Extracto
epitelio-mesenquimal transición (EMT) se asocia con la pérdida de la molécula de adhesión célula-célula E-cadherina y la interrupción de por células uniones celulares, así como con la adquisición de propiedades migratorias incluyendo la reorganización del citoesqueleto de actina y la activación de la GTPasa RhoA. Aquí nos muestran que la despolimerización de la actina del citoesqueleto diferentes líneas celulares de cáncer metastásico con citocalasina D (Cyt D) reduce los niveles de tamaño de celda y F-actina e induce la expresión de E-cadherina, tanto en el nivel de proteína y ARNm. La inducción de la E-cadherina fue dosis dependiente y paralelo a la pérdida de los marcadores mesenquimales N-cadherina y vimentina. los niveles de E-cadherina aumentaron 2 horas después de la adición de Cyt D en células que muestran una respuesta mRNA E-cadherina, pero sólo después de 10-12 horas de HT-1080 fibrosarcoma y células MDA-MB-231 en el que el nivel de ARNm de E-cadherina fueron sólo mínimamente afectada por el tratamiento Cit Cit D. D inducida por la translocación nuclear-citoplasmática de SNAI 1 y Smad1 factores /2/3 de transcripción asociados-EMT. En las células MCF-7 de cáncer de mama no metastásico, que expresan E-cadherina y representan un modelo de células de cáncer de EMT, la despolimerización de la actina inducida con Cyt D elevada E-cadherina mientras que la estabilización de la actina con jasplacinólida redujo los niveles de E-cadherina. los niveles de E-cadherina elevados debido a Cyt D se asociaron con la activación de Rho reducida A. Expresión de Rho dominante negativo mutante Un aumento y dominante-activa Rho A mutante disminución de los niveles de cadherina E y también previno la inducción Cyt D de E-cadherina. Un reducido Rho activación de abajo de la remodelación de la actina, por tanto, induce la E-cadherina y revoca la EMT en las células cancerosas. tratamiento Cyt D inhibe la migración y, a concentraciones más altas, induce citotoxicidad de las dos células de fibrosarcoma HT-1080 y fibroblastos HS27 normales, pero sólo indujo transición mesenquimal-epitelial en las células cancerosas HT-1080. Nuestros estudios sugieren que la remodelación de la actina es un regulador de aguas arriba de la EMT en las células cancerosas metastásicas
Visto:. Shankar J, Nabi IR (2015) Reglamento de actina del citoesqueleto de células epiteliales mesenquimales transición en células de cáncer metastásico. PLoS ONE 10 (3): e0119954. doi: 10.1371 /journal.pone.0119954
Editor Académico: Jung weon Lee, Universidad Nacional de Seúl, República de Corea
Recibido: 18 Julio, 2014; Aceptado: 26 Enero 2015; Publicado: 10 Marzo, 2015
Derechos de Autor © 2015 Shankar, Nabi. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Sociedad de Investigación del cáncer (IRN), un cáncer de mama canadiense Fundación beca Postdoctoral (JS) y una donación Innovation Sociedad canadiense del cáncer del Instituto de Investigación (MR). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Ivan Nabi es un miembro del Consejo Editorial PLOS y esto no altera los autores ' la adhesión a las políticas de PLoS ONE y criterios editoriales.
Introducción
epitelio-mesenquimal transición (EMT) es un programa celular requerida durante el proceso normal de desarrollo, tales como la embriogénesis y la remodelación tisular y también en la progresión de enfermedades como el cáncer [1]. Durante este proceso, la interrupción de célula-célula y célula-matriz extracelular (ECM) adherencias comunicados de células epiteliales del tejido circundante. Las células liberadas se transforman en mesenquimales, las células migratorias con una mayor capacidad para moverse a través de la malla de ECM tridimensional. expresión localizada de factores de crecimiento tales como TGF-β y EGF induce EMT través de la activación de Wnt y Notch vías de señalización y la activación de factores de transcripción aguas abajo tales como Smad, Snail, ZEB y Twist. La expresión de proteínas de adhesión célula-célula epiteliales, tales como E-cadherina se regula hacia abajo mientras que las proteínas de adhesión célula-célula mesenquimales tales como N-cadherina, vimentina y la proteínas de la matriz extracelular fibronectina y el colágeno, son upregulated [1,2,3].
organización cortical de los filamentos de actina es una característica de las células epiteliales, mientras que las fibras de estrés de actina se encuentran en las células mesenquimales. la remodelación del citoesqueleto de actina es mediada por las GTPasas Rho y representa un mecanismo básico fundamental para la migración celular durante procesos tales como la metástasis del cáncer. Con respecto a la EMT, la activación de RhoA conduce a la remodelación del citoesqueleto de actina ROCK-dependiente y la interrupción de las adhesiones celulares basados E-cadherina [4,5,6,7,8,9]. Varias proteínas del citoesqueleto de actina asociada tales como α-actinina, la cadena ligera de la miosina, las integrinas, tropomiosinas y moesina han demostrado ser upregulated durante la EMT [3,7,10,11,12,13,14]. reguladores del citoesqueleto de actina también se identificaron como determinantes críticos de la progresión de linfoma en una pantalla de RNAi de pérdida de función de los modelos tumorales de ratón [15]. La expresión de proteínas reguladoras tales como actina Arp2 /3 y WAVE2 se correlaciona con mal pronóstico en los carcinomas de mama y de hígado de apoyo un papel para la dinámica del citoesqueleto de actina y la organización como reguladores críticos de la progresión del cáncer [16]. Un estudio reciente también ha implicado el aumento de la miosina II B de la expresión y de la cadena pesada de la miosina IIA fosforilación en el aumento de la migración de células epiteliales mamarias y la invasión en inducida por TGF-β EMT [17].
Hemos demostrado previamente que la expresión reducida de pseudopod- proteínas enriquecidas por resultado una disminución dinámica del citoesqueleto de actina y tamaño de las células que se asociaron con una inversión de EMT en seis líneas celulares de cáncer metastásico [18]. Ahora mostramos que la despolimerización del citoesqueleto de actina de las células de cáncer con citocalasina D (Cyt D) induce la translocación nuclear-citoplasma de factores de transcripción asociados-EMT, el aumento de la expresión de E-cadherina, la forma celular reducida y el tamaño y la reducción de la activación de RhoA. En células MCF-7 de cáncer de mama, la inducción de E-cadherina por despolimerización de la actina requiere la inactivación de RhoA, mientras dominante RhoA activa induce la E-cadherina. Esto sugiere que la remodelación del citoesqueleto de actina aguas arriba de la señalización de RhoA juega un papel en la EMT.
Materiales y Métodos
Los anticuerpos y reactivos
Ratón E-cadherina (# 610182) y N -cadherin anticuerpos (# 610920) eran de BD Transduction Laboratories; anti-β-actina fue de Sigma, anti-vimentina (ab11256) fue de Abcam. Smad1 /2/3 (SC-7960), SNAI 1 (SC-28199), RhoA (SC-418), c-Myc (SC-789) anticuerpos eran de Santa Cruz. anticuerpos secundarios Alexa488-, Alexa568-, y Alexa647-conjugados y rodamina y Alexa568 conjugado faloidina eran de Molecular Probes. Los reactivos para PCR en tiempo real fueron de Applied Biosystems; el kit de aislamiento de ARN era de Qiagen. La citocalasina D y jasplacinólida eran de Calbiochem (Millipore). RhoA plásmidos fueron una especie de regalo de Nathalie Lamarche (Universidad McGill). perlas de RhoA, MLB tampón de lisis y Rac1 mAb eran de Millipore (Upstate).
Cultivo celular, western blot y microscopía de inmunofluorescencia
humano MDA-231, MDA-435, DU145, HT1080, U251 , U87F-7, MCF-7 y líneas de células HS27 eran de la American Type Culture Collection. MDA-231, MDA-435, y Du145 se mantuvieron en RPMI completo 1640 y HT-1080, U251, U87, MCF-7 y las células HS27 en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10%, 100 IU /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina, 2 mmol /l de L-glutamina, y el tampón /L de HEPES 25 mmol para RPM1 y piruvato de sodio para DMEM, respectivamente, a 37 ° C en 5% de CO
2 incubadora. Para transferencias de Western, se prepararon lisados de células, concentración de proteína se determinó usando el reactivo de Bradford y cantidades iguales de proteína celular fueron cargados. Por inmunofluorescencia, las células cultivadas en cubreobjetos de vidrio fueron fijadas con paraformaldehído al 3% y el anticuerpo marcado, como se describe anteriormente [18]. Las imágenes se recogieron con × 60 × 100 o planapochromat objetivos (apertura numérica, 1.35) de un microscopio confocal Olympus FV1000.
Rho se llevó a cabo la actividad GTPasa ensayo
RhoA desplegable de acuerdo con el fabricante protocolo (Millipore) y los niveles de RhoA GTP y RhoA total fueron detectados por Western Blot utilizando RhoA anticuerpo (Santa Cruz Biotechnology). Antes del tratamiento con células Cyt D fueron transfectadas transitoriamente con RhoA plásmidos usando Effectene (Qiagen) según el protocolo del fabricante.
Ensayos
migración celular y la citotoxicidad
Aproximadamente, 3 × 10
4 HT1080 y HS27 células fueron transferidas a no recubiertos insertos de cultivo celular (migración) 8 mm (BD Falcon) en medio que contiene suero al 2%. El conjunto se colocó en placas de 24 pocillos que contenían medio completo. Las células se dejó que se unieran al filtro durante 4-6 horas y después se trataron con diferentes concentraciones de Cyt D y, como un vehículo de control, 1% de DMSO, durante 12 horas. Después de 12 horas, las células no migran se retiran de la parte superior del filtro con un hisopo de algodón y las células que migran en la parte inferior del filtro fijo y se tiñeron con 0,5% de cristal violeta, Para los ensayos de citotoxicidad, aproximadamente 7.500 células tanto para HT-1080 y Hs27 se sembraron en placas de 96 pocillos durante la noche y se trata con diferentes concentraciones de Cyt D o 1% de DMSO durante 10 horas y luego de tetrazolio soluble en agua (reactivo WST-1) se añadió a los pocillos individuales. 2 horas después de la adición del reactivo, la absorbancia se leyó a 450 nm. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
PCR en tiempo real
RNA fue aislado de cada uno de la línea celular utilizando el RNeasy mini kit Plus (Qiagen) y fue inverso-transcrito utilizando la alta Capacidad kit cDNA de transcripción inversa (Applied Biosystems). La expresión génica se cuantificó utilizando la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR) en un sistema Fast ABI 7500 con sondas Taqman de encargo para cada gen usando ensayos de expresión de genes Taqman (Applied Biosystems). Expresión relativa se determinó utilizando una curva estándar y la expresión génica normalizado a 18S rRNA abundancia.
El análisis estadístico
Se realizaron pruebas estadísticas para determinar el nivel de significación entre el control y los grupos tratados. Todos los resultados se presentan como media ± SEM de al menos tres experimentos. Dos comparaciones de grupos (control frente a tratarse o puntos de tiempo en relación con el tiempo 0) se realizaron mediante la prueba de la t de Student no apareado (. Las figuras 1, 2, 3, 4 y 5). Para múltiples comparaciones de grupos (Fig. 6), ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey se realizó para generar datos estadísticos.
(A) Du145, MDA-231, MDA-435, HT1080, U251 y células U87 chapados durante 24 h se dejaron sin tratar (control) o tratadas con 100 mM Cyt D (Cyt D tratado) durante 12 h, se fijaron y immunofluorescently etiquetados para la e-cadherina (verde) y F-actina (rojo). Escala: 10 micras. (B) Du145, MDA-MB-231, MDA-MB-435, HT-1080, las células U251 y U87 se trataron con diferentes concentraciones de Cyt D (0, 10, 50, 100, 200 M) y la media de tamaño y F contenido de actina de las células se determinó utilizando el Software Morfología Explorador Bioapplication de un Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader. **
p Hotel & gt; 0,01 y *
p Hotel & lt; 0,05; en relación con las células control (sin tratar).
(A) Du145, MDA-MB-231, MDA-MB-435, HT-1080, las células U251 y U87 se trataron durante la noche con diversas concentraciones de Cyt D (0, 10, 50, 100, 200 mM) y los lisados celulares se transfirieron para e-cadherina, N-cadherina, vimentina y β-actina. (B) PCR en tiempo real para la E-cadherina mRNA se realizó en ARN total aislado de la Du145, MDA-MB-231, MDA-MB-435, HT-1080, las células U251 y U87 tratado con diferentes concentraciones de Cyt D. Cyt D tratamiento aumentó la expresión de ARNm de e-cadherina en todas las células excepto por HT1080 y MDA-231, donde no había ninguna o mínima expresión. **,
p Hotel & lt; 0,01, *
p Hotel & lt; 0,05; en relación con las células control (sin tratar).
(A) Du145, MDA-MB-231, MDA-MB-435, HT-1080, las células U251 y U87 se trataron con Cyt D para el indicado los tiempos y los lisados celulares se transfirieron para la e-cadherina, N-cadherina, vimentina y β-actina. (B) PCR en tiempo real para la E-cadherina mRNA se realizó en ARN total aislado de la Du145, MDA-MB-231, MDA-MB-435, HT-1080, las células U251 y U87 tratado en diferente intervalo de tiempo con Cyt D . Cit tratamiento D aumento del nivel de expresión de ARNm de e-cadherina en todas las células excepto por HT1080 y MDA-231, donde no había ninguna o mínima expresión. **,
p Hotel & lt; 0,01, *
p Hotel & lt; 0,05; en relación con el tiempo 0.
(A) Du145, MDA-MB-231, MDA-MB-435, HT-1080, las células U251 y U87 eran sin tratar (control) o se trataron con 100 mM Cyt D (Cyt D tratada) durante 12 h y immunofluorescently etiquetado para Smad1 /2/3 y SNAI 1, así como Hoechst 33342 para la tinción nuclear. se muestran imágenes representativas de las células MDA-MB-231. (B) Las células se marcaron para la distribución nuclear de Smad1 /2/3 y SNAI 1 en el control y células tratadas Cyt D. Los resultados se presentan como porcentaje del total de células que muestra la distribución nuclear para estas dos proteínas. Escala: 10 micras; **,
p Hotel & lt; 0,01, *
p Hotel & lt; 0,05; en relación con el control no tratado para cada línea celular.
MCF-7 células fueron tratadas con 100 mM Cyt D durante 12 h (A) o 0-400 nM jasplacinólida (JP) para 12 h. (B) y lisados fueron borrados para E-cadherina y β-actina. (C) RhoA GTP y el nivel total de RhoA se determinaron en células MCF-7 tratadas con 100 mM Cyt D para 12 h. ***
p Hotel & gt; 0,001; relación con el control. (D) células MCF-7 fueron transfectadas con dominante negativo (DN), de tipo salvaje (WT) y dominante-activa (DA) RhoA durante 48 horas después de lo cual los lisados celulares se probaron para c-Myc, E-cadherina y β- actina. (E) sin transfectar células MCF-7 o células MCF-7 transfectadas con RhoA dominante-activa activa fueron tratados con 100 mM Cyt D durante 12 h lisados celulares y pruebas de reconocimiento de c-Myc, E-cadherina y β-actina.
células (a) HT-1080 y HS27 se trataron durante la noche con diversas concentraciones de Cyt D (0, 50, 100, 200 mM) y 1% de DMSO como un control del vehículo y los lisados celulares se transfirieron para e-cadherina , N-cadherina, vimentina y β-actina. (B) Para los ensayos de migración, las células sembradas en placas sobre insertos de células 8 micras para 4-6 horas se trataron con las concentraciones indicadas de Cyt D durante 12 horas y el número de células migrar a través del filtro se contaron. (C) Para evaluar la citotoxicidad de Cyt D, las células se sembraron durante la noche y después se trató con las concentraciones indicadas de Cyt D durante 10 horas. Reactivo WST-1 se añadió a cada pocillo y después de dos horas de absorbancia se leyó a 450 nm. *
p Hotel & gt; 0,05, **
p Hotel & gt; 0,01 y ***
p Hotel & gt; 0,001; células tratadas con DMSO en relación con las células no tratadas; Cyt D células relación con las células tratadas DMSO tratada.
Resultados
El agente de despolimerización de la actina Cyt D induce la contracción celular y MET
Hemos informado anteriormente de que la reducción del citoesqueleto de actina dinámica en el agotamiento de seudópodo enriquecidos AHNAK, Septin 9, eIF4E y s100a11 en las células cancerosas metastásicas conducido a un aumento de la expresión del marcador epitelial e-cadherina y la pérdida de marcadores mesenquimales N-cadherina y vimentina, invirtiendo esencialmente transición epitelio-mesenquimal (EMT) [ ,,,0],18]. Para determinar si la alteración de la dinámica de la actina del citoesqueleto podría afectar directamente a la EMT se trataron seis líneas celulares de cáncer humano metastásico (próstata Du145, de mama MDA-MB-231 y MBA-MB-435, U251 glioma y U87 y el fibrosarcoma HT-1080) con la despolimerización de la actina agente Cyt D. Las células expuestas a Cyt D (100 mM) durante 12 h mostraron un tamaño reducido y se tiñeron positivamente para la e-cadherina (Fig. 1A). Du145, MDA-MB-435, células HT-1080 y U87 mostró la localización de la unión de la E-cadherina mientras que las células U251 y MDA-231 presentaron una más intracelular de localización E-cadherina (Fig. 1A). El aumento de las concentraciones de Cyt D de 10 a 200 mM traducido en la reducción progresiva de las células y contenido reducido de F-actina, que se detectó por marcaje fluorescente con Alexa-568 faloidina y el análisis cuantitativo con un Cellomics ArrayScan VTI de imágenes de fluorescencia automatizado (Fig. 1B).
Mayores concentraciones de Cyt D aumento de la expresión de e-cadherina y dieron como resultado la pérdida de marcadores mesenquimales vimentina y N-cadherina en los seis líneas celulares (Fig. 2A). Se observó el efecto más pronunciado a 100 y 200 M Cyt D y fue acompañado por un aumento de E-cadherina mRNA, determinado por qPCR, en la mayoría de las líneas celulares, aunque en menor medida en las células HT-1080 y no en células MDA-MB-231 (Fig. 2B). El curso temporal de la proteína E-cadherina y la inducción de ARNm en respuesta a 100 mM Cyt D varió entre las líneas celulares. Para Du145, U251, MDA-MB-435 y, en un grado menor U87, expresión de la proteína E-cadherina se indujo en 2 h y se asocia con un aumento de E-cadherina mRNA (Fig. 3). MDA-MB-231 y las células HT-1080 mostraron poca o ninguna expresión de E-cadherina en el ARNm y la expresión de proteínas se indujo solamente después de 8 a 10 h (Fig. 3). Actina despolimerización por Cyt D, por lo tanto conduce a un aumento de la expresión de E-cadherina, tanto a nivel de proteínas ARNm con la inducción del ARNm de la E-cadherina asociado con la inducción más rápida de la proteína E-cadherina.
Smad1 /2/3 y Snai1 son factores de transcripción cuya expresión nuclear se asocia con EMT [19] y se localiza en el núcleo en las células metastásicas estudiado [18]. El tratamiento de MDA-MB-231 células con 10 mM Cyt D dio lugar a la redistribución dramática de SNAI 1 y Smad1 /2/3 al citoplasma (Fig. 4 A). se observó la redistribución Cyt D-dependiente similares de estos dos factores de transcripción EMT asociado desde el núcleo hasta el citoplasma para las seis líneas de células metastásicas estudiados (Fig. 4 B).
despolimerización de la actina regula RhoA activación
la interrupción del citoesqueleto de actina, por tanto, induce una transición epitelial en las células cancerosas metastásicas. A continuación, prueba el papel de la dinámica del citoesqueleto de actina en la EMT en epiteliales células MCF-7 de cáncer de mama no metastásico, que expresan E-cadherina y han sido bien caracterizados como modelo para la EMT en las células del cáncer de mama [20]. Como se observa para las líneas de células metastásicas, el tratamiento de células MCF-7 con los niveles de E-cadherina elevadas inducidas Cyt D (Fig. 5 A). Por el contrario, la estabilización del citoesqueleto de actina con concentraciones nanomolares de jasplaquinolida, redujo los niveles de E-cadherina (Fig. 5 B). la dinámica de actina afectando consecuentemente la expresión de E-cadherina en células MCF-7. Activado RhoA activa de EMT [4,5,9] y la inducción de E-cadherina por tratamiento Cyt D reducidos niveles de RhoA activa en células MCF-7 (Fig. 5C). En consonancia, la transfección de células MCF-7 con la expresión de E-cadherina-dominante activa RhoA activa reducida, mientras que la transfección con RhoA dominante negativo aumentó la expresión de E-cadherina (Fig. 5D). Por otra parte, en células que expresan dominante RhoA activa, Cyt D ya no impactó sobre el nivel de E-cadherina (Fig. 5 E). estado de activación de RhoA aguas abajo de la dinámica del citoesqueleto de actina es un regulador clave de la expresión de E-cadherina en estas células cancerosas.
Cyt D no induce MET en los fibroblastos normales
Para probar la especificidad de las células del cáncer de Cyt D inducción de e-cadherina, que trató las células de fibrosarcoma HT-1080 y la línea celular de fibroblastos Hs27 humano normal con diferentes concentraciones de cyt D (50, 100 y 200 m), así como con 1% de DMSO, como el control del vehículo, durante 12 horas. Como se observó antes, el tratamiento con Cyt D conduce a la inducción de E-cadherina en HT-1080 con la pérdida concomitante de N-cadherina y vimentina en 50 mM Cyt D. interesante, el tratamiento con Cyt D en Hs27 no afectó a E-cadherina, N-cadherina o expresión de vimentina lo que sugiere que Cyt D inducción de MET es específico para las células cancerosas (Fig. 6A). El tratamiento con 10 mM Cyt D redujo significativamente tanto la migración de las células HT1080 y HS27 con relación al DMSO 1%, utilizado como un vehículo de control (Fig. 6B) sugiriendo que la migración celular es más sensible a la alteración del citoesqueleto de actina. Los ensayos de citotoxicidad mostraron que Cyt D era tóxico para las células en 100 y 200 micras, pero no a las 10 y 50 micras, en comparación con 1% de DMSO (Fig. 6C).
Discusión
La actina es la organización crítica para diversos procesos celulares, tales como la motilidad celular, la división celular, el movimiento de orgánulos, la señalización celular y el establecimiento y mantenimiento de uniones de las células y la forma celular [21,22]. Durante la EMT, cambios en la organización de la actina son observados y la expresión de muchos genes reguladores de actina es upregulated [3,7,10,11,12,13,14]. Hemos informado anteriormente de que la pérdida de los componentes proteicos de la pseudópodos actina-rica de células cancerosas metastásicas altera la dinámica del citoesqueleto de actina, reduce el tamaño celular e induce la expresión de E-cadherina y MET [18]. Aquí mostramos que un agente actina despolimerización, Cyt D, reduce el tamaño y forma de la célula, inactiva RhoA e induce la expresión de E-cadherina, que define el citoesqueleto de actina como un regulador aguas arriba de EMT en las células cancerosas metastásicas. De acuerdo con estos datos, hemos informado anteriormente de que la inducción de MET a través de la pérdida de proteínas pseudopod enriquecida AHNAK, septinas-9, eIF4E, y s100a11, se asoció con la pérdida de F-actina y el aumento de la estabilidad de las fibras de actina F residuales [18] . Es importante destacar que, Cyt D no indujo MET en los fibroblastos normales que sugiere que estos efectos son específicos para las células cancerosas. Si la inducción de MET por despolimerización de la actina está específicamente relacionada con la interrupción de pseudópodos de células tumorales que queda por determinar.
interacción dominio citoplásmico de la E-cadherina con los complejos de adhesión célula-célula alfa y β-catenina que forma anclada a la citoesqueleto de actina es fundamental para el establecimiento de uniones célula-célula homotipica [23]. Se ha informado de que el tratamiento de células con concentraciones más altas de Cyt D disminuye la permeabilidad celular y estabiliza las uniones estrechas [24]. Se muestra, además, que el montaje de los cables de unión estrecha a la inducción de E-cadherina lo que sugiere que la estabilización y la formación de estas uniones a regular la E-cadherina niveles de expresión [25]. Anteriormente, también se demostró que la despolimerización de la actina con Cyt B y latrunculin A induce la expresión superficial de cadherina E y la disminución de la N-cadherina y la expresión de vimentina en βcells de rata [26]. El tratamiento con Cyt D también se ha demostrado para reducir la expresión de vimentina en células de cáncer de páncreas [27]. En nuestro estudio, el tratamiento de las células con Cyt D induce la expresión de E-cadherina en todas las seis líneas de células metastásicas y también reduce drásticamente el tamaño celular y (Figs. 1, 2) la forma. El tratamiento con Cyt D aumentó significativamente el nivel de transcripción de E-cadherina en todo menos en MDA-231 células que sugieren que la regulación del citoesqueleto de actina de los niveles de E-cadherina se produce en el mRNA y los niveles de proteína. Es importante destacar que se observó una más rápida inducción de la E-cadherina en células que también mostraron niveles elevados de E-cadherina ARNm que definen un papel crítico para la biosíntesis de novo de E-cadherina en MET. De hecho, el aumento de los niveles de Zeb2, un represor transcripcional de la E-cadherina, regula a la baja la E-cadherina, tanto a nivel de ARNm y proteínas e induce EMT [28].
Si bien se observó la inducción más robusto de MET a mayores concentraciones de Cyt D (100 y 200 mM) que se asocia con toxicidad celular 10-20%, se observó consistentemente inducción de MET a 50 mM Cyt D, que no se asoció con una toxicidad celular significativa y, en células MDA-231 , a las 10 M Cit D. la migración celular se inhibió en 10 mM Cyt D y las concentraciones más altas Cyt D que indujeron MET también se asociaron con una mayor inhibición de la migración y la reducción de los niveles de F-actina (Fig. 1B). No se observó inducción de MET en los fibroblastos normales en cualquier HS27 concentraciones Cyt D que indican que la inducción de marcadores epiteliales por despolimerización de la actina es específica de las células cancerosas. por lo tanto más la migración de la célula es muy sensible a la despolimerización de la actina de inversión de EMT lo que sugiere que estas dos respuestas celulares a base de actina son diferencialmente regulados por el citoesqueleto de actina.
la activación de RhoA puede iniciar EMT mediante la promoción de E-cadherina degradación [4 , 5,6,9,29]. Consistentemente, se observó que la activación de RhoA se asocia con niveles de E-cadherina reducidos. Sin embargo, los informes sugieren que se requiere reducción de la actividad de RhoA para EMT en el carcinoma de colon progresión [30]. En contraste con un estudio anterior que informó de la activación de RhoA por Cyt tratamiento D en Swiss 3T3 fibroblastos [31] se observó reducción de la actividad de RhoA en células MCF-7 no metastásico después del tratamiento Cyt D que fue acompañado por un aumento de la expresión de E-cadherina (Fig . 5). Las observaciones de contraste puede ser debido a las diferentes líneas celulares usadas, fibroblastos vs epiteliales células MCF-7, o las concentraciones más altas y tiempos de incubación más largos utilizados en nuestro estudio. De hecho, en su tratamiento del estudio fue de 6 h con 0.5μg /ml (con 1 m), en contraste con nuestro tratamiento durante la noche con 100 mM Cyt D, y el aumento de RhoA activada se observó durante los primeros 3 h después de lo cual solamente había una disminución de los niveles de RhoA activados. Reducción de la actividad de RhoA activa posterior de la despolimerización de la actina, por tanto, induce la expresión de E-cadherina y MET. El hecho de que Cyt D no aumenta los niveles de expresión de E-cadherina en células transfectadas con dominante RhoA activa indica que RhoA actúa aguas abajo de la remodelación de la actina para regular la expresión de cadherina E (Fig. 5) y el proceso de EMT. El tratamiento de células MCF-7 con jasplaquinolida disminución de la expresión de E-cadherina que sugiere que la polimerización de la actina y eventos depolymerizing han efectos sobre EMT opuestas. Curiosamente, Cyt efecto D parecía específica a las células cancerosas que sugieren que las pequeñas moléculas de los reguladores citoesqueleto de actina pueden ser potencialmente desarrollados como posibles agentes terapéuticos.
regulación de la dinámica de actina por agentes farmacológicos, por lo tanto puede afectar a la expresión de marcadores de EMT, la definición de la papel crítico de la dinámica de la actina en EMT y sugiriendo que la modulación farmacológica de la dinámica de actina representa un enfoque válido para apuntar EMT en el cáncer. El uso in vivo de los moduladores de actina, tales como las citocalasinas, latrunculins, jasplaquinolida y otros para el tratamiento del cáncer ha sido limitado por sus efectos secundarios demostradas y ausencia de sistema de suministro adecuado para la administración dirigida a las células tumorales [32,33]. Sin embargo recientemente se demostró que Cyt D encapsulada en liposomas PEG mejoró la solubilidad y biodisponibilidad de Cyt D e inducidos fuertes efectos contra el cáncer en modelos de ratón [34]. Identificación de otros compuestos que pueden inducir MET más específicamente puede representar enfoques alternativos para orientar el citoesqueleto de actina en el cáncer.