Extracto
Antecedentes
ID2 es un miembro de una subclase de reguladores de la transcripción que pertenece a lo general bHLH (-hélice-bucle-hélice) la familia de factores de transcripción. En las células normales, ID2 es responsable de la regulación del equilibrio entre la proliferación y la diferenciación. Estudios más recientes han demostrado que ID2 está implicado en la progresión tumoral en varios tipos de cáncer como el de próstata o de mama.
Metodología /Principales conclusiones
En este trabajo, se investigó, por primera vez, la relación entre la expresión de ID 2 en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y las características clínico y el pronóstico de estos pacientes. La inmunohistoquímica se realizó en microarrays de tejidos, que incluyeron 62 tumores de NSCLC. En los tejidos malignos, la expresión ID2 se ha detectado tanto en los compartimientos nucleares y citoplásmicos, pero hemos demostrado que sólo la expresión nuclear de ID2 se correlaciona inversamente con el grado de diferenciación del tumor (p = 0,007). Curiosamente, entre los pacientes con tumores poco diferenciados, de alta expresión nuclear de ID2 fue un factor pronóstico independiente y desfavorables para la supervivencia (p = 0,036).
Conclusiones
Estos resultados sugieren que podrían estar involucrados ID2 en el tumor procesos de desdiferenciación de CPNM, y podría ser utilizado como marcador pronóstico de los pacientes con tumores poco diferenciados
Visto:. Rollin J, Bléchet C, Regina S, Tenenhaus a, S Guyétant, Gidrol X (2009) La la localización intracelular de ID2 expresión tiene un valor predictivo en células no pequeñas cáncer de pulmón. PLoS ONE 4 (1): E4158. doi: 10.1371 /journal.pone.0004158
Editor: Axel Imhof, Universidad de Munich y el Centro de Ciencias de la proteína integrada, Alemania |
Recibido: 8 de Julio, 2008; Aceptado: 4 de diciembre de 2008; Publicado: 8 Enero 2009
Derechos de Autor © 2009 Rollin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
ID2 (inhibidor de la unión al ADN 2) pertenece a una subclase de proteínas, la familia ID, que se encuentra dentro de la gran bHLH (hélice básica-loop-helix) grupo de factores de transcripción. Curiosamente, ya que no poseen el dominio básico, proteínas de identificación no se unen directamente al ADN y, en cambio, actúan como antagonistas como dominante negativo de la clase A bHLH factores de transcripción. Entre los objetivos conocidos de proteínas de identificación son la proteína E y miembros de la familia Ets [1]. ID de proteínas están implicadas en el desarrollo del tejido [2], [3], y se han descrito como inhibidores de la diferenciación en numerosos tipos de células incluyendo células mieloides [4], los linfocitos B [5], y las células musculares [6]. ID2 expresión es generalmente baja en los tejidos normales, y es hasta reguladas en los tumores. Los altos niveles de expresión se han observado en tumores malignos tales como neuroblastoma [7], [8], adenocarcinoma colorrectal [9], el sarcoma de Ewing [10], cáncer de próstata [11], y cáncer de páncreas [12]. En conjunto, estos resultados sugieren que ID2 puede desempeñar un papel importante en la iniciación y progresión tumoral.
Hasta la fecha, sólo hay un único estudio de evaluación de la función de ID2 en el cáncer de pulmón, específicamente en el cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC ) [13]. El cáncer de pulmón es la principal causa de muertes por cáncer en el mundo. El tipo histológico más abundante que afecta a alrededor del 80% de los pacientes es no pequeñas de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), en comparación con el cáncer de pulmón de células pequeñas. La tasa de supervivencia global a 5 años de los pacientes con CPNM es alrededor del 15% [14]. Una vez que se ha establecido un diagnóstico, las opciones de tratamiento se basan típicamente en el escenario y la histología [15], aunque este esquema de estratificación no refleja consistentemente la biología del tumor. Como resultado, más del 50% de los pacientes con cáncer de pulmón en estadio temprano morirá eventual, mientras que otros en una etapa más avanzada sobrevivirán [14], [16], que se basa la necesidad de marcadores de pronóstico adicionales para predecir mejor los resultados de la enfermedad [17].
en el presente trabajo, hemos evaluado la expresión de ID2 por inmunohistoquímica en microarrays de tejidos de NSCLC que contienen 62 tumores. A continuación, investigaron aún más las relaciones entre la expresión ID2 y parámetros clínico, con el fin de evaluar su posible papel como marcador pronóstico de NSCLC.
Resultados
Expresión en ID2 normal de pulmón y en los tejidos de NSCLC
la inmunotinción para ID2 se realizó en un microarray tumor (TMA) que contiene 62 muestras de NSCLC de pacientes humanos. Las características clínicas e histológicas de los pacientes se describen en la Tabla 1. En el tejido pulmonar no cancerosa, débil a moderada expresión ID2 se detectó en células epiteliales bronquiales, tanto en el citoplasma y núcleos. Además, se observó tinción débil ID2 en el citoplasma de las células endoteliales (Figura 1A-D)
A-B:. ID2 tinción de células epiteliales y endoteliales en el pulmón no canceroso. C-F: la expresión Representante de TMA con una fuerte tinción ID2 en el núcleo y con moderada (C, D) o débil (E, F) tinción citoplasmática. C, D son adenocarcinomas pobremente diferenciados y E, F es un carcinoma de células grandes poco diferenciado. G-H: El tumor con ausencia de tinción nuclear con moderada (G, H) la expresión citoplasmática de ID2. G, H están moderadamente diferenciado carcinomas de células escamosas.
ID2 expresión en las células tumorales de los 62 pacientes con CPNM fue muy diversa, tanto en términos de intensidad y localización (Figura 1). De 62 pacientes con CPNM, una gran proporción (98%, 61/62) expresa la proteína ID2 casi exclusivamente en las células tumorales (mediana de puntuación de tinción mundial = 3; intervalo de 0 a 18). inmunoreactividad nuclear fue positivo en 33 (53,3%) de las muestras de NSCLC (mediana de la puntuación de tinción nuclear = 1; intervalo de 0 a 11), y citoplasmática ID2 se detectó en 57 (92%) de los 62 tumores (mediana de puntuación de tinción citoplasmática = 2; intervalo de 0 a 8). Muchos tumores mal diferenciados exhibieron una fuerte tinción ID2 en los núcleos en conjunción con una débil o moderada tinción citoplasmática (Figura 1E-J). Por el contrario, ID2 no se expresó en los núcleos de forma parcial o tumores bien diferenciados, mientras débil para una expresión moderada se observó en el citoplasma (Figura 1K-P).
Asociación de ID2 Expresión con Clinicopathological Parámetros
la mediana de la puntuación de tinción, ya sea para nuclear, citoplásmica, o expresión global de ID2, como se describió anteriormente, se utilizó como un punto de corte para clasificar a los pacientes en dos grupos: (es decir, la expresión ID2 bajo) "baja" y (es decir, la expresión alta ID2) "alta". El análisis de componentes múltiples (ACM) se llevó a cabo en los datos recogidos de los 62 pacientes y la representación gráfica se presenta en la Figura 2A. En resumen, los barrios variables en la gráfica son potencialmente asociados juntos. MCA mostró que la baja expresión nuclear de ID2 se asoció con tumores bien diferenciados y la afectación ganglionar. En contraste, la alta expresión de ID 2 en el núcleo se observa con mayor frecuencia en los tumores que fueron pobremente diferenciado y tenían la invasión local avanzado (estado de T3-T4). En asociación con MCA, se realizó un análisis DEMOD y demostró una asociación significativa entre la expresión nuclear de ID2 y la diferenciación histológica del CPCNP (Figura 2B). Nuestros resultados mostraron 15 de 17 (88%) tumores bien diferenciados mostraron bajos niveles de expresión de ID2. Además, los tumores pobremente diferenciados tenían una fuerte expresión nuclear de ID 2 (p = 0,007) en 12 de 19 (63%) casos. Sin embargo, no se encontró una relación significativa entre la expresión ID2 y compromiso de los ganglios linfáticos o el estado T, posiblemente debido a la desigual distribución de la condición de T entre los grupos (52 y 10 pacientes en T1-T2 y T3-T4, respectivamente). expresión citoplásmica de ID2 no se asoció con el grado de diferenciación de la NSCLC, pero fue sorprendentemente vinculado al tipo histológico de los tumores. la expresión tumoral de ID2 fue alta en 22 de 33 (67%) casos de adenocarcinoma en comparación con 5 de los 19 (26%) de los casos de carcinoma de células escamosas (p = 0,016) (Figura 2B).
: nuclear, citoplasmática, y la expresión global de ID2 dentro de los tumores de NSCLC se han utilizado como variables activas y están representadas por cuadrados en negrita y el círculo. características clínico (es decir, la diferenciación, el tipo histológico, el género, el consumo de tabaco, la etapa y la clasificación TNM) se han utilizado como variables ilustrativas, y están representadas por pastilla abierta. Todas las variables fueron colocados de acuerdo con el centro de gravedad de todos los pacientes que pertenecen a la categoría representada. Los parámetros clínicos potencialmente asociados con la expresión ID2 están subrayadas y en cursiva. Se realizó un análisis DEMOD para identificar asociaciones estadísticas entre la expresión ID2 y las características clinicopatológicas: B. Sólo los parámetros identificados con el MCA han sido presentados en la tabla (es decir, el tipo histológico, estado T, el estado de los ganglios linfáticos, y la diferenciación del tumor).
univariado y análisis de supervivencia multivariante
Para determinar si la inmunotinción de ID2 tenía un valor pronóstico, hemos examinado la asociación entre la expresión global, nuclear y citoplasmática de ID2 con la supervivencia global de los pacientes. En primer lugar, se analizaron parámetros clínico convencionales. Se observó un efecto significativo de la etapa del tumor (p = 0,0001) y el tamaño del tumor (p = 0,014) en el paciente de supervivencia (figuras 3A-C) en general, mientras que el estado ganglionar (N0 vs. N +) fue de significación dudosa (p = 0,06) . diferenciación histológica no era un marcador de pronóstico en nuestra cohorte de pacientes con CPNM (p = 0,48; datos no mostrados). Del mismo modo, no se observó una diferencia significativa en la supervivencia global entre los pacientes con altos niveles de expresión de ID2 y los que presentan bajos niveles de expresión de ID2 (Figura 3D-E). Sin embargo, después de la estratificación de los datos de acuerdo con diferenciación histológica (Figura 3G-I), los pacientes con CPNM pobremente diferenciados con alta expresión nuclear mostraron una supervivencia general más corta que los pacientes con expresión nuclear ID2 baja (mediana de supervivencia = 24 vs. 41 meses, respectivamente ; p = 0,036; Figura 3G). Además, el análisis multivariado mediante el modelo de regresión de Cox demostró que la expresión ID2 nuclear en pacientes con tumores poco diferenciados fue un factor pronóstico independiente de la supervivencia global (p = 0,034; RR = 13,7; IC 95% = 1,2 a 161; Tabla 2). No se observó ningún valor pronóstico de la expresión nuclear ID2 en tumores moderados o bien diferenciados (datos no mostrados)
A-F:. Las curvas de Kaplan-Meier establecidos para todos los pacientes con CPNM (n = 59) de acuerdo con la etapa de la enfermedad (A), el estado ganglionar (B), el estado T (C), nuclear (D), citoplásmica (e), y la expresión global de la ID2 (F). G-I: curvas de Kaplan-Meier obtenidos para pacientes con tumores poco diferenciados (n = 18) de acuerdo a la energía nuclear (G), frente al citoplasma (H), y la expresión global (I) de ID2. Las curvas se compararon con la prueba de log-rank.
Discusión
El papel de ID2 se ha estudiado en varios tipos de cáncer (es decir, de próstata, de mama, colorrectal, el neuroblastoma , y muy recientemente pequeñas de cáncer de pulmón de células), pero hasta la fecha, no se sabe nada acerca de la expresión de ID2 en el cáncer de pulmón de células no pequeñas, que afecta a 80% de los pacientes con neoplasias pulmonares. Aquí, nos centramos en la expresión de ID 2 en el CPNM y su relación con los parámetros clínico y el pronóstico de la enfermedad. La expresión de ID2 se evaluó en 62 tumores de NSCLC mediante inmunohistoquímica utilizando microarrays de tejidos. Aunque la mayoría de los pacientes analizados en este estudio expresó ID2, el grupo de pacientes era muy heterogéneos con respecto a tanto el nivel de expresión y la localización intracelular. Sin embargo, hemos demostrado que la expresión de alto ID2 en los núcleos parece estar correlacionado con una pobre diferenciación del tumor. Esta observación está bien de acuerdo con las propiedades conocidas de ID2, ya que la proteína se ha caracterizado como un inhibidor de la diferenciación en numerosos tejidos, incluyendo la epidermis y el músculo [18], [19]. Por lo tanto, ID2 inhibe la diferenciación muscular, por interacción directa con MyoD, un factor de transcripción bHLH requerida para la diferenciación myoblastic [20]. Por otra parte, en el carcinoma de próstata, la fuerte expresión ID2 se asoció con grados de tumor pobremente diferenciados, lo que sugiere que ID2 también podría estar implicada en la regulación de la desdiferenciación del tumor [11], [21]. Nuestros datos muestran que un alto nivel de expresión nuclear de ID2 fue un marcador pronóstico independiente y negativa de la supervivencia en pacientes con tumores de pulmón poco diferenciado. Por lo tanto, los pacientes con tumores que muestran alta expresión nuclear de ID2 tienen 13,7 veces más riesgo de morir que los pacientes con baja expresión de ID2. El valor pronóstico de la expresión de alto ID2 ya se ha demostrado en otros tipos de cáncer como el neuroblastoma y el cáncer de próstata [7], [11], [21], [22], [23]. Sin embargo, han informado de estudios previos sobre el cáncer de mama y SCLC que la alta expresión citoplásmica de ID2 se asoció con un buen pronóstico, mientras que no se encontró correlación entre la expresión nuclear de ID2 y la supervivencia de los pacientes [13], [22]. Kamalian
et al.
Sugirió que en el CPCP aumento de la expresión de ID 2 en el citoplasma podría ser debido a su exportación a partir de núcleos y puede reducir el efecto pro-tumoral de ID2. Estos resultados fueron globalmente de acuerdo con nuestro estudio, como hemos demostrado una relación directa entre la expresión nuclear de ID2 y la supervivencia de los pacientes. Sin embargo, las diferencias con respecto a la localización ID2 pueden tener su origen, en parte, de las diferencias entre las dos patologías, sino también de las diferencias en la especificidad de los anticuerpos. De hecho, hemos utilizado anticuerpos Zymed según lo recomendado por Perk
et al.
, Que advirtió contra el uso de anticuerpos específicos ID2 mal [24]. En conjunto, nuestros datos sugieren que tanto la expresión ID2 y localización intracelular deben ser evaluados con el fin de determinar el pronóstico para los pacientes de cáncer, incluyendo aquellos con cáncer de pulmón. La localización intracelular de ID2 puede jugar un papel importante en el control de la función ID2 y la regulación del destino celular. Kurooka
et al.
Determinó que el núcleo-citoplasma shuttling de ID2 es un mecanismo activo dependiente de la proteína CRM-1, y está inversamente correlacionada con la represión transcripcional a través de la secuencia de E-box [25]. Además, lasorella y Iavarone demostraron que la interacción entre ID2 y el homólogo enigma actina-proteína asociada (ENH) también controla la localización de ID2 [26]. De hecho, la regulación negativa de la expresión ENH impide relocalización de ID 2 en el citoplasma de las células de neuroblastoma diferenciadas. Este resultado nos permite especular sobre la posible implicación de ENH o proteína CRM-1 en el mecanismo de desdiferenciación de NSCLC. Nuestros resultados indican que ID2 nuclear es probable que sea un factor pronóstico en la translocación mediada por ENH NSCLC y de ID2 al citoplasma puede explicar la falta de valor pronóstico para ID2 citoplasmática. Sin embargo, el papel de ID2 compartimentación en la progresión tumoral de pulmón, aunque potencialmente interesantes, requeriría una evaluación adicional.
El mecanismo por el cual ID2 promueve la progresión del tumor de pulmón todavía no está claro. Sin embargo, los resultados obtenidos en otros modelos sugieren que la acción de ID2 podría depender de la inhibición de la vía de Rb supresora de tumores [3], [27]. Además, se ha demostrado que ID2 también regula la angiogénesis y la apoptosis a través de la regulación transcripcional de la
VEGF
y
BCL2
genes, respectivamente [28], [29]. Sin embargo, la acción de ID2 también podría ser específico de tejido: en líneas celulares de cáncer de mama, la alta expresión de ID2 reduce el potencial de crecimiento y la invasividad, mientras que la regulación de ID2 aumento de la proliferación y el potencial invasivo de las células de tumor de próstata [11], [22], [23].
por último, a pesar de nuestros resultados son preliminares, sugieren que ID2 podrían estar involucrados en los procesos de desdiferenciación del tumor de NSCLC, y podría ser utilizado como marcador pronóstico para los pacientes con tumores poco diferenciados. Curiosamente, en el CPNM, carcinoma pobremente diferenciado son difíciles de clasificar, y como tal, la identificación de nuevos fabricantes de pronóstico para este grupo particular pueden ayudar a mejorar los resultados terapéuticos de los pacientes.
Materiales y Métodos
las muestras tumorales
Hemos analizado muestras de tejido recogidas en un grupo prospectivo de 62 pacientes con NSCLC, que habían sido sometidos a resección quirúrgica completa del tumor pulmonar como tratamiento inicial (es decir, sin la radioterapia o la quimioterapia previa) entre enero de 2002 y agosto de 2004 a Servicio de Cirugía Torácica del hospital Trousseau (Tours, Francia). Las muestras quirúrgicas fueron fijadas en 10% formalina y embebidos en parafina para el examen histológico de rutina e inmunohistoquímica. tipos histológicos, la diferenciación, la clasificación TNM, y la agrupación de las etapas (que se resumen en la Tabla I) se determinaron de acuerdo con los criterios de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para los tumores de pulmón [30]. Se obtuvo consentimiento escrito de todos los pacientes incluidos en este estudio según lo recomendado por la legislación francesa.
Tissue Microarray fabricación e inmunohistoquímica
Para la fabricación de microarrays de tejidos (TMA), áreas representativas de las muestras de NSCLC fueron identificados por un patólogo quirúrgico de hematoxilina-eosina (HE) manchadas diapositivas. Para cada tumor, tres biopsias de núcleo de 1 mm de diámetro se toman de las áreas seleccionadas de bloques donantes y dispuestos en un bloque de parafina receptor utilizando un arrayer manual de tejidos (Beecher instrumentos, Sun Prairie, EE.UU.). Se cortaron secciones (4 micras de espesor) de los bloques de TMA e inmunohistoquímica se realizó usando un anticuerpo específico policlonal de conejo contra ID2 (ZMD.325, Invitrogen, Cergy Pontoise, Francia). En pocas palabras, la sección de TMA se desparafinaron, se rehidrata, y se sometió a calentar la recuperación de antígenos en un tampón de etilendiamina tetra acético ácido (MS-desenmascarador, pH 7,8, Diapath) durante 20 min. anticuerpo ID2 se aplicó a una dilución 1/50. La inmunotinción se realizó con el Vision Autostainer Lab (Lab Vision, Fremont, EE.UU.), utilizando un sistema de detección de biotina-estreptavidina-peroxidasa con diaminobencidina como cromógeno (kit de detección de ChemMate ™, DakoCytomation). Las diapositivas se counterstained con hematoxilina. El TMA contenía muestras del núcleo de la mucosa bronquiolar normal y el tejido pulmonar. La especificidad de anticuerpo ID2 era el control mediante el uso de proteína ID2 purificada como control negativo para bloquear la unión de anticuerpos ID2 a las células tumorales (Figura S1).
Dos observadores independientes (JR, CB) evaluaron tanto la localización y la intensidad de la tinción ID2. Esta evaluación fue cegado a los datos clínicos. Ambos resultados de tinción nucleares y citoplásmicos de las células tumorales se establecieron multiplicando la intensidad de la tinción escala de 0 a 3 (null = 0, débil = 1, moderada = 2, y fuerte = 3) por el porcentaje de células positivas (0 = & lt; 10%; 1 = 10 a 25%; 2 = 26 a 50%; 3 = 51-75%; 4 = & gt; 75%). expresión global de ID 2 en las células tumorales se obtuvo mediante la suma de los resultados de tinción nucleares y citoplásmicos.
Análisis estadístico
Se realizó un análisis de componentes múltiples (MCA) en datos recogidos de 62 pacientes que utilizan el software SPAD . Este método es un análisis multivariado descriptivo que permite una rápida identificación de las relaciones estadísticas entre variables. En pocas palabras, las diferentes categorías, es decir, la expresión ID2 y las características clinicopatológicas, se colocaron en el espacio multidimensional. Con el fin de observar las distancias entre puntos, que fueron proyectados en un plano de dos factores ortogonales,
F
1 y
F página 2. Estos factores primeros '' fueron elegidos para ser los más representativos de la varianza de los datos mundial. Debido a la posición de las categorías de las variables activas (nuclear, citoplásmica y expresión global de ID2) y la posición de observaciones (fase, estado de los ganglios linfáticos, el estado del tumor, tipo histológico, grado de diferenciación, género y tabaquismo) se calculan en de la misma manera, que se puede colocar en el mismo gráfico (observaciones siendo reemplazados por los centros de gravedad). Método DEMOD (software SPAD), similar a la prueba de chi-cuadrado, también se utilizó para complementar la CRM para analizar la asociación entre las variables activas (nuclear, citoplasmática, y la expresión global de ID2) y las variables ilustrativas (características clínico-patológicas).
la supervivencia global se calcula a partir del momento del diagnóstico histológico de la fecha de muerte por cualquier causa. La tasa de supervivencia global fue analizada de acuerdo con el método de Kaplan-Meier, y las diferencias en las tasas de supervivencia se evaluaron mediante la prueba de log-rank (software Medcalc versión 7.3.0.1). El análisis multivariado de factores pronósticos se realizó a través de Cox modelo de riesgo proporcional (Medcalc).
Apoyo a la Información
Figura S1. El análisis inmunohistoquímico de
incluido en parafina humana NSCLC usando el anticuerpo policlonal de conejo contra ID2. IHC se realizó con anticuerpo solo (A y C) o después de la neutralización del anticuerpo por la preincubación con 2 mg /ml de proteína ID2 purificada (ID2 P01 proteína recombinante, Abnova, Taiwan), durante la noche a 4 ° C, (B y D).
doi: 10.1371 /journal.pone.0004158.s001 gratis (9.11 MB TIF) guía
Reconocimientos
Agradecemos a a de Muret (departamento d'Anatomie pathologique, CHRU de Tours, Francia) y el profesor P Dumont (departamento de Cirugía Thoracique, CHRU de Tours, Francia) para proporcionar las muestras de pulmón.