitelial prostática (PIN ), cáncer primario localizado, a la metástasis ósea, el nivel de expresión LIV-1 se divide en dos categorías: intensidad de la tinción de alta (3) vs. medio para anular (2-0, respectivamente). Se utilizó la prueba no paramétrica de Kruskal Wallis para determinar la igualdad de las medianas de población entre las progresiones de cáncer de próstata, PIN, cáncer primario y la metástasis ósea normal /benigna. Esta prueba es equivalente a la prueba de ANOVA paramétrico usado cuando hay más de dos grupos que se comparan. Se aplicó el test no paramétrico de Mann-Whitney para determinar la igualdad de las medianas de población entre dos progresiones cáncer, 1) la metástasis ósea vs cáncer localizado; y 2) la metástasis ósea vs cáncer localizado benigno, PIN y primaria. Esta prueba es equivalente a la t-prueba paramétrica utilizado cuando sólo hay dos grupos que se comparan. Se utilizó regresión logística para modelar la relación entre las puntuaciones de Gleason binarios que se divide en variables binarias de bien diferenciado (GI≤6) vs. moderada a (GI≥7) cáncer de próstata pobremente diferenciado. SAS y Minitab se utilizaron en este análisis.
Resultados
El cáncer de próstata humano células ARCAP establecieron en nuestro laboratorio [21] se puede promover fácilmente a someterse a EMT en respuesta a factores solubles y proteínas de la matriz presentes en el microambiente del tumor [20], [25], [26], [27]. Para elucidar el mecanismo molecular que regula EMT, epiteliales ARCAP
E se analizó para la expresión diferencial de genes en respuesta a factores solubles, en comparación con su ARCAP
M homólogo que muestra un fenotipo mesenquimal. LIV-1 fue uno de los genes expresados diferencialmente identificados [27]. En el presente estudio, se investigó el papel de la LIV-1 en la regulación de la EMT en las células ARCAP para evaluar el posible mecanismo de acción LIV-1 en la promoción del hueso del cáncer de próstata y metástasis de tejidos blandos.
LIV-1 estuvo involucrado en la promoción de la EMT en el modelo celular ARCAP
Hemos informado anteriormente de que ARCAP
e células se sometieron a EMT durante el tratamiento con factores solubles incluyendo IGF-1, EGF, TGF-β1 y el β-2 microglobulina (β -2M) [20], [25], [26], [27]. En el presente estudio, cuando ARCAP
células E se trataron con TGF-β1 o IGF-1, una inducción de la LIV-1 se detectó expresión tanto por RT-PCR y análisis de transferencia Western (Figura 1A). Cuando se añadieron diferentes concentraciones de IGF-1 al medio de inducción, se encontró que la capacidad de respuesta de LIV-1 de expresión a ser dependiente de la dosis (Figura 1A). inducida por IGF-1 LIV-1 expresión en ARCAP
células E ocurrió concomitantemente con un interruptor de la morfología celular y la expresión génica hacia fenotipo mesenquimal,
es decir
, la pérdida de la morfología del epitelio polarizado fuertemente adhesivo para convertirse libremente dispersado células fibroblásticas con el aumento de expresión de N-cad y vimentina pero disminución de la expresión de e-cad, un sello retenido por las células epiteliales polarizadas (Figura 1B). Activado LIV-1 de expresión parecía ocurrir simultáneamente con la transición de ARCAP
E para ARCAP
M, una variante ARCAP mesenquimales [21].
El papel de la LIV-1 fue evaluada por su cambiado expresión durante la EMT. A, ARCAP
células E se trataron durante 48 horas con factores de crecimiento para inducir la EMT. RT-PCR e inmunotransferencia de tipo Western se utilizaron para mostrar una mayor expresión LIV-1 (panel izquierdo), y la capacidad de respuesta de dosis de la expresión (panel derecho). B, se utilizó Western Blot para confirmar los cambios expressional EMT-como en el ARCAP tratada
células E. C, mesenquimal de las células como ARCAP
M células fueron sometidas a siRNA desmontables para LIV-1 de expresión durante 48 horas. RT-PCR e inmunotransferencia de tipo Western se utilizaron para detectar los cambios que reflejan expressional reversión de EMT en las células tratadas. Se utilizaron D, Scratch cicatrización de heridas y Transwell invasión ensayos para determinar el comportamiento migratorio e invasivo en ARCAP siRNA tratada
células M. * Indica significación estadística en comparación con el clon de control con1 (P & lt; 0,05). E, ARCAP
E células fueron transfectadas con LIV-1 construcción de expresión. RT-PCR y Western Blot se realizaron 48 horas después de la transfección para detectar cambios que reflejan expressional eventos EMT-similares. GAPDH sirvió como un control interno para las reacciones de RT-PCR, y β-actina se utilizó como control de carga en el Western Blot.
Para definir el papel de la LIV-1 en la mediación de la EMT, que transitoriamente reducido el nivel LIV-1 en el mesenquimales-como ARCAP
células M por siRNA desmontables. ARCAP
M células tratadas con específica LIV-1 siRNA mostraron una reducción marcada LIV-1 transcripciones (Figura 1C). Es importante destacar que las células tratadas mostraron disminución de la expresión de marcadores mesenquimales N-cad y caracol, pero aumento de la expresión del gen de la E-cad tanto en RT-PCR y análisis de transferencia Western (Figura 1C). Además, ARCAP
M células tratadas con específica LIV-1 siRNA presentaron menor cantidad capacidad migratoria e invasiva en cero la cicatrización de heridas y transwell ensayos de invasión (Figura 1D). Estos resultados sugieren que LIV-1 de expresión se asocia con EMT y la disminución de LIV-1 que conduce a la expresión mesenquimal epitelial de transición (MET), una inversión de la EMT. La presencia de LIV-1 parecía ser necesarios para el mantenimiento de un fenotipo mesenquimal.
A continuación examinó si elevado LIV-1 en las células
E ARCAP tipo epitelial sería suficiente para iniciar la EMT, tal como se evaluó por análisis moleculares. Después de la transfección transitoria con un constructo de expresión LIV-1, ARCAP
células E fueron examinados por tanto RT-PCR y ensayos de Western blot para la expresión de marcadores asociados-EMT. El ARCAP transfectadas
células E que se muestra aumentó notablemente LIV-1 de expresión (Figura 1E), acompañado por el aumento de N-cad y Caracol, sino una disminución de la expresión de E-cad. Estos cambios expressional estaban de acuerdo con las observadas en EMT provocada por factores de crecimiento (Figura 1B). Los resultados de LIV-1 siRNA desmontables y LIV-1 sobreexpresión de estudios en ARCAP
M y ARCAP
E sugirieron que las células LIV-1 sirve un regulador clave de la EMT en las células de cáncer de próstata humano.
Producción y caracterización de anticuerpos policlonales a LIV-1 humano
Para evaluar si LIV-1 de expresión se asocia con la progresión clínica de cáncer de próstata humano, hemos planteado anticuerpos policlonales por inmunización de conejos con un LIV-1 péptido conjugado con KLH. La especificidad de los anticuerpos LIV-1 se confirmó mediante transferencia Western de los extractos de células enteras a partir de células que sobreexpresan exógeno LIV-1. A partir de las células HEK293 transfectadas transitoriamente con LIV-1, se observó un único inmune proteína reactiva LIV-1, a 110 kDa (Figura 2A). Puesto que el peso molecular calculado de la proteína LIV-1 es 90 kDa [5], el diferencial de 20 kDa entre la detectadas y los tamaños predichos probable se atribuyó a la N-glicosilación de la proteína LIV-1, como [5] se informó anteriormente. Es importante destacar que la señal detectada por los anticuerpos LIV-1 fue abolida cuando los anticuerpos se pre-adsorbidos con el péptido LIV-1 utilizado en la inmunización. Además, no se detectó aumento de la intensidad de la señal en ARCAP
células E transfectadas transitoriamente con la construcción de expresión LIV-1, mientras que una reducción de la señal se observó en ARCAP
células M tratados con un transitorio LIV-1 vector caída en tanto Western Blot y ensayos de IHC (Figura 2B y 2C). Estos resultados indican que los anticuerpos producidos LIV-1 podría detectar específicamente la proteína H-1, que fue modificada en las líneas celulares ensayadas.
Los anticuerpos producidos a LIV-1 fueron sometidos a la validación de la especificidad. A, las células HEK293 transfectadas transitoriamente con el constructo de expresión LIV-1 fueron sometidos a análisis de transferencia Western con los anticuerpos a LIV-1 (panel superior). La especificidad del anticuerpo se determinó mediante pre-absorción del anticuerpo con el péptido inmunizante (panel medio). B,
células ARCAP E fueron transfectadas transitoriamente con la construcción de expresión LIV-1 para sobreexpresar
células LIV-1 y M ARCAP con el siRNA para suprimir LIV-1 de expresión. En los 2 paneles superiores, Western Blot se realizó 48 horas más tarde con los anticuerpos a LIV-1. En la parte inferior 2 paneles, estas células fueron examinadas por RT-PCR para confirmar la expresión LIV-1. β-actina se utilizó como control en el Western Blot y GAPDH se utilizó como control para el análisis de RT-PCR. C, IHC se realizó para confirmar aún más LIV-1 Ab especificidad en ARCAP
células E transfectadas transitoriamente con la construcción de expresión LIV-1 y
células ARCAP M transitoriamente transfectadas con el ARNsi específico (200 ×).
Estable LIV-1 inducida por la sobreexpresión de EMT en
células ARCAP E
Después de caída transitoria de la LIV-1 en ARCAP
células M, una inversión prevista de la forma de las células de fibroblastos mesenquimales a la morfología epitelial se observó. Estos interruptores morfológicas eran fácilmente detectables por los cambios de expresión génica (Figura 1C). Por el contrario, la sobreexpresión de forma transitoria LIV-1 en ARCAP
E células no indujo mesenquimales transición morfológica, a pesar de los cambios expressional concertados indicativa de la EMT (Figura 1E). Se sospecha que la falta de cambios morfológicos puede ser atribuible a la naturaleza de la transfección transitoria. De acuerdo con ello, se establecieron estables ARCAP
clones E para evaluar si LIV-1 es un regulador crítico asociado con morfológica así como la transición expressional y de comportamiento de un epitelial a un fenotipo mesenquimal.
Se aislaron 4 ARCAP
clones e (LIV#8, 12, 14 y 17) de forma estable que expresan altos niveles de proteína LIV-1, tal como se detectó por transferencia Western (Figura 3A). Dos clones de control (CON1 y CON2) también se aislaron de la transfección con el vector de control. Los sobreexpresan LIV-1 mostraron cambios expressional EMT-como típicos, con una disminución de la expresión de E-cad pero aumentaron N-cad y expresiones del caracol (Figura 3A). Significativamente, todos los clones mostraron notablemente cambian la morfología celular: en lugar del tamaño de células pequeñas con forma de adoquines-como con fuerza dispuestas contacto intercelular típico de la ARCAP
E celular similar epitelial, los cuatro clones adaptados morfología notablemente alterada mostrando una pérdida de de contacto intercelular y morfología de las células mesenquimales en forma de huso típica (Figura 3B). La transición morfológica era permanente e irreversible, que persiste después de más de 30 pases en cultivo continuo, mientras que los dos clones transfectados con vector permanecieron celular similar epitelial. Parece que estable LIV-1 sobreexpresión podría traer tanto morfológicas y bioquímicas de transición EMT. LIV-1 es, pues, un potente promotor de la EMT en ARCAP
células E.
ARCAP
E clones que sobreexpresan LIV-1 muestra los cambios de la EMT-como en la expresión génica, morfología celular y el comportamiento. A, los cuatro LIV-1 que sobreexpresan ARCAP
clones E mostraron cambios expressional EMT-como tal como se detecta mediante inmunotransferencia de tipo Western, mientras que los dos clones de control de vector (1 y 2) retenidos un perfil de expresión de células como epitelial. B, la morfología celular de los LIV-1 en las células que sobreexpresan mostró cambios marcados de los clones de control (200 ×). C, LIV-1 células que sobreexpresan (LIV nº 8 y LIV ° 14 fueron comparados con los clones de control de vectores 1 y 2 y los padres ARCAP
E y
células ARCAP M para la capacidad migratoria alterada en transwell ensayos. Cada resultado es la media ± desviación estándar de un ensayo por triplicado. D, la LIV-1 sobreexpresión#8 y#14 clones fueron comparados con los clones de control de vectores 1 y 2 y los padres ARCAP
e y ARCAP
células M para invasividad alterada. * indica la significación estadística en comparación con el clon de control con1 (
P Hotel & lt; 0,05).
los efectos de la LIV-1 en los cambios de comportamiento fueron evaluados por su promoción de la migración celular y la invasión en ensayos de cámara de Boyden. Si bien el control neo transfectadas ARCAP
clones e mostró capacidades de migración e invasión similares estrechamente imitan las de los padres ARCAP
células e, ensayos repetidos revelaron que LIV-1 sobreexpresión confiere aumentado significativamente la capacidad migratoria (Figura 3C) y el potencial invasivo para penetrar en matrices extracelulares (Figura 3D). Tomados en conjunto, estos datos apoyan la noción de que el aumento de los niveles de LIV-1 promueven la motilidad y comportamientos invasivos de células de cáncer de próstata.
LIV-1 promovido la formación de la sobreexpresión del tumor de próstata y metástasis a distancia
in vivo
Hemos examinado el papel de la LIV-1 se expresa en forma estable ARCAP
células e en la modulación de comportamientos tumorigénicas y metastásicas posteriores en ratones. Se comparó el crecimiento metastásico local y distante de ARCAP
E tumores de protocolos de inoculación de células tumorales subcutáneos y intracardiaca como se describe anteriormente [21], [23].
Después de la implantación subcutánea, LIV-1 clones que sobreexpresan indujo una