Extracto
Antecedentes
La lipoproteína de baja densidad de receptores relacionados con la proteína-1 (LRP-1) es un receptor de endocítica mediar la liquidación de varias moléculas extracelulares implicadas en la difusión del cáncer Células. LRP-1 así apareció como un receptor de atractivo para la orientación del comportamiento invasivo de las células malignas. Sin embargo, los resultados recientes sugieren que LRP-1 puede facilitar el desarrollo y el crecimiento de las metástasis del cáncer in vivo, pero aún no se ha dilucidado la contribución precisa del receptor durante la progresión del cáncer. La falta de conocimientos sobre mecánica en el intracelular redes de aguas abajo de la LRP-1 de señalización ha impedido la comprensión de su contribución hacia el cáncer.
Metodología /Principales conclusiones
A través de un corto horquilla de ARN mediada por silenciamiento enfoque, hemos identificado LRP-1 como un regulador principal de ERK y JNK de señalización en un contexto de células tumorales. Co-immunoprecipitation experimentos revelaron que la PRL-1 constituye un sitio de acoplamiento intracelular para los complejos que contienen MAPK. Mediante el uso de agentes farmacológicos, constitutivamente activos y quinasas dominante-negativo, hemos demostrado que LRP-1 mantiene células malignas en un estado adhesivo que es favorable para la invasión mediante la activación de ERK y la inhibición de JNK. Además, demostró que la regulación LRP-1 dependiente de la señalización de MAPK organiza la arquitectura del citoesqueleto y media la rotación compleja adhesiva en las células cancerosas. Por otra parte, se encontró que LRP-1 está atado a la red de actina y a los sitios de adhesión focal y controla ERK y JNK orientación a estructuras Talin-rico.
Conclusiones
Se identificaron ERK y JNK como los principales elementos de conexión moleculares por los cuales LRP-1 regula el desmontaje de adhesión focal de las células malignas para apoyar la invasión
Visto:. Langlois B, G Perrot, Schneider C, P Henriet, Emonard H, Martiny L, et al. (2010) LRP-1 promueve la invasión de células cancerosas gracias al soporte de ERK y JNK inhibición de vías de señalización. PLoS ONE 5 (7): e11584. doi: 10.1371 /journal.pone.0011584
Editor: Bill Hooker, Calypte Biomedical Corporation, Estados Unidos de América
Recibido: April 2, 2010; Aceptado: 20 Junio 2010; Publicado: 14 Julio 2010
Derechos de Autor © 2010 Langlois et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), La Ligue Nationale Contre le Cancer (Comité de la Marne), CPER (Contrat de Projets Etat-Región) 2007-2013 y Fondo Nacional pour la Santé ACI (Acción Concertée incitative) 2008 (Proyecto Cancéropôle Grand-Est). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la lipoproteína de baja densidad (LDL) relacionada con el receptor-proteína-1 (LRP-1) es un receptor de endocítica de expresión ubicua perteneciente a la familia del receptor de LDL [1]. En primer lugar se describe como un receptor de carga de mediación de la captación y degradación lisosomal de α2-macroglobulina [2], se encontró entonces LRP-1 a participar en la internalización de los más de 30 ligandos extracelulares funcional y estructuralmente no relacionados. Estos incluyen proteasas, complejos de inhibidor de la proteasa, las proteínas macromoleculares y factores de crecimiento. Inicialmente sintetizada como un precursor de 600 kDa, LRP-1 se procesa adicionalmente en el trans-Golgi por un furina-convertasa para la expresión en la superficie celular en forma de dos cadenas madura compuesta de un 515 kDa subunidad extracelular (cadena α), no covalentemente ligado a un 85 kDa β-cadena que contiene el dominio transmembrana y la cola citoplásmica. Los LRP-1-cadena α puertos cuatro grupos de unión a ligandos implicados en el reconocimiento específico de ligandos extracelulares y el montaje de complejos multiproteicos en la superficie celular. El dominio intracelular de la β-cadena de LRP-1 podría reclutar moléculas implicadas en la maquinaria endocítica y moduladores de vías de señalización citoplasmáticas [3].
La diversidad de sus ligandos puede explicar por qué LRP-1 ha sido identificado como un factor crítico en diversos contextos patológicos incluyendo la aterosclerosis y los trastornos neurodegenerativos como el descrito con más frecuencia [4], [5]. Un creciente número de evidencias fortaleció el papel putativo de LRP-1 en los acontecimientos cruciales durante la progresión del cáncer [6]. LRP-1 era de hecho informó de mediar el aclaramiento de varias metaloproteinasas de la matriz tales como MMP-2, MMP-9 y MMP-13 [7], [8], [9] y para regular la cascada de activación de plasmina a través de la endocitosis de tejido- tipo (tPA) o activadores de plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA) [10], [11]. Teniendo en cuenta su función bien conocida en el control de la matriz de proteólisis [12], LRP-1 fue propuesto inicialmente como una novela supresor de tumor. El nivel de expresión débil de LRP-1 observada en células de cáncer humano de alto grado y tejidos parecía apoyar esta hipótesis [13], [14]. Sin embargo, la función general de LRP-1 en la carcinogénesis parece ser mucho más complejo de lo que se pensaba. Estudios recientes han informado de una contribución positiva de LRP-1 a los eventos de migración e invasión de diferentes tipos de células [10], [15], [16], incluyendo células de tumores malignos [17], [18], [19], [20 ]. LRP-1 de expresión también se informó a ser sensible a la hipoxia y para apoyar la diseminación metastásica de xenoinjertos tumorales de ratón [21]. Además, se demostró LRP-1 para sostener la mitogénica y /o efectos promigratory de varios factores solubles presentes en el medio ambiente peritumoral, apoyando así un papel pro-tumorigénesis del receptor [15], [22], [23]. Recientemente hemos demostrado que LRP-1 contribuye a la invasión de células de carcinoma mediante el control de volumen de negocios sutilmente compleja adhesiva [17]. Por tanto, parece que los mecanismos por los que la progresión de la LRP-1 controla tumor no están exclusivamente relacionados con su función endocítica.
Más allá de la endocitosis, LRP-1 se distingue por su capacidad de desencadenar vías de señalización intracelular regulación de la proliferación celular, la diferenciación , la migración o la supervivencia [15], [24], [25], [26]. Su dominio intracitoplasmática corto (ICD) contiene dos motivos NPxY para la fosforilación por tirosina quinasas que entonces son capaces de unirse dominio de unión a fosfotirosina (PTB) que contienen proteínas. La levadura de dos híbridos de ensayos y la proteómica análisis reveló que Shc (homología Src 2 dominio que contiene la proteína), Fe65, Dab1 (desactivado 1), PI3K (fosfatidilinositol 3-quinasa) o un PIP-4,5-quinasa (fosfatidil-inositol -4,5-quinasa) homólogo puede asociar a la LRP-1-ICD [27], [28]. Por lo tanto, en respuesta a estímulos extracelulares, LRP-1 puede reclutar proteínas de andamiaje intracelulares para activar la señalización aguas abajo. LRP-1 ha sido identificado como un socio de señalización molecular para el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), que conduce a la señalización y el desarrollo de las lesiones ateroscleróticas migratoria y proliferativa [4], [29]. Más recientemente, el efecto promigratory del inhibidor del activador del plasminógeno de PAI-1 parecía requerir la activación LRP-1 dependiente de la JAK (janus quinasa) STAT (transductor de señal y activador de la transcripción) /vía de señalización [30]. Por otra parte, Ma y sus colegas informaron que la PRL-1 murino podría regular la migración de fibroblastos de embriones mediante la supresión de la quinasa regulada por señales (ERK) vías extracelulares [31] y Rac1.
En el campo del cáncer, existe una notable falta de conocimientos acerca de la señalización intracelular corriente abajo de LRP-1 y la comprensión de su posible contribución a la progresión del cáncer. En el presente estudio, se caracterizaron los relés de señalización moleculares implicados en la estimulación mediada por LRP-1 de la invasión de las células cancerosas e identificamos la β-cadena de LRP-1 como un sitio de acoplamiento principal (FA) los componentes de adhesión focal y proteína activada por mitógenos quinasa (MAPK) que contienen complejos.
Resultados
identificación de LRP-1 como un regulador de la MAPK vías de señalización en el contexto de las células tumorales
Para evaluar el papel de LRP- 1 en la regulación de la transducción de señales intracelulares, se utilizó un método validado previamente para generar shLRP-1 en las células clonales que sobreexpresan establemente una horquilla secuencia específica dirigida contra LRP-1 [17]. Como se muestra en la Fig. 1, se observó un ~ 90% baja regulación endógena de LRP-1 en las células shLRP-1 en comparación con las células shCTRL, tanto a ARNm (Fig. 1A) y los niveles de proteína (fig. 1B). Por lo tanto, se analizaron los efectos de silenciamiento del LRP1 en la activación de varias vías potenciales de señalización reguladas por la LRP-1. Los estados de activación de dos importantes vías de MAPK, es decir, ERK-1/2 y SAPK /JNK (estrés-proteína quinasa activada /c-jun N-terminal quinasa), se examinaron primero (Fig. 1C). Se encontró que el nivel de ERK-1 fosforilado /2 fue selectivamente disminuyó en las células LRP1-silenciado y no se detectó un aumento de la fosforilación de JNK-1/2/3 sobre LRP-1 silenciamiento. Sin embargo, los niveles de fosforilación de Akt y p38 MAPK no cambiaron significativamente en los carcinomas de LRP-1-deficientes. Estos resultados demuestran que LRP-1 puede actuar como un modulador de la señalización intracelular, la activación de ERK y la inhibición de JNK vías de señalización.
(A) Total de ARN se purificaron a partir de la línea FTC133 control celular clonal (shCTRL) o células clonales que de forma estable sobreexpresar shRNAs para LRP-1 (shLRP-1). El nivel transcripcional de LRP-1 se evaluó mediante RT-PCR. cebadores ß-actina se utilizaron como un control de normalización. (B) los extractos de células enteras de cada línea celular se sometieron a análisis de inmunoblot con anticuerpos anti-LRP-1 anticuerpo β-cadena (5A6). anticuerpo ß-actina se utilizó para la normalización. (C) shCTRL y shLRP-1 en las células clonales se cultivaron durante 24 horas en superficies recubiertas con gelatina en 10% medio que contenía FBS. extractos de células enteras fueron a inmunotransferencia utilizando fosfo-ERK, JNK-fosfato, fosfo-Akt y anticuerpos fosfo-p38. Los anticuerpos contra ERK, JNK, p38 y β-actina se utilizaron para garantizar la igualdad de carga y para la normalización. El gel e inmunotransferencias presentado son representativos de al menos tres experimentos separados. Números bajo el gel y immunolots indican las inducciones de plegado por comparaison con células shCTRL.
LRP-1 media la activación inducida por suero de ERK-1/2 y la inhibición constitutiva de JNK-1/2 /3
la regulación mediada por LRP-1 de señalización intracelular puede bien depender de la unión de ligandos extracelulares o en el reclutamiento de los andamios intracelulares. Se evaluó la regulación mediada por LRP-1 tanto de ERK (Fig. 2A a 2D) y las vías de JNK (Fig. 2E a 2H) en respuesta a la estimulación con suero y recubrimiento de gelatina. La activación mediada por LRP-1 de ERK-1/2 fosforilación se observó sólo en la presencia de suero (Fig. 2A y 2B vs 2C y 2D). Por el contrario, la activación de JNK-1/2/3 en células silenciadas-LRP-1 no estaba condicionada por la presencia de suero (Fig. 2E a 2H). En ambos casos, la regulación de la MAPK por LRP-1 no fue afectado por recubrimiento de gelatina (Fig. 2A, 2C, 2E y 2G). Por consiguiente, el receptor LRP-1 desencadena la activación extracelular-dependiente de ligando de ERK-1/2 y actúa como un inhibidor de la constitutiva de la vía de JNK.
shCTRL y células shLRP-1 se sembraron en placas de plástico o gelatin- recubierto platos durante 24 horas en ausencia o en presencia de FBS. extractos de células enteras se sometieron a análisis Western-blot para estudiar la activación de ERK (A-D) y JNK (E-H) en ausencia o en presencia de FBS. Las tasas de activación de ERK respectivos (B, D) y JNK (F, H) se determinaron como relaciones de intensidad de fosfo-proteínas correspondientes a pan-proteína y se expresan en unidades relativas +/- SD, con un valor de 1 atribuye a shCTRL Células. NS: no significativo; *,
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LRP-1 constituye un sitio de acoplamiento para Src, ERK y JNK complejos que contienen
La LRP-1 C-terminal final puede interactuar con las moléculas de andamiaje que participan en la transducción de señales [28]. Se llevaron a cabo experimentos para probar si coimmunoprecipitation el dominio intracelular de LRP-1 es capaz de reclutar dianas implicadas en la regulación de las vías de señalización de ERK y JNK en un contexto de células tumorales. Como se muestra en la Fig. 3, hemos sido capaces de éxito inmunoprecipitado LRP-1 β-cadena con un anticuerpo generado contra el extracelular LRP-1 α-cadena. Ambas quinasas ERK y JNK fueron co-inmunoprecipitaron con LRP-1 β-cadena. También examinamos el estado de fosforilación de estas quinasas. Se encontraron formas fosforiladas de ERK-1/2 asociado con LRP-1, donde JNK fosforilada no lo eran. . Src, una quinasa conocida para ser activado aguas abajo de los receptores de mitógenos y de la matriz, también se detectó en los complejos de β-cadena que contiene 1-LRP
inmunoprecipitaciones de LRP-1 que contienen los complejos (IP: LRP-1 -α) se realizaron mediante el uso de anti-LRP-1 α-cadena (8G1) anticuerpos y se inmunotransfirieron los inmunocomplejos (IB) mediante el uso de 8G1, anti-LRP-1 β-cadena (5A6), anti-ERK-1/2 , anti-fosfo-ERK-1/2, los anticuerpos anti-fosfo-JNK-1/2/3 y anti-Src anti-JNK-1/2/3,. IgG no específicas se utilizaron como control negativo de inmunoprecipitación.
activación de ERK LRP-1-dependiente contribuye a la invasión de células de carcinoma
Recientemente hemos descrito un papel clave para la PRL-1 en el tumor progresión [17]. De hecho, como se muestra en la Fig. 4A, las células LRP-1-deficientes mostraron una dos veces disminución de la capacidad invasiva, en comparación con las células control clonales. Por ello, investigó si la activación LRP-1 dependiente de ERK podría contribuir a la invasión de células de carcinoma. En primer lugar, las células de control se trataron con U0126, un inhibidor selectivo de MEK-1/2 (MAPK ERK quinasa-1/2) o transfectadas con un mutante dominante negativo de MEK-1. La eficiencia de ERK-1/2 inhibición en estas condiciones se puede ver en la Fig. 4B. No se detectó ningún cambio en la fosforilación de JNK a la inhibición de ERK (Fig. S1). la invasión de células de control fue inhibida por tratamiento U0126 de una manera dependiente de la dosis (Fig. 4C y 4D). Por otra parte, las células que sobreexpresan una forma shCTRL muertos-quinasa de MEK-1 presentaron menor propiedades invasivas (Fig. 4C y 4D). Estos resultados indican que el módulo de señalización de ERK se activa durante la invasión de células de carcinoma. En segundo lugar, para rescatar a la vía ERK activada en las células silenciadas-LRP-1, se sobreexpresa un ERK-2-constitutivamente activa. El estado de activación de ERK-1/2 se evaluó mediante inmunotransferencia (Fig. 4E). Como se muestra en la Fig. 4F y 4G, la capacidad de las células LRP-1-deficientes para invadir fue restaurada parcialmente cuando se sobreexpresa ERK-2. Dado que la Src de tirosina-quinasa podría potencialmente activar ERK señalización corriente abajo de LRP-1 (Fig. 3), la invasión de células se cuantificó en presencia de un inhibidor de quinasa Src. Sin embargo, la inhibición de Src no afectó a la capacidad invasiva de células tanto shCTRL y shLRP-1 (Fig. 4H), excluyendo de este modo la contribución de quinasa Src para la activación de ERK mediada por LRP-1 durante la invasión de células de carcinoma.
Matrigel Invasion ensayo se llevó a cabo para las células de carcinoma de shCTRL y shLRP-1 en condiciones basales (a), después de la modulación de la actividad de ERK en shCTRL (B-D) y shLRP-1 células (e-G) o en presencia de inhibidor de Src ( MARIDO). (C, D) La capacidad de las células para invadir shCTRL matrigel se cuantificó después de la inhibición de la actividad de ERK mediante el uso de tratamiento U0126 (10 o 25 mM) o la expresión de un mutante quinasa-muertos para MEK-1 (dn-MEK). (F, G) Las propiedades invasivas de las células shLRP-1 se examinaron después de una activación constitutiva de ERK-2 (ca-ERK). La eficacia de la inhibición de ERK en shCTRL (B) y la activación de ERK en las células shLRP-1 (E) se controló mediante el uso de fosfo-ERK, ERK y anticuerpos beta-actina. Anti-HA se utilizó para controlar el nivel de expresión de sobreexpresa proteínas etiquetadas-HA. (H) la invasión de células del tumor se midió después de la inhibición de la actividad de Src dependiente mediante el uso de 10 mM de Src inhibidor de quinasa I (Src inh). Se muestran imágenes representativas para cada condición (D, G). Los resultados se obtuvieron a partir de tres experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado. Invasion se determinó contando las células en ocho campos microscópicos al azar por pocillo. Los resultados se expresaron como medias +/- SD después de la normalización por comparación con vehículo, es decir, DMSO para los tratamientos con fármacos o lipofectamina (lipo) para la transfección. NS, diferencias con el control correspondiente no fueron significativas. *,
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La inhibición de JNK mediada por LRP-1 sostiene celular invasión maligna
Del mismo modo, se analizó en qué medida LRP- la inhibición de la vía de JNK podría apoyar la invasión de células de carcinoma de 1 mediada. JNK1 y MKK-7 (MAPK quinasa-7) fueron así co-expresado en células shCTRL (Fig. 5A). La invasión de las células shCTRL se redujo en un 25% cuando se sobreexpresa de tipo salvaje JNK (Fig. 5B y 5C), lo que sugiere que se requiere la inhibición de JNK para promover la invasión. A continuación, se utilizó el inhibidor de JNK SP600125 selectiva y un mutante dominante negativo de JNK para recuperar la inhibición de JNK en carcinomas LRP-1-deficientes (Fig. 5D). No se observó ninguna modulación significativa de la fosforilación de ERK en estas condiciones (Fig. S1). células Curiosamente, la escasa capacidad de LRP-1-silenciado invadan se incrementó de manera significativa en la inhibición de JNK (Fig. 5E y 5F). Estos resultados apoyan el concepto de que la inhibición de la vía de JNK de señalización mediada por LRP-1 contribuye a la invasión de células de carcinoma.
ensayos de invasión de la célula se llevaron a cabo con shCTRL (B, C) y las células 1 shLRP-( E, F) después de la modulación de la actividad de JNK (A, D). células ShCTRL (B, C) fueron transfectadas por vector para la expresión de codificación de tipo salvaje MKK-7 /JNK-1 antes de la invasión de células se cuantificó. (E, F) Las propiedades invasivas de las células silenciadas-LRP-1 se midió después del tratamiento SP600125 (5 o 10 mM) o transfección por un mutante dominante negativo de JNK-1 (dn-JNK). la activación de JNK en shCTRL (A) y la inhibición de JNK en células shLRP-1 (D) se evaluó mediante el uso de fosfo-JNK, JNK y anticuerpos beta-actina. Anti-HA y anti-FLAG se utilizaron para controlar la expresión de proteínas etiquetadas sobreexpresados. Se muestran imágenes representativas para cada condición (C, F). Los resultados se obtuvieron a partir de tres experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado. Invasion se determinó contando las células en ocho campos microscópicos al azar por pocillo. Los resultados se expresaron como medias +/- SD después de la normalización por comparación con vehículo, es decir, DMSO para los tratamientos con fármacos o lipofectamina (lipo) para transfecciones. *,
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La regulación mediada por LRP-1 de MAPK controla la unión de las células de carcinoma de
Nos informaron recientemente que LRP-1 silenciando gravemente afectada la invasión de las células malignas en forma consecutiva a una fuerte alteración de la interacción célula-matriz de rotación de personal. Por lo tanto, postulamos que el control de LRP-1 dependiente de ambas vías ERK y JNK contribuye a modular la interacción célula-matriz para apoyar la invasividad. Como era de esperar, las células shLRP-1, en el que se reduce la actividad de ERK, se muestra un ritmo acelerado de unión a las superficies recubiertas de gelatina, en comparación con las células control clonales (Fig. 6A). Por otra parte, la sobreexpresión de una quinasa-inactiva MEK-1 mutante en células shCTRL llevado a una mayor tasa de adhesión (Fig. 6B), mientras que ERK-2 constitutivamente activa disminuyó la capacidad de LRP-1-deficientes células se unieran (Fig. 6C). De hecho, después de 60 min de unión, las células adherentes se aumentó 2 veces la inhibición vía ERK (Fig. 6B). Al mismo tiempo de embargo, el porcentaje de células adherentes silenciados-LRP-1 se redujo de 2 veces en virtud de la activación de ERK (Fig. 6B y 6C). Del mismo modo, la sobreexpresión de tipo salvaje MKK-7 /JNK-1 en células de control dio lugar a una adhesión mejorada 2 veces después de 60 min (Fig. 7A). Además, el aumento de la tasa de fijación observada en las células LRP-1-deficientes se invirtió mediante la expresión de una forma dominante negativa de JNK-1 (Fig. 7B). Estos datos apoyan el concepto de que LRP-1 mantiene las células malignas en un estado intermedio adhesivo que sea favorable para la invasión a través de la activación de ERK y JNK inhibición.
(A) shCTRL (cajas blancas) y shLRP-1 (cajas grises ) las células se sembraron en placas revestidas de gelatina y se desecharon las células no adherentes después de 30, 60 o 90 min. Ensayos de adherencia también se realizaron con células que sobreexpresan shCTRL un mutante quinasa-muertos para MEK-1 (dn-MEK) (B) y shLRP-1 que sobreexpresan un constitutivamente activa ERK-2 (ca-ERK) (C). Para cada condición, los resultados se expresan como porcentajes de células adherentes de control correspondientes a los 90 minutos. Cada valor es la media +/- SD de cuatro experimentos independientes, con cada uno realizado por triplicado. *,
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shCTRL (cajas blancas) y se sembraron las células shLRP-1 (cajas grises) en placas recubiertas de gelatina y las células no adherentes fueron descartados después de 30, 60 o 90 min. ensayos de adhesión se realizaron con células que sobreexpresan shCTRL tipo salvaje MKK-7 /JNK1 (A) y shLRP-1 que sobreexpresan un mutante dominante negativo de (B) quinasas JNK-1 (dn-JNK). Para cada condición, los resultados se expresan como porcentajes de células adherentes de control correspondientes a los 90 minutos. Cada valor es la media +/- SD de cuatro experimentos independientes, con cada uno realizado por triplicado. *,
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La red de actina de los carcinomas invasores-rápidas es rescatado en las células silenciadas-LRP-1 siguientes reactivación de ERK o la inhibición de JNK hiperactivado
además, investigó si el reglamento LRP-1 dependiente de la señalización de MAPK podría orquestar la coordinación de la dinámica de la actina y la adhesión durante la invasión de células malignas. por lo tanto, se analizó la distribución celular de actina fibrilar después de la modulación de las actividades de ERK y JNK (Fig. 8). control de las células adherentes muestran una morfología polarizada con extensiones celulares filopodial y una red de actina cortical principalmente distribuida (Fig. 8A). En agudo contraste, LRP-1-silenciar morfología overspread inducida con fibras numerosos estrés, filamentos transversales prominentes y una red de actina ramificado desarrollado (Fig. 8F). La inhibición de la señalización de ERK en células de cáncer de control por tratamiento U0126 (Fig. 8B vs 8A) o una forma dominante negativa de MEK-1 (Fig. 8D vs 8C) inducida por cambios morfológicos drásticos similares a los obtenidos en LRP-1 silenciamiento. El mismo resultado se observó después de la expresión de tipo salvaje MKK-7 /JNK-1 en células de carcinoma de control (Fig. 8E vs 8C). En las células, la inhibición de la señalización de JNK por SP600125 (Fig. 8G vs 8F) o la sobreexpresión de quinasa inactiva JNK-1 LRP-1-silenciado (Fig. 8J vs 8H) restauró la morfología mesenquimales-como de células de carcinoma de tipo salvaje. Por otra parte, constitutivamente activa ERK-2 (Fig. 8I vs 8H) era suficiente para revertir la morfología overspread causada por el silenciamiento de LRP-1. Estos resultados demostraron que LRP-1 silenciamiento induce grandes reordenamientos del citoesqueleto de actina directamente relacionados con la inhibición de ERK y JNK hiperactivación.
Células (A-E) y shLRP-1 (F-J)
shCTRL fueron sembradas en recubiertos de gelatina placas de 120 min. se modulan las actividades de ERK o JNK. Las células de control se trataron por 25 U0126 mu M (B) o transfectadas por un mutante quinasa-muertos para MEK-1 (dn-MEK) (D) para inhibir la vía de JNK y activación de ERK-dependiente se obtuvo por la sobreexpresión de tanto de tipo salvaje MKK-7 y JNK-1 (e). Para las células de LRP-1-deficiente, la inhibición de la vía de JNK se logró mediante el uso de tratamiento SP600125 (10 M) (G) o la sobreexpresión de una forma dominante negativa de JNK-1 (J), mientras que la reactivación de la vía de ERK se obtuvo usando un vector de expresión para constitutivamente activa ERK-2 (I). DMSO (A, F) sirvió como control para los tratamientos con fármacos (B, G) y lipofectamina (C, H) sirvió como control para los ensayos de transfección (D, E, I, J). Las células fueron teñidas con los filamentos de actina (rojo) y los núcleos se counterstained con DAPI (azul). Las imágenes son representativas de al menos tres series distintas de las culturas. Bares, 20 micras.
activación LRP-1 dependiente de la inhibición de ERK y JNK es de FA necesario para el desmontaje de los carcinomas invasores-rápidas
Teniendo en cuenta el impacto de la LRP-1 silenciamiento sobre las propiedades adhesivas y morfológicas de las células de carcinoma (. las figuras 6, 7 y 8), se investigó si es necesario el control mediada por LRP-1 de MAPK para la AF volumen de negocio. Por lo tanto, la distribución celular de los complejos de coordinación se analizó en shCTRL y shLRP-1 en las células después de la activación diferencial de las ERK y JNK vías (Fig. 9A a 9J). LRP-1-silenciamiento condujo a la acumulación de numerosas y altamente estructurados complejos de coordinación en la periferia de la célula (Fig. 9F vs 9A). La interferencia con la activación de ERK en las células control con U0126 (Fig. 9B vs 9A) o una forma quinasa inactiva de MEK-1 (Fig. 9D vs 9C) aumentó el número y tamaño de los contactos focales que contiene Talin-en la misma medida como se observa en las células (Fig. 9F) LRP-1-silenciada. De acuerdo con ello, la sobreexpresión de tipo salvaje MKK-7 /JNK-1 en células de control que expresan LRP-1 estimula la acumulación de estructuras de adhesión periféricos que contiene Talin-(Fig. 9E vs 9C). Por el contrario, el número de estructuras Talin ricos se redujo drásticamente en las células LRP-1-silenciado mediante el uso de un inhibidor selectivo de JNK (Fig. 9G vs 9F) o expresión de un JNK-1 mutante dominante negativo (Fig. 9J vs 9H ). Se obtuvieron resultados similares cuando un ERK-2-constitutivamente activa se expresó en células LRP-1-deficientes (Fig. 9I vs 9H). Estos datos demostraron que la activación de JNK o la inhibición de ERK en células LRP-1-deficientes podría restaurar la distribución inicial de los complejos de adhesión. El porcentaje de células positivas para FA se cuantificó posteriormente, como ya se ha descrito [17]. Como se muestra en la Fig. 9K y 9L, el número de células de cáncer de LRP-1 que expresan positivos para los complejos de adhesión Talin rico se incrementó en alrededor de 1,4 veces en virtud de la inhibición de ERK (U0126 y dn-MEK) y por 1,7 veces bajo la activación de JNK (MKK-7 /JNK-1). Por el contrario, el aumento del número de contactos focales causada por el silenciamiento LRP-1 se invirtió parcialmente por la activación de ERK (ca-ERK) o la inhibición de JNK (SP600125 y dn-JNK). En consecuencia, LRP-1 aparece como un mediador principal de la interrupción de adhesión a través de la regulación de las vías de señalización de ERK y JNK.
shLRP-1 células (A-J) shCTRL (A-E) y (F-J) fueron sembradas en placas recubiertas de gelatina durante 120 minutos. vía de señalización de ERK fue inhibida en células shCTRL mediante el uso de 25 U0126 mu M (B) o una quinasa-muerto MEK-1 mutante (dn-MEK) (D) y reactivada en células shLRP-1 por una activación constitutiva de ERK-2 (ca -ERK) (I). El vector de MKK-7 /JNK1 se utiliza para desencadenar la activación de JNK en células shCTRL (E) mientras que la inhibición de JNK en células de LRP-1-deficientes se obtuvo mediante el uso de un SP600125 10 M (G) o un dead-quinasa para JNK-1 ( dn-JNK) (J). DMSO (A, F) sirvió como control para los tratamientos con fármacos (B, G) y lipofectamina (C, H) sirvió como control para transfecciones (D, E, I, J). Las células fueron teñidas para Talin (verde) y los núcleos se contratiñeron con DAPI (azul). Las imágenes son representativas de al menos tres series distintas de las culturas. Bares, 20 m. (K, L). El porcentaje de células positivas para las adhesiones focales se cuantificó después de la modulación de las actividades de ERK y JNK mediante el uso de tratamientos selectivos de drogas (K) o el constructo de MAPK indicada (L). Para cada condición, se evaluaron tres cientos de células a partir de tres experimentos separados. Los resultados se expresaron en porcentaje, en comparación con las células tratadas por shCTRL DMSO (K) o lipofectamina (L). *,
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LRP-1 está vinculado a los componentes del citoesqueleto y FA y controla el reclutamiento de MAPK activa de la céntrica complejos
Para aclarar el mecanismo molecular por el que LRP-1 controla la FA dinámica y citoesqueleto organización a través de la regulación MAPK, ensayos de inmunoprecipitación se llevaron a cabo (Fig. 10). Los datos presentados en la figura 10A revelaron que α-actinina, talina y paxillin interactuar con el LRP-1 β-cadena en células de carcinoma-invasoras rápido. Curiosamente, también se detectó una asociación entre LRP-1 y fosfo-SHP-2 (que contiene el dominio de la proteína tirosina fosfatasa-2 SH2), PP2A (serina /treonina proteína fosfatasa 2A), y PAK (p-21 quinasa activada) activo que son reguladores clave de la señalización de MAPK. Otros relés moleculares como Ras y MEK también se encuentran asociados a la LRP-1-ICD (Fig. S2). La composición de los complejos que contienen Talin-a continuación, se analizó en las células silenciadas-LRP-1 en comparación con el control de las células tumorales (Fig. 10B). Como se esperaba, se observó una mayor cantidad de Talin en células LRP-1-deficiente. Por otra parte, la cantidad de paxillin en complejos que contienen Talin-fue alterado específicamente en LRP-1 silenciamiento mientras que la α-actinina no lo era. Curiosamente, las formas activas de ERK se detectaron principalmente en complejos que contienen Talin, de células del LRP-1 que expresan. Asimismo, se observó una fuerte acumulación de fosfo-JNK en estos complejos bajo LRP-1 silenciamiento.
shCTRL y células shLRP-1 se sembraron en superficies revestidas de gelatina y extractos de células enteras fueron utilizados para llevar a cabo experimentos de inmunoprecipitación (IP). (A) La inmunoprecipitación de LRP-1-que contienen complejos se llevó a cabo mediante el uso de los anticuerpos anti-LRP-1 monoclonales (8G1). Los inmunocomplejos fueron entonces a inmunotransferencia (IB) mediante el uso de anticuerpos específicos para LRP-1-cadena β, α-actinina, talina, paxilina, fosfo-SHP-2, PP2A y PAK. (B) que contienen complejos de Talin-se inmunoprecipitaron y se analizaron por Western-blot usando anti-Talin, anti-fosfo-ERK, anti-fosfo-JNK, anti-α-actinina y anticuerpos anti-paxillin. IgG no específicas se utilizaron como control negativo de ensayos de inmunoprecipitación.
Discusión
Teniendo en cuenta la falta de conocimiento molecular de aproximadamente LRP-1 en el campo del cáncer, se determinó la red de señalización intracelular que conecta LRP-1 para el comportamiento agresivo de las células tumorales. Nuestros resultados pusieron de relieve que LRP-1 mantiene células malignas en un estado adhesivo favorable para la invasión mediante el control de ERK y JNK dependiente de vías.
primera demostrado que LRP-1 expresión en células de carcinoma desencadena la activación mediada por suero de ERK y es responsable de la inhibición constitutiva de la JNK. De acuerdo con nuestros resultados, los estudios anteriores han informado de una disminución de la fosforilación de ERK-1/2 en células no tumorales LRP-1-deficientes [15], [32]. Por otra parte, Ma y colaboradores informaron de que LRP-1 podría reprimir la activación de ERK para controlar la movilidad celular [31]. En las células de fibrosarcoma HT1080, Webb y sus colegas demostraron que la deficiencia de LRP-1 condujo a un aumento de nivel de ERK fosforilada que estimula la migración celular y la invasión [33]. En estos estudios, la activación de ERK en las células LRP-1-deficientes requiere la expresión de uPAR, el receptor de uPA, que se une la vitronectina. Estos resultados parecían ser altamente dependiente de la vitronectina ya que la interacción uPAR-vitronectina es bien conocido que sea suficiente para iniciar los cambios posteriores en la migración celular y la transducción de señales [34]. La capacidad de LRP-1 para mediar en la captación endocítica de uPAR y disminuye la cantidad de superficie celular de UPA: complejo uPAR fue evocado con frecuencia para explicar el control de la activación de ERK por LRP-1 [31], [33], [35 ]. Sin embargo, mediada por shRNA knock-down de LRP-1 no afecta al nivel de la superficie celular de uPAR en nuestro modelo [17]. Aunque la activación de ERK se informó en respuesta a la unión del ligando a LRP-1 [15], [19], [32], [36], una clara visión general de los mecanismos subyacentes todavía falta.