Extracto
subunidades del receptor nicotínico de la acetilcolina (nAChR) se asocian con diferentes aspectos de la conducta de fumar, así como con trastornos relacionados con el tabaquismo. Varias de estas subunidades se han encontrado para ser upregulated en los fumadores o diferencialmente expresado en células tumorales de pulmón. Los mecanismos que subyacen a estas observaciones no son conocidos pero supone que son principalmente post-transcripcional. Muchos post-transcripcional mecanismos son iniciados por motivos de secuencias funcionalmente relevantes dentro de las regiones de genes no traducidas, tales como marcos de lectura abierta aguas arriba (uORFs). Se realizó una búsqueda sistemática en todas las subunidades de nAChR neuronales asociadas al tabaquismo e identificamos uORFs funcionalmente relevantes en
CHRNA4
y
CHRNA5
. experimentos de luciferasa mostraron que estos uORFs son capaces de disminuir de manera significativa la expresión de proteínas. Nuestra cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) resultados sugieren fuertemente que los efectos observados se originan en la traducción en lugar de a nivel de transcripción. Curiosamente, la
CHRNA4
uORF sólo era funcionalmente relevante cuando se expresa en la isoforma más corta de este gen. Por lo tanto, los datos presentados en este estudio apunta fuertemente hacia un papel importante de uORFs dentro de la 5'UTR de
CHRNA4
isoforma 1 y
CHRNA5
como reguladores de la traducción de proteínas. Por otra parte, el uORF compartida de
CHRNA4
isoforma 1 /isoforma 2 representa el primer ejemplo de una secuencia de uORF dependiente del contexto
Visto:. Eggert M, E Aichinger, Pfaffl MW, Steinlein OK , Pfob M (2013) la acetilcolina nicotínico receptor subunidades α4 y α5 asociado con el comportamiento de fumar y el cáncer de pulmón están regulados por aguas arriba marcos de lectura abierta. PLoS ONE 8 (7): e66157. doi: 10.1371 /journal.pone.0066157
Editor: D. Huibert Mansvelder, Neurociencia Campus Amsterdam, VU University, Países Bajos
Recibido: 12 Marzo, 2013; Aceptado: 2 de mayo de 2013; Publicado: 2 Julio 2013
Derechos de Autor © 2013 Eggert et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft [STE16511-2] y la Friedrich-Baur-Stiftung [n 57/12]. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el consumo de cigarrillos es conocido como un importante factor de riesgo para enfermedades malignas y enfermedades cardiovasculares asociadas fumar, como el cáncer de pulmón [1]. Sin embargo, aproximadamente uno de cada tres adultos en todo el mundo fuma y el número va en aumento [2]. Por lo tanto, no es sorprendente que se hacen grandes esfuerzos para descubrir las causas de la dependencia a la nicotina, así como el desarrollo de nuevas estrategias de prevención y tratamiento. La nicotina actúa como un agonista de la acetilcolina que es capaz de unirse a los receptores de acetilcolina nicotínicos neuronales (nAChR). El nAChR forman canales iónicos pentamérica heterogéneos y homogéneos con un patrón de expresión diversa en los tejidos neuronales y no neuronales [3]. En consecuencia, muchos de los genes que codifican las subunidades de nAChR son sospechosos de jugar un papel clave en cuanto a la dependencia de la nicotina. Varios genes de las subunidades de nAChR ya han sido relacionados con el tabaquismo y las enfermedades relacionadas con el tabaquismo. Por ejemplo,
CHRNA7
, se mostró el gen que codifica la subunidad α7 nAChR para reprimir la proliferación de células basales de la vía aérea y la remodelación del epitelio pulmonar. Además, surgió la hipótesis de que la expresión α7 dysregulated da lugar a transformaciones preneoplásicas [4], [5]. Las variantes genéticas dentro de la región de codificación, sino también en la región promotora del
CHRNA4
están asociados con las dos respuestas subjetivas a fumar y los resultados para dejar de fumar [6] - [10]. Sin embargo, la mayoría de los estudios que se han publicado sobre el tema de los receptores colinérgicos y dependencia de la nicotina /enfermedades relacionadas con fumar apuntan hacia el grupo de genes de nAChR en el cromosoma 15. Los polimorfismos en esta región que se reportan más consistentemente asociada con la cantidad de fumar, dependencia a la nicotina , cáncer de pulmón y enfermedad arterial periférica se encuentran ya sea en el
CHRNA5
o
CHRNA3
de genes [11] - [16]. Además, se han descrito asociaciones entre
CHRNB3
polimorfismos y la respuesta al consumo de tabaco primera vez [17].
Los mecanismos por los cuales los genes asociados con nAChR dependencia de la nicotina están regulados, no se conocen en detalle hasta el momento . En general, la expresión del gen puede ser modificada, ya sea pre o post-transcripcional. Los últimos mecanismos son a menudo mediadas por que actúan en cis motivos de secuencias localizadas dentro de las regiones no traducidas (UTR) que están presentes arriba y aguas abajo de la mayoría de las regiones de codificación de genes eucariotas. Varios motivos en el 5'UTR responsables de la regulación de la traducción han sido identificados en los genes eucariotas, tales como los sitios internos de ribosomas principales, elementos de respuesta de hierro y marcos de lectura abierta aguas arriba (uORFs). Los últimos elementos pueden desempeñar un papel crucial en la regulación de la expresión génica. Un creciente cuerpo de evidencia muestra que uORFs son capaces de afectar la traducción de proteínas de varias maneras. ribosomas traducen un escaneo uORF podrían no ser capaces de reiniciar más aguas abajo en la región codificante ATG, o podrían estancarse en el uORF, bloqueando otros ribosomas (ribosomal control de carretera). Alternativamente, el codón de terminación de la uORF podría ser confundido como una mutación sin sentido, lo que provocó mediada la decadencia sin sentido. [18], [19]. Además, la proteína uORF en sí podría modular la traducción, como se indica mediante experimentos de mutagénesis introducción de la mutación de sentido erróneo dentro de las secuencias uORF [20]. Todos estos mecanismos es probable que aumenten la variabilidad funcional de los genes dentro de las poblaciones. La importancia funcional de uORFs se enfatiza aún más por el hallazgo de que las mutaciones dentro de ellos son capaces de causar enfermedades humanas tales como la trombocitopenia hereditaria o Marie Unna pérdida de cabello hereditaria [21], [22].
En el presente estudio se realizado una búsqueda sistemática de uORFs funcionalmente relevantes en subunidades de nAChR que son sospechosos de estar involucrados en la dependencia de la nicotina y las enfermedades relacionadas con el tabaquismo. Nuestros experimentos revelaron que algunos uORFs contribuyen a la regulación de la expresión de la proteína nAChR.
Materiales y Métodos
in silico
análisis de uORFs putativos en el 5'UTR de α3, α4, α5, α7, y SS3 subunidades de nAChR
5'UTRs de
CHRNA3, CHRNA4
isoforma 1 y 2,
CHRNA5, CHRNA7
y
CHRNB3
(que codifica subunidades de nAChR α3, α4, α5, α7 y ES3) fueron seleccionados para el arranque dentro del marco y codones de terminación corriente arriba del codón de inicio principal con el Finder StarORF (http://star.mit.edu/orf/runapp .html). SNPs validados por SNP vista gen de NCBI y situadas en la secuencia uORF o la creación /eliminación de un uORF se consideraron para la investigación (Fig. 1).
'UTRs de los genes de las subunidades de nAChR de dependencia de la nicotina asociada con uORFs putativos. La posición pb para cada uORF (arranque /parada) se representa a partir del codón de inicio principal en 5 'dirección.
CHRNA4
isoforma 1 y 2 isoforma difieren en su región codificante, con una iniciación de la traducción aguas abajo más de isoforma 2, que se alarga su 5'UTR.
CHRNA4
isoforma 2 no se publicó hasta 2012 y no se ha analizado funcionalmente antes. Plazas, uORFs; flechas, SNPs
Construcción de plásmidos
La luciferasa de luciérnaga vector pGL4.10 (AY738222.1) y Renilla luciferasa pGL4.74 vector (AY738230.1) se adquirieron de Promega (Mannheim, Alemania). La secuencia TK-Promotor fue cortada pGL4.74 con KpnI y XhoI (Fermentas, St. Leon-Rot, Alemania) después de generar un sitio de restricción XhoI en la posición 783 pb utilizando GeneArt sistema de mutagénesis dirigida al sitio (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania ). Después de la digestión KpnI y XhoI de pGL4.10, la secuencia TK-promotor se ligó en el sitio de clonación múltiple de pGL4.10 aguas arriba de la secuencia codificante de la luciferasa de luciérnaga. Los insertos 5'UTR del RnAC subunidades α4 isoforma 1 y 2, α5 y ß3 fueron sintetizados (MWG Eurofins, Ebersberg, Alemania) y se clonó en pGL4.10 con XhoI y NcoI (Fermentas, St. Leon-Rot, Alemania) directamente entre el TK-promotor y la secuencia codificante de la luciferasa de luciérnaga. Después de clonar los insertos se confirmaron por secuenciación. Para crear las construcciones que carecen de una cierta uORF, el ATG de la uORF fue mutado a TTG. Del mismo modo, los alelos de SNP dentro uORFs se intercambiaron por mutagénesis dirigida al sitio. Para
CHRNA4
isoforma 1 (NM_000744.6), que alberga una supuesta uORF, se crearon dos construcciones: una con el ARNm de tipo salvaje (
CHRNA4
-iso1-1) y uno con el uORF mutado codón de inicio (
CHRNA4
-iso1-2). Para una prueba posterior (ver resultados), se crearon dos constructos más: una en la que el codón de parada de la uORF se mutó (TAG a TAC), pero la luciérnaga codón de iniciación se mantuvo intacta (
CHRNA4
-iso1- 3), y uno que carece tanto el codón de terminación de la uORF y el codón de luciérnaga de inicio (ATG a TTG) (
CHRNA4-
iso1-4)
.
CHRNA4
isoforma 2 (NM_001256573.1), que posee cinco uORFs putativos, se crearon seis construcciones: una con el ARNm de tipo salvaje (
CHRNA4
-iso2-uORF1-5) y cinco construcciones en las que cada uno de los cinco uORFs se apagó, numerados de modo correspondiente, comenzando por el más uORF 5 'situada (
CHRNA4
-iso2-uORF1;
CHRNA4
-iso2-uORF2;
CHRNA4
-iso2 -uORF3;
CHRNA4
-iso2-uORF4;.
CHRNA4
-iso2-uORF5)
En
CHRNA5 gratis (NM_000745.3), que alberga uno putativa uORF que contiene un SNP, se crearon cuatro construcciones: una con el alelo guanina e intacto /desconectado uORF (
CHRNA5
-1;
CHRNA5
-2) y otro con la adenina alelo e intacto /desconectado uORF (
CHRNA5
-3;
CHRNA5
-4). Para una prueba posterior (ver resultados), se crearon dos constructos más: una en la que el codón de parada de la uORF se mutó (TAG a TAC), pero la luciérnaga codón de iniciación se mantuvo intacta (
CHRNA5
-5) , y uno que carece tanto el codón de terminación de la uORF y el codón de luciérnaga de inicio (ATG a TTG) (
CHRNA
56).
En
CHRNB3 gratis (NM_000749.3 ), que alberga un uORF putativo y un SNP con el principal adenina alelo crear un uORF codón de inicio, se utilizaron tres construcciones: una con intacta uORF codón de inicio generado por la adenina SNP alelo (
CHRNB3
-1); uno con el menor guanina alelo SNP la supresión de la primera uORF codón de inicio (
CHRNB3
-2) lo que conduce a un uORF truncado y tercera constructo con la guanina alelo SNP en el que se cambia el codón de inicio de la truncada uORF apagado (
CHRNB3
-3). Una visión general de las construcciones utilizadas en nuestros experimentos se muestra en la Tabla 1.
Cultivo de células
Las células de riñón embrionario humano (HEK) 293 fueron adquiridos de servicio de las líneas celulares (CLS, Eppelheim, Alemania). El cultivo de las células se realizó en matraces T75 en monocapa con DMEM (Sigma-Aldrich, Hamburgo, Alemania) que contenía 4,5 g de glucosa, 10% de FBS, 1% de L-glutamina y 1% de penicilina /estreptomicina (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). Las células se mantuvieron en una atmósfera humidificada a 37 ° C y 5% de CO
2.
HEK 293 células fueron co-transfectadas con el plásmido informador pGl4.10 + CT contiene la 5'UTR de α4 isoforma 1 y 2, α5 y ß3, respectivamente, y el plásmido de control pGL4.74 en una relación de 20:01 utilizando TransIT ®-LT1 reactivo de transfección (MoBiTec, Göttingen, Alemania) con 24 h de la transfección antes de ensayo de luciferasa y qPCR, respectivamente .
luciferasa ensayo de células
HEK293 fueron sembradas 24 h antes de la transfección con 3 × 10
5 células en placas de 24 pocillos (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania). Las actividades de luciferasa de luciérnaga y Renilla se midieron con el TriStar LB941 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemania) por el sistema de ensayo de luciferasa Dual-Glow® (Promega, Mannheim, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se determinó la relación de actividad de la luciferasa y luciferasa de Renilla luciérnaga y normalizado a pGL4.10 + conocimientos tradicionales. Las diversas construcciones 5'UTR se expresan como factor de cambio para pGL4.10 + conocimientos tradicionales.
Todos los experimentos se repitieron tres veces de forma independiente con muestras por triplicado. Se utilizó una prueba t de dos colas para comparar los valores de las muestras de ensayo y las muestras de control. Un
p valor Red de
p Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Todos los datos se expresan como factor de cambio y como media ± SEM.
qPCR
Cuantitativo en tiempo real PCR se realizó en caso de ensayo de luciferasa mostró resultados significativos. Se llevó a cabo la co-transfección con los diversos constructos tal como se describe anteriormente. El ARN se extrajo usando un kit Qiagen RNAeasy, incluyendo el tratamiento de DNasa de 10 min, de acuerdo con el protocolo del fabricante (Qiagen, Hilden, Alemania). la síntesis de ADNc de primera cadena se llevó a cabo usando 1 g de ARN total a partir de cada transfección como material de partida (kit de síntesis de cDNA iScript ™, Bio-Rad, Munich, Alemania). PCR en tiempo real se llevó a cabo la orientación de luciferasa de luciérnaga (objetivo) y luciferasa de Renilla (control) secuencia de codificación utilizando los siguientes cebadores de luciérnaga-fwd 5 'TGCAACACCCCAACATCTTC-3' y 5'-REV luciérnaga CCTTTAGGCACCTCGTCCAC-3 '; Renilla-fwd AATGGCTCATATCGCCTCCT-5'-3 'y 5' Renilla-rev-CACGACACTCTCAGCATGGA-3 '. eficiencia de amplificación y la prueba de linealidad (coeficiente de correlación R
2) se evaluaron para cada par de cebadores (Fig. S1). Las reacciones se llevaron a cabo en volúmenes de 20 l que contenía 10 l SsoFast
TM EvaGreen
® Supermix (Bio-Rad, Munich, Alemania), 125 nM de cada cebador, 7 l de agua de calidad de biología molecular y 1 l de cada plantilla después de la síntesis de ADNc. El ciclo térmico consistió en desnaturalización (98 ° C durante 5 s), hibridación y extensión (60 ° C durante Renilla; 62 ° C durante luciérnaga durante 5 s), realizado en 50 pasos del ciclo en el ciclador Mini Opticon CFD-3120 (Bio- Rad, Munich, Alemania). Melting análisis de la curva varió de 65 ° C a 95 ° C con 0,5 ° C intervalos. Todos los experimentos se repitieron tres veces independientemente con muestras de técnicas triplicado. Se utilizó una prueba t de dos colas para comparar los valores de las muestras objetivo y las muestras de control. Un
p
valor de
p
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
CHRNA3
y
CHRNA7
in silico
análisis mostró que ni el 5'UTR de
CHRNA3
isoforma 1 (NM_000743.4) y la isoforma 2 (NM_ 001166694,1), ni de
CHRNA7
isoforma 1 (NM_000746.5) y la isoforma 2 (NM_001190455.2) contiene uORFs putativo (Fig. 1). Por lo tanto, estos dos genes del subtipo no se incluyeron en el estudio.
CHRNA4
isoforma 1 5'UTR alberga una uORF funcional
Dos diferentes
CHRNA4
existen variantes de ARNm. Isoforma 1 (NM_000744.6) presenta una longitud de 231 nt 5'UTR mientras isoforma 2 (NM_001256573.1) se caracteriza por una 5'UTR más largo (690 nt), debido a la codificación de las diferencias de la región que dan lugar a un inicio de la traducción aguas abajo más lejos. En el 5'UTR de
CHRNA4
isoforma 1 uORF uno putativa de 60 nt de longitud podría estar situado
in silico gratis (Fig. 1). Su codón de inicio está rodeada por una secuencia adecuada de consenso de Kozak (debido a la guanina en la posición -3). Las construcciones
CHRNA4
-iso1-1 y
CHRNA4
-iso1-2 se ensayaron mediante el ensayo de luciferasa (Tabla 1 y S1). Los resultados revelaron que la desconexión de la uORF aumentado significativamente
CHRNA4
expresión de la proteína -iso1-1 por 4,8 veces (
CHRNA4
-iso1-1 0,6 ± 0,09;
CHRNA4 CD - iso1-2 2,9 ± 0,43;
p = 0,013
) (figura 2A)
a: ensayo de la luciferasa de
CHRNA4
isoforma 1 5'UTR resultó en un aumento significativo.. en la expresión de la proteína cuando se desconecta el uORF. Doblar el cambio de la actividad de la luciérnaga se normalizó a pGl4.10 + conocimientos tradicionales, se ilustra por las tres construcciones diferentes; 1, pGl4.10 + conocimientos tradicionales; 2,
CHRNA4
-iso1-1; 3,
CHRNA4
-iso1-2. B: El uORF ATG
CHRNA4
-iso1 es capaz de iniciar la traducción, lo que resulta en una proteína de luciérnaga alargada. Doblar el cambio de la actividad de la luciérnaga se normalizó a pGl4.10 + conocimientos tradicionales, se ilustra para los cinco constructos diferentes; 1, pGl4.10 + conocimientos tradicionales; 2, pGl4.10; 3,
CHRNA4
-iso1-2; 4,
CHRNA4
-iso1-3; 5,
CHRNA4
-iso1-4. C: qPCR relativa de
CHRNA4-ISO 1
5'UTR no mostró diferencias significativas de la cantidad de ARNm al comparar intacto con uORF eliminado. Doble cambio de ARNm de luciérnaga se normalizó a pGl4.10 + conocimientos tradicionales, se ilustra por las tres construcciones diferentes; 1, pGl4.10 + conocimientos tradicionales; 2,
CHRNA4
-iso1-1; 3,
CHRNA4
-iso1-2. D: Ninguno de los cinco uORFs de
CHRNA4
-iso2 5'UTR mostró resultados significativos. Doblar el cambio de la actividad de la luciérnaga se normalizó a pGl4.10 + conocimientos tradicionales, se ilustra para los siete constructos diferentes; 1, pGl4.10 + conocimientos tradicionales; 2,
CHRNA4
-iso2-uORF1-5; 3,
CHRNA4
-iso2-uORF1; 4,
CHRNA4
-iso2-uORF2; 5,
CHRNA4
-iso2-uORF3; 6,
CHRNA4
-iso2-uORF4; 7,
CHRNA4
-iso2-uORF5. Las barras de error representan ± SEM de 3 réplicas biológicas. Los asteriscos indican diferencias significativas (
p Hotel & lt; 0,05).
Algunos, pero no todos los uORFs se traducen en proteínas. En un siguiente paso que, por tanto, examinamos si el codón de iniciación ATG de la
CHRNA4-
iso1-1 uORF es capaz de iniciar la traducción de proteínas, lo que sería un requisito previo para la traducción de la propia uORF. Un uORF traducida con un codón de parada mutado, clonado en marco con la luciérnaga ORF debe conducir a la síntesis de una proteína de la luciérnaga alargada. Las dos construcciones
CHRNA4-
iso1-3 y
CHRNA4-
iso1-4 se compararon con
CHRNA4
-iso1-2. El uORF se estableció en marco con la luciérnaga ORF para las 3 construcciones. Los resultados no mostraron ni una diferencia significativa en la expresión de la proteína cambia entre
CHRNA4
-iso1-2 y
CHRNA4-
iso1-3 ni entre los
CHRNA4
-iso1-2 y
CHRNA4-
iso1-4 (
CHRNA4
-iso1-2 1,47 ± 0,59;
CHRNA4
-iso1-3 0,94 ± 0,25;
p = 0,542
;
CHRNA4
-iso1-2 1,47 ± 0,59;
CHRNA4
-iso1-4 0,83 ± 0,26;
p = 0,471
). Comparación de los
CHRNA4
-iso1-4 con el vector control pGL4.10 reveló un aumento en la expresión de la proteína que no alcanzó significación estadística (
CHRNA4
-iso1-4 0,83 ± 0,26; pGL4.10 0,03 ± 0,01;..
p = 0,067
) (figura 2B)
para analizar si los resultados del ensayo de luciferasa se debieron a una transcripción o un efecto de traslación, se realizó real para la cuantificación relativa PCR-tiempo (qPCR). Al comparar la cantidad de ARNm de las células transfectadas con las construcciones
CHRNA4
-iso1-1 y
CHRNA4
-iso1-2 no se observaron cambios significativos entre intacta y se eliminan uORF (
CHRNA4
-iso1-1 1,23 ± 0,29;
CHRNA4
-iso1-2 1,05 ± 0,22;..
p = 0,702
) (figura 2C)
El 5 'UTR de
CHRNA4
isoforma 2 contiene cinco uORFs putativos que van de 18 a 60 nt de longitud (Fig. 1). La construcción con sólo uORFs intactas se comparó con construcciones en las que cada uno de los cinco uORFs se apagó (Tabla 1 y S1). Los resultados no mostraron diferencias significativas con respecto intacta frente uORF desconectado. Esto es particularmente cierto para el 'uORF más 5 que está presente tanto en
CHRNA4
isoformas. Este uORF parecía ser funcional en la isoforma con la 5'UTR más corta (véase más arriba) pero no causó cambios en la expresión de la proteína cuando se apaga en la isoforma con la 5'UTR más largo (Fig. 2D). (
CHRNA4
-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02;
CHRNA4
-iso2-uORF1 0,13 ± 0,02;
p = 0,644
;
CHRNA4
-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02;
CHRNA4
-iso2-uORF2 0,14 ± 0,03;
p = 0,607
;
CHRNA4
-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02;
CHRNA4
-iso2-uORF3 0,14 ± 0,02;
p = 0,427
;
CHRNA4
-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02;
CHRNA4
-iso2-uORF4 0,15 ± 0,03;
p = 0,514
;
CHRNA4
-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02;
CHRNA4
-iso2-uORF5 0,12 ± 0,02 ;.
p = 0,926
)
Cuando se comparan las dos isoformas de tipo salvaje
CHRNA4
-iso1-1 y
CHRNA4
-iso2-uORF1-5, los resultados mostraron que la expresión de la proteína de este último uno se redujo significativamente (
CHRNA4
-iso1-1 0,6 ± 0,09;
CHRNA4
-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02;
p = 0,014
).
CHRNA5
5'UTR contiene una uORF post-transcripcional funcional
CHRNA5
5'UTR (NM_000745. 3) se encontró que era albergar uno putativo uORF de 30 nt de longitud (Fig. 1). Dentro de este uORF el rs56182392 SNP con la guanina ancestral alelo (alelo frecuencia 99,4%) y los resultados alelo adenina raras en un intercambio de aminoácidos de alanina a treonina cuando se traduce
.
Para analizar la
CHRNA5
uORF y su SNP en el nivel de proteínas que hemos probado nuestros constructos mediante ensayos de luciferasa (Tabla 1 y S1). Las construcciones
CHRNA5
-2 y
CHRNA5
-4 dado lugar a un aumento de proteínas del 50%, respectivamente 65%, en comparación con
CHRNA5
-1, respectivamente,
CHRNA5
-3 (
CHRNA5
-1 0,76 ± 0,03;
CHRNA5
-2 1.15 ± 0.06;
p = 0,009
;
CHRNA5
-3 0,63 ± 0,08;
CHRNA5
-4 1,04 ± 0,03;
p
= 0,006). Por consiguiente, en ambos casos las construcciones que carecen de la uORF producen significativamente más proteína que los constructos correspondientes con uORFs intactas. Al comparar los dos alelos de rs56182392 (construcciones
CHRNA5
-1 y
CHRNA5
-3) los cambios en las proteínas registrados no fueron significativas (Fig. 3A).
'UTR alberga una uORF funcional;
CHRNB3
uORFs no están involucrados en el control de la traducción. A: Ensayo de la luciferasa de
CHRNA5
5'UTR resultó en un aumento significativo en la expresión de la proteína cuando se desconecta el uORF. Doblar el cambio de la actividad de la luciérnaga se normalizó a pGl4.10 + conocimientos tradicionales, se ilustra para los cinco constructos diferentes; 1, pGl4.10 + conocimientos tradicionales; 2,
CHRNA5
-1; 3,
CHRNA5
-2; 4,
CHRNA5
-3; 5,
CHRNA5
-4. B: El uORF codón de inicio de
CHRNA5
no iniciar la traducción tan eficientemente como el codón de inicio de la luciérnaga. Doblar el cambio de la actividad de la luciérnaga se normalizó a pGl4.10 + conocimientos tradicionales, se ilustra para los cinco constructos diferentes; 1, pGl4.10 + conocimientos tradicionales; 2, pGL4.10; 3,
CHRNA5
-2; 4,
CHRNA5
-5; 5,
CHRNA5
-6. C: qPCR relativa de
CHRNA5
5'UTR no mostró diferencias significativas de la cantidad de ARNm al comparar intacto con uORF eliminado. Sin embargo, se evaluaron diferencias significativas para la transcripción de las dos variantes de los alelos de SNP. Doble cambio de ARNm de luciérnaga se normalizó a pGl4.10 + conocimientos tradicionales, se ilustra para los cinco constructos diferentes; 1, pGl4.10 + conocimientos tradicionales; 2,
CHRNA5
-1; 3,
CHRNA5
-2; 4,
CHRNA5
-3; 5,
CHRNA5
-4. D: Ensayo de la luciferasa de
CHRNB3
5'UTR no mostró resultados significativos. Doblar el cambio de la actividad de la luciérnaga se normalizó a pGl4.10 + conocimientos tradicionales, se ilustra por las cuatro construcciones diferentes; 1, pGl4.10 + conocimientos tradicionales; 2,
CHRNB3
-1; 3,
CHRNB3
-2; 4,
CHRNB3
-3. Las barras de error representan ± SEM de 3 réplicas biológicas. Los asteriscos indican diferencias significativas (
p Hotel & lt; 0,05).
Una vez más, para evaluar si el codón de iniciación ATG de la
CHRNA5
uORF es capaz de iniciar la proteína traducción, las dos construcciones
CHRNA5
-5 y
CHRNA5
-6 fueron comparados con
CHRNA5
-2. El uORF se estableció en marco con la luciérnaga ORF para las 3 construcciones. Los resultados revelaron que mientras el codón de inicio de la luciérnaga estaba intacta la proteína luciferasa fue altamente expresado (
CHRNA5
-2 1,31 ± 0,30;
CHRNA5
-5 1,55 ± 0,46;
p
= 0,736). Sin embargo, la expresión de proteínas se redujo en más del 90% cuando únicamente el ATG del uORF estaba presente (
CHRNA5
-2 1,31 ± 0,30;
CHRNA5
-6 0,08 ± 0,01;
p
= 0,029). Comparación de los
CHRNA5
-6 pGL4.10 con el control de vectores no mostró diferencias significativas (
CHRNA5
-6 0,08 ± 0,01; pGL4.10 0.03 ± 0.01;
p
= 0,069) (Fig. 3B).
a continuación, realizamos relativa qPCR para descartar un efecto sobre el nivel de ARN como causa de nuestros hallazgos. Al comparar la cantidad de ARNm de las células transfectadas con las construcciones respectivas (
CHRNA5
-1;
CHRNA5
-2;
CHRNA5
-3;
CHRNA5
-4) mediante qPCR relativa no se observaron cambios significativos entre intacta y se eliminan uORF (
CHRNA5
-1 0,98 ± 0,01;
CHRNA5
-2 0,97 ± 0,01;
p
= 0,369;
CHRNA5
-3 1,05 ± 0,01;
CHRNA5
-4 1,10 ± 0,05;
p = 0,459
) (figura 3C).. Por lo tanto, la uORF no cuantitativamente altera el nivel de ARNm. Construir
CHRNA5
-3 contiene el raro alelo A del rs56182392 produjo significativamente más transcripciones de luciferasa de luciérnaga que
CHRNA5
-1 (
CHRNA5
-1 0,98 ± 0,01;
CHRNA5
-3 1,05 ± 0,01;
p = 0,011
). Sin embargo, no se observaron diferencias significativas entre los dos alelos en el nivel de proteína y por lo tanto es poco probable que rs56182392 tiene un impacto importante en
CHRNA5
función.
CHRNB3
uORF hace no influir en la expresión de proteínas
El 5'UTR de esta subunidad (NM_000749.3) contiene una sola uORF putativo. Se alberga un SNP (rs4950 adenina /guanina) con la guanina alelo menor supresión de la primera codón de inicio ATG del putativo uORF, creando un truncado, putativo uORF (Fig. 1). Las tres construcciones (
CHRNB3
-1;
CHRNB3
-2;
CHRNB3
-3) se compararon entre sí mediante un ensayo de luciferasa (Tabla 1 y S1). No se observaron diferencias significativas entre las tres variantes diferentes (
CHRNB3
-1 0,83 ± 0,17;
CHRNB3
-2 0,75 ± 0,02;
p = 0,495
;
CHRNB3
-1 0,83 ± 0,17;
CHRNB3
-3 0,92 ± 0,19;
p = 0,778
;
CHRNB3
-2 0,75 ± 0,02;
CHRNB3
-3 0,92 ± 0,19;
p = 0,726
). Por lo tanto, nuestros resultados indican que ni el uORF ya ni la versión truncada uORF juegan un papel en la regulación de la traducción de proteínas (Fig. 3D).
Discusión
Los datos presentados aquí sugieren fuertemente que uORFs dentro de la 5'UTR de
CHRNA4
-iso1 y
CHRNA5 ¿Cuáles son importantes reguladores de la traducción de proteínas. Además, indican que los dos conocido
CHRNA4
isoformas difieren con respecto a su efecto sobre el nivel de expresión génica. La influencia de los
CHRNA4
-UTR sobre la expresión génica fue también informado anteriormente por Briggs et al. Expresaron hurón
CHRNA4 Opiniones y
CHRNB2
junto con /o sin sus correspondientes UTRs en ovocitos. Curiosamente, exclusivamente la alta sensibilidad y ningún tipo de receptor de baja sensibilidad se detectó cuando la UTR estaba presente. Sin embargo, los elementos UTR reguladores putativos no fueron analizados en detalle en este estudio [23].
En comparación con la isoforma más corta, la expresión de luciferasa la presencia de la larga 5'UTR de
CHRNA4
redujo significativamente . Ninguno de los cinco uORFs presentes en esta isoforma mostró ningún efecto sobre la expresión génica cuando noqueado individualmente. Esto hace que sea poco probable que ellos son responsables de la reducción de los niveles de expresión de genes asociados con la más larga
CHRNA4
isoforma. No podemos excluir completamente la posibilidad de que un golpe simultáneo de los cinco uORFs habría tenido un efecto sobre la expresión de genes, sin embargo, la presencia de otros motivos de secuencias reguladoras represivas o ARN plegables acontecimientos que, o bien desestabilizan el mRNA o ralentizan la traducción parece ser al menos tan probables explicaciones.
Curiosamente, el uORF encuentra para ser funcional en el
CHRNA4
isoforma con el 5'UTR más corto también está presente en el largo 5'UTR-isoforma pero no lo hace parecen reducir la expresión génica en este último contexto de secuencia. A nuestro entender este presenta el primer ejemplo de un uORF con relevancia funcional-isoforma específica. Las razones detrás de esta observación son hasta ahora desconocido. Nuestros experimentos de elongación sugieren que el ATG de la isoforma corta es capaz de iniciar la traducción de la uORF. Sin embargo, este efecto era bastante pequeña y los resultados no fueron significativos. Por lo tanto, la traducción de la proteína uORF podría contribuir, pero es poco probable que sea la causa principal de esta observación. También es posible que la secuencia Kozak consenso adecuada [24] que abarca el codón de inicio de uORF permite el reconocimiento de ribosomas suficiente. ribosoma estancamiento Por tanto, debe considerarse como un mecanismo alternativo para los efectos observados a nivel de proteína. Sólo se puede especular por qué el mismo uORF parecía ser no funcional cuando se analizaron en el largo 5'UTR-
CHRNA4
isoforma. Una posible razón podría ser la presencia de motivos regulatorios adicionales, hasta ahora desconocidos que sólo existen en el largo 5'UTR-
CHRNA4
5'UTR y son capaces de inhibir la función uORF. Ya se ha demostrado que la función reguladora de al menos algunos uORFs puede estar estrechamente vinculado a otros motivos de secuencia 5'UTR [25]. Sin embargo, el uORF se describe en este informe anterior era sólo funcional si los motivos de reglamentación adicionales estaban presentes. El
CHRNA4
uORF discute aquí requeriría el mecanismo opuesto, es decir, un desconocido motivos represión por parte de la secuencia.
En cuanto a la única uORF de
CHRNA5
, nuestros experimentos no mostró ninguna indicación clara que el uORF codón de inicio es capaz de iniciar la traducción del gen de luciérnaga clonado aguas abajo de la misma. La explicación más probable para esta observación sería la secuencia de Kozak de baja resistencia que rodea el uORF-ATG. Esta débil motivo de secuencia es probable que reduzca la probabilidad de que los ribosomas reconoce el uORF-ATG y empezar la traducción en este sitio. Sin embargo, el hecho de que no fuimos capaces de observar una diferencia significativa en los niveles de expresión entre el vector de control y una construcción en la que el codón de inicio de uORF sirvió como sitio de iniciación de la traducción sólo funcionamiento (
CHRNA5
-6) hace no necesariamente implican que la traducción del uORF está completamente excluida como un posible mecanismo. Sin embargo, dado el efecto impresionante en la expresión de la proteína uORF mostró en presencia de su propia parada intacto codón es poco probable que este efecto fuerte dio como resultado únicamente de una traducción débil de la proteína uORF. Esto sugiere que, a diferencia de la
CHRNA4
uORF descrito anteriormente, el
CHRNA5
uORF no es parte del grupo de uORFs dependientes de la secuencia que logran sus efectos mediante la codificación de pequeñas proteínas que desempeñan un papel activo en mecanismos de control de la traducción. Por lo tanto otros mecanismos que se han tomado en consideración, incluyendo estancamiento de los ribosomas en el uORF o fugas de barrido. El mecanismo de estancamiento se produce cuando los ribosomas dejan de moverse durante la traducción uORF [26]. Sin embargo, un codón de inicio que es incapaz de conseguir una traducción suficiente también es poco probable que cause ribosoma estancamiento significativo. fugas de escaneo parece ser una explicación más plausible de los efectos observados. Este mecanismo particular se produce si el codón de inicio de la uORF está rodeada por una secuencia de marco codón de inicio pobres como presente en el uORF de
CHRNA5
. Como resultado, algunos ribosomas reconocen el codón de inicio de la uORF e inician, otros prescindir de ella e inician en el siguiente codón de inicio.