Extracto
Numerosos genes de la longevidad se han descubierto en organismos modelo y alterar sus resultados de la función en la vida útil prolongada. En los mamíferos, algunos han especulado que los beneficios para la salud derivados de la manipulación de estas mismas vías pueden ser compensados por el aumento de riesgo de cáncer a causa de su propensión a aumentar la supervivencia celular. Se propone desacetilasas dependientes que la base de los beneficios para la salud de la restricción calórica (CR), una dieta que suprime ampliamente cáncer en mamíferos - La familia Sir2 /SIRT1 de NAD
+. Aquí mostramos que CR induce una expresión SIRT1 aumento de dos veces en el intestino de los roedores y que la inducción ectópica de SIRT1 en un modelo de ratón β-catenina-impulsado de cáncer de colon reduce significativamente la formación de tumor, la proliferación, y la morbilidad de los animales en ausencia de CR. Se demuestra que la SIRT1 deacetylates β-catenina y suprime su capacidad para activar la transcripción y conducir la proliferación celular. Por otra parte, la SIRT1 promueve la localización citoplasmática de la forma oncogénica de otro modo nucleares localizada de β-catenina. Consistente con esto, se encontró una correlación inversa significativa entre la presencia de SIRT1 nuclear y la forma oncogénica de β-catenina en 81 muestras de tumores de colon humanos analizados. En conjunto, estas observaciones muestran que la SIRT1 suprime la formación de tumores intestinales
in vivo
y aumentar la posibilidad de que las terapias dirigidas a SIRT1 pueden ser de uso clínico en tumores malignos β-catenina impulsada
Visto:. Firestein R, G Blander, Michan S, Oberdoerffer P, Ogino S, Campbell J, et al. (2008) La SIRT1 deacetilasa Suprime intestinal Tumorigénesis y el crecimiento del cáncer de colon. PLoS ONE 3 (4): e2020. doi: 10.1371 /journal.pone.0002020
Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Instituto de Investigaciones Ordway, Estados Unidos de América
Recibido: 5 de Marzo, 2008; Aceptado: 11 de marzo de 2008; Publicado: 16 Abril 2008
Derechos de Autor © 2008 Firestein et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. RF era apoyado por el NIH T32 Grant. GB mediante una beca postdoctoral Estee Lauder. PO por un Instituto de Investigación Biomédica Espacial Nacional Grant. DAS, SO, LCR y LG por las subvenciones del NIH; RD en parte por el Programa de Investigación Intramural del NIH /NIA. DS también es apoyado por una donación de la Fundación Paul F. Glenn
Conflicto de intereses:. Leonard Guarente y David Sinclair son consultores de Sirtris farmacéuticos. William Hahn es un consultor para Novartis Pharmaceuticals.
Introducción
El cáncer es la segunda causa de mortalidad relacionada con la edad en los seres humanos. La restricción calórica prolonga la vida útil en todos los organismos probados y en los mamíferos ejerce fuertes efectos supresores de tumor [1]. En eucariotas inferiores,
se propone el SIR2
gen para mediar en los beneficios para la salud de CR [2], [3]. SIRT1, el ortólogo de mamífero de
SIR2
, es inducida por CR en múltiples tejidos de mamíferos, y se ha demostrado para aliviar enfermedades degenerativas asociadas con el envejecimiento, como la neurodegeneración y la disminución del metabolismo [4]. Mientras que CR es conocida para inhibir la formación de tumores, tanto espontánea e inducida, un papel de SIRT1 en este proceso aún no se ha demostrado [5]. Existen datos contradictorios
in vitro
en cuanto a si la SIRT1 se encontrará a actuar como un oncogén o como un supresor de tumores, pero hasta la fecha no ha habido
in vivo
estudios que abordan esta cuestión. Por un lado, SIRT1 es upregulated en los tumores y las células cancerosas que carecen del gen supresor de tumores, HIC1 [6], puede inhibir la apoptosis [7], [8], [9], [10] y regula por disminución la expresión de tumor genes supresores [11], lo que lleva a muchos a concluir que la SIRT1 demostrará ser un oncogén
in vivo
. Por otro lado, SIRT1 puede ser pro-apoptótica [12] y anti-proliferativa [13], [14], y por lo tanto se ha propuesto para comportarse como un supresor de tumores
in vivo
. Por otra parte, algunos han argumentado que los genes de la longevidad de mamíferos que retrasan las enfermedades relacionadas con la edad atróficas pueden predisponer a la inversa, los seres humanos a una mayor incidencia de cáncer debido a su función anti-apoptótica [15]. Este estudio aborda esta cuestión controvertida por probar los efectos de SIRT1 en la formación de tumores y el crecimiento.
Hemos elegido para probar el efecto de SIRT1 en el APC
+ min modelo /de cáncer de colon para una variedad de razones : se recapitula fisiológicamente los eventos tempranos de cáncer de colon en seres humanos, el mecanismo de la tumorigénesis está bien caracterizada, y CR ha mostrado previamente para reducir la tasa de la tumorigénesis en este modelo [16]. La APC
min /+ ratón contiene una mutación germinal en la poliposis adenomatosa coli (APC) gen supresor de tumores [17]. pérdida somática del segundo alelo conduce a la localización nuclear constitutiva de β-catenina y la formación de adenoma [18], [19].
β-catenina es el efector central en la vía canónica de señalización Wnt que controla el mantenimiento de células madre , el desarrollo y la carcinogénesis [20]. la activación constitutiva de la vía β-catenina se ha encontrado en el 90% de los cánceres colorrectales [21], [22]. Además, esta vía se activa de forma aberrante en muchos otros tipos de cáncer, incluyendo próstata, mama, ovario y melanoma. Curiosamente, dos estudios recientes han demostrado que el aumento de la señalización de Wnt se asocia con el envejecimiento acelerado, lo que sugiere que una atenuación de la señalización de Wnt podría subyacen CR y ser beneficioso no sólo para el tratamiento de cáncer, pero para atenuar más ampliamente enfermedades del envejecimiento [23], [24] .
Presentamos aquí que la SIRT1 suprime la tumorigénesis intestinal en el APC
min /+ modelo de ratón e inhibe el crecimiento del cáncer de colon. Se proporcionan evidencia sustancial de que los efectos anti-tumorigénicos de SIRT1 dependen de su actividad deacetilasa y están mediados por la inhibición de la β-catenina. Estos hallazgos identifican una función supresora de tumores de SIRT1, proporcionar una visión mecanicista, y sugieren un papel terapéutico para los activadores de SIRT1 deacetilasa en el cáncer de colon.
Resultados
Estudios anteriores han demostrado un efecto supresor tumoral dramática de CR pero el mecanismo molecular (s) Actualmente no se conocen. Hemos observado que las ratas con una dieta CR tienen ~ 2 veces mayores niveles de SIRT1 en el epitelio intestinal en relación a
ad lib
controles -fed (fig. 1A). Para probar el efecto de aumentar la expresión de SIRT1 en las células epiteliales intestinales, hemos generado un ratón transgénico floxed SIRT1 (Fig. 1B). ratones transgénicos SIRT1 se cruzaron a APC
min /+ ratones seguido de la cría con la cepa Villin-Cre [25]. Por lo tanto, hemos generado ratones transgénicos triples (SIRT1
ΔSTOP; Vil-Cre; APC
min /+) que sobreexpresan SIRT1 específicamente en las vellosidades del intestino (referido como SIRT1
ΔSTOP). Los niveles de SIRT1 en el intestino de SIRT1
ratones ΔSTOP fueron de aproximadamente 7 veces (Fig. 1E) y la morfología de las vellosidades, parecían normales (Fig. 1F).
(A) análisis de transferencia de Western que muestra los niveles de expresión en el epitelio intestinal de SIRT1 en ratas alimentadas con libitum (aL) o restringidas en calorías ad (CR). β-actina sirvió como control de carga en todos los carriles. (B) Representación esquemática de la estrategia usada para la generación de la madre embrionarias floxed SIRT1 ratón (MES) células. SIRT1 fue clonado aguas abajo de un promotor constitutivo CAGGS seguido de un casete transcripcional loxP-STOP-loxP. Esta construcción se dirige específicamente en el 3 'UTR del locus colágeno A1 (COLA1) de células madre embrionarias de ratón (MES) células por FLP recombinación. Las células fueron inyectadas en blastocistos MES dirigidos. Las flechas rojas indican la ubicación de los cebadores de genotipado SIRT1-TG. (C) Southern blot que muestra la confirmación de la SIRT1
PARAR sola integración en el locus Col1A de células MES. (D) de PCR confirma la transmisión de la línea germinal de la SIRT1
PARAR transgén a la descendencia de las quimeras. (E) Transferencia Western que muestra los niveles de SIRT1 en los ratones transgénicos que sobreexpresan triples SIRT1 (SIRT1
ΔSTOP) y controles (SIRT1
STOP). β-actina sirvió como control de carga en todos los carriles. (F) La mucina tinción inmunohistoquímica y de SIRT1 en el intestino delgado de los experimental (SIRT1
ΔSTOP) y controles (SIRT1
STOP) animales.
APC
min /+, SIRT1
ratones orden de parada que no sobreexpresan SIRT1 (conocido como SIRT1
STOP) mostró los signos típicos de la morbilidad del tumor a las 16 semanas de edad, como se evidencia por la anemia manifiesta y caquexia, mientras que APC
min /+ ratones que sobreexpresan SIRT1 (SIRT1
ΔSTOP) no presentaban signos manifiestos de la morbilidad asociada a tumores (Fig. S1A, B). El examen de la tripa que recubre a los cuatro meses de edad mostraron que los ratones SIRT1
ΔSTOP transgénicos tenían tumores significativamente más pequeños y menos a lo largo del tracto intestinal (Fig. 2A). La cuantificación de la carga tumoral reveló a 3 a 4 veces de reducción en el número y tamaño de adenomas en el intestino delgado y el colon de los SIRT1
ratones ΔSTOP (Fig. 2B). Ki-67 es un componente granular del nucleolo que se expresa exclusivamente en células en proliferación y se utiliza como un marcador pronóstico en neoplasias humanas. Los adenomas de los SIRT1
ratones ΔSTOP tenía una reducción significativa en el número de mitosis (por campo de alta potencia) y Ki-67 tinción, lo que demuestra que hubo una disminución en la proliferación de adenoma (Fig. 2C). Estos datos demuestran que la sobreexpresión de SIRT1 en el intestino en niveles similares a los inducidos por CR es suficiente para imitar el efecto supresor del tumor de la RC en la APC
min /+ ratón.
(A) Imágenes de duodenal conjunto y segmentos ileales muestran tumores intestinales brutos en ratones que sobreexpresan SIRT1 (SIRT1
ΔSTOP) y controles (SIRT1
STOP). La línea continua indica unión gastro-duodenal. Las flechas indican adenomas. barra blanca representa 1 mm escala. (B) Número medio de los tumores según su localización intestinal en SIRT1
tope de control (n = 8) y SIRT1
ΔSTOP ratones experimentales (n = 11). (C) Ki-67 tinción de adenomas y las tasas de proliferación. Las imágenes muestran Ki-67 tinción inmunohistoquímica de adenomas de SIRT1
STOP y SIRT1
ΔSTOP. índice de proliferación se expresa como el porcentaje de Ki-67 células de adenoma de colores (un promedio de por lo menos 10 adenomas por cohorte). el índice mitótico se calcula como el número de mitosis histológicamente identificables por 10 campos de alta potencia (400 ×). Los valores de B y C son medias ± S.D..
Para hacerse una idea de los mecanismos por los que la SIRT1 reduce la proliferación celular, se examinó el efecto de SIRT1 en la tasa de crecimiento de varias líneas celulares de cáncer bien caracterizados. La proliferación de células de cáncer de próstata LNCaP se redujo en gran medida por la sobreexpresión de SIRT1 y el efecto fue similar a la supresión de β-catenina en sí (Fig. 3A). Esta observación sugiere que SIRT1 y la función β-catenina en el mismo contexto celular. Para explorar esta posibilidad, overexpressed SIRT1 y una SIRT1 mutante catalíticamente inactivo (SIRT1
ΔHY) en diferentes líneas celulares de cáncer de colon humano cuyo crecimiento se ve impulsado por la β-catenina constitutivamente activa (HCT116 y DLD1). Una línea celular de cáncer de colon humano en el que β-catenina es inactiva (RKO) sirvió como control negativo. El aumento de expresión de SIRT1 proliferación reducido en gran medida en las dos líneas celulares de cáncer de colon con constitutivamente activa β-catenina, pero no en la línea celular de β-catenina-inactivo (Fig. 3A-D). La SIRT1
ΔHY mutante catalítica no tuvo efecto significativo sobre la proliferación celular en ninguna de las líneas celulares (Fig. 3B-D). Por lo tanto, suprime la proliferación SIRT1 β-catenina-conducido y su actividad catalítica es aparentemente necesario para este efecto.
(A-D) Stable LN-CAP, se sembraron líneas celulares DLD1, HCT116 y RKO que expresan el producto indicado y el número de células se controló a diferentes puntos de tiempo. Western blot se realizó con anticuerpos SIRT1, actina o β-catenina. (E) DLD1 líneas celulares estables que expresan Topflash-LuciferasePEST fueron infectadas con las construcciones indicadas. Las células se analizaron por transferencia de Western con anticuerpos contra SIRT1 y β-catenina. La actividad de luciferasa se normalizó para la proteína total de la muestra y representa tres experimentos independientes realizaron por cuadruplicado.
Para comprender mejor el mecanismo por el que la SIRT1 suprime la proliferación β-catenina-conducido, hemos diseñado la línea celular DLD1 para contener un reportero integrado de forma estable con β-catenina elementos de respuesta (Super8XTopflash-luciferasa
Control de plagas). Desmontables de β-catenina reduce drásticamente la actividad del indicador, lo que demuestra la dependencia de la actividad de reportero en β-catenina endógena (Fig. 3E). La sobreexpresión de la actividad de reportero reducida SIRT1 por ~ 2 veces, mientras que la SIRT1
ΔHY mutante catalítica no tuvo ningún efecto (Fig. 3E), lo que sugiere que los efectos anti-proliferativos de SIRT1 están mediados por su capacidad para suprimir la actividad transcripcional de endógeno β-catenina y que esto requiere la actividad de SIRT1 deacetilasa.
la acetilación de β-catenina por p300 /CBP potencia su oncogenicidad mediante el aumento de β-catenina /TCF avidez en los promotores de genes diana [26]. Para probar si SIRT1 modifica β-catenina, células HEK293T fueron transfectadas con una forma mutante de β-catenina que se localiza constitutivamente en el núcleo (S33Y-β-catenina) [27]. En estas células SIRT1 co-inmunoprecipitado con β-catenina (Fig. 4A) y viceversa (Fig. 4B). Una interacción entre SIRT1 endógeno y β-catenina también fue evidente (Fig. 4C).
células 293T Humanos (A) se transfectaron transitoriamente con HA-S33Y-β-catenina en combinación con SIRT1 bandera de etiquetado o control de vectores. Las alícuotas de proteína total se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpo anti-FLAG (FLAG IP). Las proteínas inmunoprecipitadas se inmunotransfirieron con anticuerpos anti-HA (panel superior) y anti-FLAG (panel inferior). carriles de la izquierda, los extractos no procesados (de entrada). (B) Las células 293T se transfectaron Humanos como en el panel A. Las proteínas inmunoprecipitadas con anticuerpo anti-HA y inmunotransferencia con anti-FLAG (panel superior), y anti-HA (panel inferior). carriles de la izquierda, los extractos no procesados (de entrada). (C) Inmunoprecipitación de SIRT1 de extractos de células LN-PAC utilizando anticuerpo anti-SIRT1 o IgG de conejo normal como control (IgG). 10% de la proteína inmunoprecipitada fue entonces borró con anti-SIRT1 (panel superior), mientras que el 90% restante se transfirió con anticuerpos anti-β-catenina. Se transfectaron (D) células 293T como se indica y se lisaron 48 horas más tarde. niveles comparables de β-catenina se inmunoprecipitaron y se transfirieron los residuos acetilados-lisina (IP: HA IB: Ac-K, panel superior). La transferencia se volvió a sondear para HA para demostrar niveles aproximadamente iguales de la HA-β-catenina (IP: HA IB: Ha; panel inferior). Las células 293T (E-F) se transfectaron como se indica junto con la luciferasa TOP-FLASH y PRL-TK Renilla luciferasa constructo. Se añadieron nicotinamida (NAM) o retroviral SIRT1 shRNA (ARNi) como se indica. Se normalizaron los datos con respecto a la actividad de luciferasa de Renilla. Los datos son medias ± S.D.. a partir de muestras realizado por triplicado. (G) la tinción de inmunofluorescencia indirecta de células DLD-1 de cáncer de colon infectadas con el retrovirus vacío o virus que contiene SIRT1 shRNA (RNAi) o SIRT1 ADNc (sobreexpresión, O /E). Porcentaje de células con alto, medio, o bajo nivel de tinción de β-catenina nuclear para no tratada: 6.5, 80.6, 12.9; SIRT1 O /E: 0, 29.4, 70.5; SIRT1 RNAi: 60,0, 32,0, 0,8. Se tomaron imágenes a un aumento de 100x.
Para probar si SIRT1 inhibe la β-catenina mediante la modulación de la acetilación, las células 293T transfectadas con S33Y-β-catenina, la p300 acetiltransferasa, y cantidades crecientes de SIRT1 . Se encontró que p300 acetilado β-catenina (Fig. 4D) y potenció su actividad transcripcional, como se ha informado anteriormente [27] (Fig. 4E). La adición de SIRT1, sin embargo, abolió la forma acetilada de β-catenina y disminuyó significativamente la actividad de β-catenina cuando se co-transfectadas con p300 (Fig. 4D, E). Por el contrario, el tratamiento de las células con el inhibidor de SIRT1 nicotinamida (NAM) [28] o la supresión de SIRT1 con un aumento de la actividad de luciferasa vector retroviral shRNA (Fig. 4F). Estos datos muestran que SIRT1 promueve la desacetilación de la β-catenina, lo que reduce su capacidad de actuar como un trans-activador
.
La presencia constitutiva de β-catenina en el núcleo se asocia con su función oncogénica y clínicamente con un pobre pronóstico de los pacientes [29]. Para probar si SIRT1 podría reprimir β-catenina mediante la alteración de su localización, la inmunofluorescencia se realizó en células transfectadas con shRNA o sobreexpresión construcciones para SIRT1. Represión de SIRT1 en las células de cáncer de colon DLD1 aumentó la cantidad de β-catenina nuclear, mientras que la sobreexpresión de SIRT1 en la misma línea celular dio lugar a una reducción dramática en la piscina β-catenina nuclear (Fig. 4G).
para analizar la relevancia clínica de nuestros resultados, analizamos la SIRT1 y β-catenina expresión subcelular en un microarray de tejido que contiene 81 muestras de cáncer de colon humano. Se encontró que un subconjunto de cánceres de colon expresar SIRT1 en el núcleo (47/81 casos; 58%). Cuando la expresión β-catenina se obtuvo en estos mismos cánceres de colon, una correlación inversa altamente significativa entre el nivel de expresión de SIRT1 y localización β-catenina nuclear hizo evidente (p≤0.003, odds ratio 0,24 con confianza 95% de intervalo de ,093-0,63) ( la Fig. 5A, B). En conjunto, estas observaciones sugieren que la modulación de β-catenina localización subcelular es un componente importante de los efectos anti-tumorigénicos de SIRT1 con potencial relevancia clínica de diagnóstico y terapéutico.
(A) Imágenes representativas que ilustran la SIRT1 y β-catenina expresión subcelular en los tumores de colon humanos. Para cada caso de cáncer de colon se muestra un inserto de cuadro de texto indica la proteína detectada (Ampliación de la imagen 200 ×). Correlación de la SIRT1 y β-catenina expresión (B) en los tumores de colon humanos. El gráfico de barras que representa los datos acumulados de inmunotinción de un microarray de tejido de 81 casos de cáncer de colon. La expresión nuclear se anotó como tampoco ninguna expresión, expresión débil o fuerte expresión /moderado. Positividad en el núcleo se define como una expresión fuerte /moderado. Todas las diapositivas fueron interpretados por dos patólogo certificado por la junta cegado de otros datos clínicos y de laboratorio.
Discusión
A continuación se describe un papel supresor tumoral fisiológicamente relevante para la SIRT1 en la formación de cáncer de colon y crecimiento. Hemos observado que la expresión de SIRT1 en el intestino normal, se produce específicamente en los enterocitos, las células precursoras que se someten a la transformación neoplásica en los cánceres de colon y que la SIRT1 está regulada positivamente en los intestinos de roedores en respuesta a CR. Se demuestra que la sobreexpresión de SIRT1 reduce la proliferación de líneas celulares de cáncer de colon y que la sobreexpresión de SIRT1 en los enterocitos de APC
min /+ animales imita los efectos supresores tumorales de CR en este modelo de cáncer de colon. Estas observaciones son consistentes con un
in vitro
estudio reciente que implica SIRT1 como un supresor de crecimiento sensible de nutrientes [30]. Mientras SIRT1 se expresa en nuestra ratones transgénicos en niveles más altos que los observados en los intestinos de los roedores CR tratados (7 veces (SIRT1) frente a 2 veces (CR)), este nivel de sobreexpresión es, sin embargo, consistente con los hallazgos que SIRT1 puede ser fisiológicamente upregulated 5-10 veces
in vivo
[31]. Dado que los efectos supresores de tumores mediados por SIRT1 eclipsan los observados por CR (reducción de 70% (SIRT1) frente a la reducción de 40% (CR)) [16] no podemos excluir la posibilidad de que SIRT1 también inhibe el crecimiento del tumor por un mecanismo de CR-independiente. Sin embargo, nuestros datos proporcionan
in vivo
evidencia de que la sobreexpresión de SIRT1 en niveles fisiológicamente relevantes, puede suprimir la formación de tumores y el crecimiento.
En este estudio, también presentan evidencia de que la SIRT1 interactúa con y suprime β-catenina, el factor de transcripción que impulsa tumores en el APC
min + modelo /y una variedad de tumores humanos. Encontramos que SIRT1 sobreexpresión inhibe el crecimiento de células de cáncer de colon dependiente de la actividad β-catenina, suprime la localización de β-catenina en el núcleo, y atenúa de manera significativa su capacidad para activar la transcripción. Estos efectos no se observaron en el mutante SIRT1-HY demostrando que se requiere la actividad de SIRT1 deacetilasa, y el aumento de la posibilidad de que SIRT1 dirigido directamente β-catenina de desacetilación.
Estudios anteriores han demostrado que la β-catenina se acetila por p300 /CBP y la forma acetilada de la proteína se ha incrementado la actividad transcripcional. Este hallazgo implica que la desacetilasa putativo que contrarrestar p300 /CBP sería útil como diana terapéutica del cáncer [32]. En este estudio, identificamos como SIRT1 deacetilasa que antagoniza p300 /CBP y deacetylates β-catenina, frenando así la proliferación celular y el crecimiento tumoral
in vivo
.
En conjunto, nuestros datos cobertizos de luz sobre la capacidad de SIRT1 para inhibir la actividad β-catenina y proporciona una visión mecanicista de los efectos anti-tumorigénicos de SIRT1 en un modelo de cáncer de colon bien caracterizado. Teniendo en cuenta que la SIRT1 se descubrió como un homólogo de un gen de la longevidad, es interesante observar la creciente evidencia de un vínculo entre la Wnt /β-catenina señalización y las enfermedades asociadas a la edad. β-catenina se ha relacionado con otros tumores malignos asociados con la edad, tales como melanoma, mieloma múltiple, y cáncer de próstata. También existe el reciente descubrimiento de que la regulación al alza de la señalización /β-catenina Wnt acelera el envejecimiento en el ratón [23], [24]. Por lo tanto, será la pena investigar si SIRT1 puede proporcionar protección contra otras enfermedades asociadas con la edad a causa de su capacidad para suprimir la señalización /β-catenina vía.
En resumen, el uso de la bioquímica, la genética del ratón y tumor clínica especímenes hemos encontrado que SIRT1, un gen sensible a la dieta, es un regulador de la β-catenina y tiene una función supresora de tumor. Llegamos a la conclusión de que los genes de la longevidad de mamíferos con funciones anti-apoptóticas, sorprendentemente no conducen necesariamente a un aumento de la tumorigénesis. De hecho, encontramos es probable lo contrario en el caso de SIRT1. Estos estudios empiezan a responder a una pregunta importante biológica con respecto a la función de un gen de la longevidad clave en el desarrollo del cáncer y el crecimiento y sugieren un potencial terapéutico previamente no identificado de activadores de SIRT1 en el cáncer.
Materiales y Métodos
roedores
a Cre-inducible construcción de expresión de SIRT1 se generó en el que un
se insertó loxP
elemento de parada transcripcional flanqueado entre un promotor CAGGS y el cDNA SIRT1. Esta construcción fue dirigido en el ratón colágeno A1 locus utilizando flp integración genómica recombinasa mediada como se ha descrito previamente (1). células MES que llevan una única copia de la SIRT1
constructo de STOP fueron identificados por resistencia a la higromicina marcador antibiótico y transferencia de Southern. Los cebadores de PCR y mapas construir están disponibles bajo petición. Dos clones fueron inyectadas en blastocistos y dos crías generadas, ~ 90% de los cuales muestran la transmisión de la línea germinal. los ratones portadores de tumores que fueron analizadas habían sido backcrossed al menos cuatro generaciones en C57 /BL6. APC
min /+ y Villin-Cre cepas de ratones transgénicos se obtuvieron en el fondo C57 /BL6 de Jackson Labs (Bar Harbor, ME). SirT1
evitar que los animales se backcrossed dos generaciones en ratones C57BL /6 antes de cruzar a APC
min /+ para generar Sirt1
de STOP; APC
+ /min dobles transgénicos. Estos animales fueron criados para ratones transgénicos Villin-Cre para generar una cohorte de SirT1
ΔSTOP; Vil-Cre; APC
min /+ animales. Los animales se mantuvieron en la Escuela de Medicina de Harvard y los experimentos fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Facultad de Medicina de Harvard.
Varón Fischer-344 (F344) ratas fueron criados y criadas en un vivero en el Centro de Investigación en Gerontología (GRC, Baltimore, MD). Desde el destete (2 semanas), las ratas se alojaron individualmente en jaulas de plástico estándar con ropa de cama de viruta de madera beta. Los animales de control fueron alimentados con una dieta ad libitum estándar NIH-31 (AL). En 1 mes de edad se les proporcionó la restricción calórica (CR), los animales una versión de vitaminas y minerales fortificado de la misma dieta a un nivel de 40% menos de alimentos (en peso) que las ratas AL consumidos durante la semana anterior. Filtró y agua acidificada estaba disponible ad libitum para ambos grupos. El vivero se mantuvo a una temperatura de 25 ° C con una humedad relativa del 50% en un ciclo de luz de 12/12 horas /oscuridad (luces encendidas a las 6:00 am) Todos los animales tenían 6 meses de edad y se sacrificaron entre las 9:00 y las 11:00 am El intestino se retiró rápidamente y completamente lava con PBS frío y se colocó en nitrógeno líquido después se almacenaron a -80 ° C hasta su procesamiento para el Western Blot utilizando procedimientos estándar.
Patología Animal, Histopatología e inmunohistoquímica el análisis
Para el análisis de tumor macroscópico, todo el intestino se cortó inmediatamente después del sacrificio, se abrió longitudinalmente y se lava con solución salina tamponada con fosfato (PBS), mientras inmovilizado un soporte sólido. Adenomas más grande que 0,5 mm desde el extremo proximal (10 cm distal al píloro), distal (10 cm proximal al ciego), y medio (~ 50% de la longitud intestinal total) intestino delgado, así como los dos puntos se anotó. Los intestinos se prepararon utilizando el método de brazo de gitano, haciéndolos girar alrededor de una punta de pipeta de vidrio. Los tejidos se fijaron y embebidos en parafina utilizando el protocolo histología estándar. el tamaño del tumor precisa se puntuó microscópicamente en hematoxilina /eosina manchado de intestinos de ratón utilizando un microscopio con un micrómetro ocular. El análisis inmunohistoquímico de los tejidos de roedores se realizó con anticuerpo de conejo anti-SIRT1 (Upstate Biotechnology, cat#07-131), de conejo anti-β catenina (Abcam#2982), de ratón anti-β-catenina (clon 14, BD laboratorios de transducción) y rata anti-ratón Ki-67 (Dako).
inmunohistoquímica y análisis estadísticos
microarrays de tejidos (TMA) se construyeron como se describe anteriormente [33] utilizando el Automated Arrayer (Instrumentos Beecher, Sun Prairie , WI EE.UU.). Para β-catenina y la inmunohistoquímica SIRT1, se llevó a cabo la recuperación de antígenos; secciones de tejido desparafinadas se trataron por un horno de microondas durante 15 min en tampón de citrato (de BioGenex, San Ramon, CA) en una olla a presión. Las secciones de tejido se incubaron con 3% de H
2O
2 (15 min) para bloquear la peroxidasa endógena, después se incubaron con 10% de suero normal de cabra (Vector Laboratories, Burlingame, CA) en PBS (10 min), seguido de 10 min de incubación en el bloque de proteína sin suero (DAKO, Carpinteria, CA). se aplicó (dilución 1:100) durante 1 hora a temperatura ambiente; anticuerpo primario contra la β-catenina (clon 14, BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ) (dilución 1:400) o SIRT1 (Epitomics#1104). se aplicaron anticuerpo secundario (BioGenex) (20 min), y luego con estreptavidina conjugada con peroxidasa (BioGenex) (20 min). Las secciones se visualizaron por diaminobenzidina (DAB) (2 min) y contratinción metil-verde. La expresión nuclear se registró como tampoco ninguna expresión, expresión débil o fuerte expresión /moderado. Positividad en el núcleo se define como una expresión fuerte /moderado. Todas las diapositivas TMA β-catenina-manchado fueron interpretados por un patólogo (S. O.) ciego de otros datos clínicos y de laboratorio. Todas las diapositivas TMA SIRT1 manchados fueron interpretados por un patólogo (R. F.) ciego de otros datos clínicos y de laboratorio. Para el análisis estadístico, se realizó la prueba de chi-cuadrado para los datos categóricos utilizando el programa de software SAS (versión 9.1, SAS Institute, Cary, NC). El valor de p fue de dos caras, y la significación estadística se estableció en p ≤ 0,05.
Los plásmidos
pcDNA3-FLAG-SIRT1, pBABE-Puro-hSir2 (SIRT1), pBABE-Puro -SIRT1
ΔHY, pcDNA-hA-S33Y-β-catenina y pBABE-Puro-S33Y- β-catenina se han descrito antes. plásmidos SIRT1 RNAi se construyeron por clonación de las secuencias en el plásmido pSUPER.retro (OligoEngine, Seattle, WA). Un plásmido TOPFLASH se adquirió de Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY), mientras que el segundo se generó por clonación de sitios y TA-promotor de SUPER8xTOPFLASH (especie de regalo de Randall Luna) en la luciferasa-PLAGAS plásmido pGL4.15 unión del tándem TCF (Promega , Madison, WI).
se mantuvieron
las transfecciones celulares, Infecciones e inmunocitoquímica
293T, LN-PAC, células DLD1, HCT116 y RKO en los medios de cultivo de tejidos recomendada (American Type Culture Collection ( ATCC), Manassas, VA) y se cultivaron en una incubadora humidificada que contenía CO /v)
2 (5% v a 37 ° C. Durante más de expresión experimentos, los plásmidos se transfectaron por el método de Fugene 6 (Roche). Para la generación de la línea celular estable, las células fueron seleccionadas en higromicina DLD1 durante dos semanas y colonias individuales se seleccionaron y se expandieron. Para la producción retroviral, las células 293T se transfectaron con la sobreexpresión o plásmidos RNAi simultáneamente con el empaquetado plásmidos gag-pol y VSV-G o PCL-anfo. se recogieron los medios que contenían el virus progenie liberado para las células 293T y se utilizaron para infectar las células durante 3-6 horas en presencia de 8 mg /ml de polibreno (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). El medio se cambió y las células se incubaron para incubación adicional de 24 a 48 horas. Fueron seleccionadas con puromicina (Sigma Aldrich) durante 24-48 horas y después se trataron con tripsina y se sembraron para los experimentos.
Para la inmunocitoquímica, las células se sembraron en 8 mm de seis diapositivas de teflón bien impresos (Microscopía Electrónica de Ciencias). Veinticuatro horas después de la siembra, las células se fijaron mediante incubación con 4% de paraformaldehído durante 30 minutos. Las células fijadas fueron incubadas con anticuerpos primarios a SIRT1 (# 1104; Epitomics (dilución 1:100) y β-catenina activa (05 a 665; Chemicon) (dilución 1:100) durante 2 horas seguido de incubación con anticuerpos secundarios (Alexa Fluor 488 cabra IgG anti-conejo y Alexa Fluor 568 de cabra anti-IgG de ratón;. Molecular Probes) (dilución 1:400) Las células se incubaron con 10 mg /ml Hoechst, se lavaron y se montaron con un cubreobjetos se puntuaron al menos 20 células. por experimento y la captura de imágenes se realizó utilizando un microscopio Olympus BX50.
y extracción de proteínas inmunoprecipitación
Los extractos celulares analizadas directamente por Western Blot se prepararon por lisis celular en 1 x tampón de carga de SDS seguida de cocción y extractos de análisis Western. celulares para inmunoprecipitación se prepararon resuspendiendo los sedimentos celulares con solución salina lavado tamponada con fosfato en 1 ml de Nonidet tampón de extracción ([8,0 pH], NaCl P-40 (NP-40) mM Tris-HCl 50 150 mM, y 1% Nonidet P-40) suplementado con comprimidos de cóctel inhibidor de la proteasa libre de EDTA (Roche) con nicotinamida 10 mM (NAA) y 5 M tricostatina A (TSA). Después de la incubación en hielo durante 30 minutos, el material no extraíble se eliminó por centrifugación a 17.000
g
durante 10 min a 4 ° C, y los sobrenadantes despejadas fueron empleados para la inmunoprecipitación. Los lisados se inmunoprecipitaron (2 hr), se lavó 4 veces con tampón NP-40 y se procesaron por inmunotransferencia de tipo Western.
Ensayos de proliferación
líneas celulares DLD1, HCT116 y RKO infectada con el constructo apropiadas se se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 10.000 células.