Extracto
cuadro
forkhead M1 (FOXM1) es un factor de transcripción proliferación asociada esencial para la progresión del ciclo celular. Numerosos estudios han documentado que FOXM1 tiene múltiples funciones en la tumorigénesis y sus niveles elevados se asocian con frecuencia con la progresión del cáncer. Aquí, que caracteriza la función de señalización /FOXM1 ERK en la mediación del potencial metastásico de las células de cáncer de ovario. Los análisis de inmunohistoquímica (IHC), inmunotransferencia y semi-cuantitativos RT-PCR se encontró que tanto fosfo-ERK y FOXM1 eran frecuentemente regulados por incremento en cánceres de ovario. Curiosamente, la sobreexpresión de fosfo-ERK (
p Hotel & lt; 0,001) y FOXM1 (
p Hotel & lt; 0,001) se correlacionaron significativamente con tumores de ovario de alto grado de conducta agresiva tales como metástasis de los ganglios linfáticos (5 de 6). Por otra parte, la expresión de fosfo-ERK y FOXM1 tenían correlación positiva significativa (
p Hotel & lt; 0,001). Funcionalmente, la expresión ectópica de FOXM1B notablemente mejorado la migración /invasión celular, mientras que FOXM1C no sólo una mayor proliferación celular, sino también promovió la migración celular /invasión. Por el contrario, la inhibición de la expresión FOXM1 por cualquiera de tioestreptona o U0126 podría deteriorar significativamente FOXM1 mediada capacidades oncogénicos. Sin embargo, la baja regulación de FOXM1 por cualquiera de tioestreptona o U0126 requiere la presencia de p53 en células de cáncer de ovario. En conjunto, nuestros datos sugieren que la sobre-expresión de FOXM1 podría provenir de la ERK constitutivamente activo que confiere las capacidades metastásicas a las células de cáncer de ovario. El deterioro del potencial metastásico de las células cancerosas por inhibidores FoxM1 subraya su valor terapéutico en tumores de ovario avanzado
Visto:. Lok GTM, Chan DW, Liu VWS, Hui WWY, Leung THY, Yao KM, et al. (2011) La activación aberrante de ERK /FOXM1 Señalización desencadenantes en cascada de la migración /invasión celular en células de cáncer de ovario. PLoS ONE 6 (8): e23790. doi: 10.1371 /journal.pone.0023790
Editor: María G. Castro, Universidad de Michigan, Estados Unidos de América
Recibido: 9 de diciembre de 2010; Aceptado: July 26, 2011; Publicado: 17 Agosto 2011
Derechos de Autor © 2011 Lok et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación Wong Cheuk Ella Beneficencia. Este apoyo es de donaciones privadas, y el sitio web de ninguna fuente de financiación está disponible. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es uno de los tumores malignos ginecológicos más letales en todo el mundo. Debido a que los síntomas no específicos, la mayoría de los casos de cáncer de ovario se presentan con enfermedad en estadio avanzado y se asocian con alta tasa de mortalidad [1]. En el cáncer de ovario avanzado, las células tumorales son altamente invasivo y la metástasis del cáncer posterior conduce a la muerte [2]. Tanto la migración celular y la invasión contribuyen la capacidad metastásica de las células tumorales y el mecanismo genético que regula la metástasis sigue siendo en gran medida desconocido. Por lo tanto, es de suma importancia para identificar mediadores moleculares que confieren el potencial metastásico de células de cáncer de ovario que pueden ser utilizados como marcadores tumorales en la predicción de riesgo de la progresión del cáncer de ovario.
Forkhead Box M1 (FOXM1) es una transcripción típica factor que pertenece a la familia Forkhead Box [3]. FOXM1 es bien conocido por su papel fundamental en la progresión del ciclo celular mediante la regulación de la transición G1 /S y G2 /M fases de transición del ciclo celular y la aplicación adecuada de la división celular mitótico [3], [4], [5]. Sin embargo, la evidencia de montaje soporta un vínculo entre la expresión aberrante de FOXM1 y carcinomas humanos, tales como el cáncer de páncreas, carcinomas de células basales, glioblastomas y el cáncer cervical [6], [7], [8], [9]. Más importante, el aumento de expresión de FOXM1 tiene notable correlación con las etapas progresivas de numerosos cánceres humanos [6], [9], [10], [11], [12]. Por lo tanto, FOXM1 no sólo promueve la tumorigénesis dotando de capacidad proliferativa y que conduce a la división celular incontrolada en el período inicial de desarrollo del cáncer sino que también mejora otros comportamientos tumorigénicas en otras etapas del desarrollo del cáncer [12], [13], [14]. Hasta la fecha, varias líneas de evidencia han demostrado que FOXM1 podría mejorar la angiogénesis en células de glioma [15], la capacidad de crecimiento independiente de anclaje en células de cáncer cervical [6], la capacidad de crecimiento del tumor de células de glioma [7] y la metástasis de las células de carcinomas hepatocelulares en ratones nude [16], lo que implica las diversas funciones de FOXM1 en la tumorigénesis. Recientemente, la Red de Investigación Atlas del Genoma del Cáncer ha utilizado un modelo gráfico probabilístico (paradigma) para demostrar que la señalización FOXM1 se asocia críticamente con serosa fisiopatología cáncer de ovario [17]. Sin embargo, el estado de expresión y los roles funcionales de FOXM1 en el cáncer de ovario, especialmente en la migración celular /invasión son en gran parte especulativa. Esto pone de relieve la necesidad urgente de delinear el mecanismo molecular que subyace a la progresión del cáncer a fin de aumentar la tasa de supervivencia de los pacientes con cáncer de ovario.
La activación constitutiva de la señalización de ERK está generalmente ligada a la transformación neoplásica como el crecimiento celular incontrolado por estimular la vía de supervivencia celular y el aumento de la motilidad celular [18], [19], [20], [21]. Estudios previos han informado que ERK actúa aguas arriba de FOXM1 y se requiere que la fosforilación de ERK por FOXM1 para la translocación núcleo y la posterior transactivación [22]. Además, FOXM1 ha demostrado ser uno de los efectores de ERK en el carcinoma hepatocelular humano y el cáncer de mama [23], [24]. Sin embargo, la función de ERK /FOXM1 cascada en la regulación de la migración celular de señalización /invasiones aún no ha sido claramente dilucidado.
En este estudio, se analizaron en primer lugar el estado de la expresión y la correlación clínico-patológica de FOXM1 en el cáncer de ovario. Varios ensayos tumorigénicas se llevaron a cabo en modelos celulares de cáncer de ovario utilizando ganancia y la pérdida de la función de FOXM1 través de la expresión forzada de FOXM1 o inhibición de FOXM1 propias a través de tioestreptona o U0126. También dimos los datos que muestran la importancia de la condición de p53 en el uso de inhibidores de FOXM1. Además, proporcionamos el primer
in vitro
pruebas de ERK /FOXM1 cascada de señalización en la promoción de la migración celular /invasión de células de cáncer de ovario. Esto le confiere un objetivo alentador en la lucha contra el cáncer de ovario avanzado.
Resultados
FOXM1 se expresa excesivamente y se correlaciona con la expresión Perk y el subtipo de alto grado del cáncer de ovario
Para estudiar se llevó a cabo la significación de la expresión de FOXM1 en el desarrollo del cáncer de ovario, el análisis de IHC en una matriz de tejido comercial de 97 muestras de tejido de ovario, incluyendo 2 normales, 2 benigna, 1 cystademoma borderline y 96 muestras de tumores malignos. La expresión de alto FOXM1 se correlacionó significativamente con tumores de alto grado (grado 3) (
P Hotel & lt; 0,001), en la que 73,33% de los tumores de grado 3 casos mostró sobreexpresión de FOXM1 mientras que el 68% de los grados 1 y 2 tumores casos mostraron una baja expresión de FOXM1 (Tabla 1). En cuanto a la subtipo de tumor, la expresión de FOXM1 fue altamente correlacionado con adenocarcinoma endometriod (
P
& lt; 0,05), en el que 74,07% de los casos demostró la sobre expresión de FOXM1 (Tabla 1). Además, 5 de cada 6 casos con metástasis en los ganglios linfáticos mostraron sobreexpresión de FOXM1 (datos no mostrados). A pesar del tamaño limitado de la muestra, que podría ser una referencia para una asociación entre FOXM1 y metástasis a distancia. Además, se detectó una correlación notable entre la sobre regulación de ambos FOXM1 y Perk (
P Hotel & lt; 0,001) (Tabla 1). Similar a FOXM1, se detectó una correlación significativa entre la expresión de pERK y tumores de alto grado (
P
& lt; 0,001), en el que 66,67% de los tumores de grado 3 mostró una alta expresión de pERK (Tabla 2). Concordante débil o muy fuerte tinción de Perk y FOXM1 también se observaron a partir cystademoma límite al grado 3 tumores, implicando la importancia de las dos proteínas en la progresión tumoral del cáncer de ovario (fig. 1A).
(A) Representante IHC mostró las inmunorreactividades de FOXM1 y perk en el límite, Grado 1, Grado 2 y Grado 3 del tumor en una matriz de tejido de cáncer de ovario (OVC1021) (x20). se observó aumento de la tinción de ambos FOXM1 y pERK junto con la progresión del cáncer que implica sus funciones potenciales en la tumorigénesis. (B) Western Blot mostró las expresiones de Perk, ERK y FOXM1 en las mangueras y líneas celulares de cáncer de ovario. (C) en tiempo real QPCR análisis reveló la expresión de las isoformas FoxM1;
FOXM1B
y
FOXM1C
en las mangueras y líneas celulares de cáncer de ovario.
FOXM1A
fue abandonado en este experimento, ya que se informó como transcripcionalmente inactiva.
Para el estudio de líneas celulares, las expresiones de Perk y FOXM1 también demostraron una buena correlación en un panel de cáncer de ovario y de líneas celulares mangueras. Ambas proteínas fueron altamente expresado en líneas de células cancerosas, especialmente en OVCAR3, SKOV3, OVCA429 y A2780cp, mientras que mostraron expresiones más bajos en las líneas celulares de la manguera (fig. 1B). Del mismo modo, en tiempo real QPCR análisis utilizando cebadores específicos según el informe anterior [12] reveló que tanto
FOXM1B
(27 a 250 veces) y
FOXM1C
(25 a 172 veces) eran hasta -regulated en líneas celulares de cáncer de ovario en comparación con las líneas celulares de la manguera (figura 1C). Este resultado fue consistente con los resultados de análisis de transferencia Western y también mostró que no había diferencia de los patrones de expresión entre dos isoformas en las células de cáncer de ovario. Colectivamente, estos datos sugieren que tanto la actividad de ERK y la expresión FOXM1 están regulados y una correlación positiva en los cánceres de ovario, especialmente en tumores agresivos de alto grado, lo que implica el intercambio de una vía común en la progresión del cáncer de ovario.
FOXM1 promueve la proliferación celular y la migración celular /invasión
Dado que los tumores de alto grado fueron altamente proliferativa y metastásicos, razonó que FOXM1 juega un cierto papel en la regulación de la motilidad celular y la invasión. Para investigar las funciones oncogénicas de FOXM1 en el cáncer de ovario, se evaluó los efectos funcionales de dos isoformas activas FoxM1, FOXM1B y FOXM1C, en A2780cp y OVCA433 células (Fig. 2A). De acuerdo con informes anteriores [14], [25], FOXM1C podría aumentar la capacidad de proliferación celular en A2780cp (
P Hotel & lt; 0,005) y OVCA433 (
P
= 0,006) de las células de cáncer de ovario, mientras FOXM1B solo mostró un aumento ligero efecto (Fig. 2A). Por otra parte, la expresión ectópica de FOXM1B y FOXM1C podría promover el cierre de heridas más rápido en A2780cp y OVCA433 células de cáncer de ovario mediante el ensayo de curación de la herida (Fig. 2B). Por transwell ensayos de migración /invasión, la introducción de FOXM1B y FOXM1C también mostró un aumento de la migración celular significativa (
P Hotel & lt; 0,05 en A2780cp y
P Hotel & lt; 0,005 en OVCA433) (Fig. 2C ) y la invasión celular (
P Hotel & lt; 0,05 en A2780cp y
P
. & lt; 0,01 en OVCA433) (figura 2D) y habilidades en A2780cp OVCA433 células en comparación con los controles de vectores. Curiosamente, FOXM1B tuvo una influencia relativamente más fuerte en la promoción de la migración celular y la invasión en comparación con FOXM1C. Tomados en conjunto, estos datos confieren que las isoformas FoxM1 podrían promover diferencialmente la proliferación celular, la migración /invasión en las células de cáncer de ovario.
ensayo de proliferación celular (A) XTT demostró que FOXM1C podría aumentar notablemente la proliferación de células de en A2780cp (*
P Hotel & lt; 0,005) y OVCA433 (**
P
= 0,006) de las células de cáncer de ovario, mientras que FOXM1B acababa de efectuar ligeramente. transferencia de Western mostró la expresión de FOXM1B (1B) y FOXM1C (1C) en A2780cp y OVCA433 células mediante el uso de anti-FOXM1 (K19). El vector vacío se utilizó como control negativo (V). (B) de la herida ensayo de curación de la herida más rápido mostró tasa de cierre de FOXM1B o FOXM1C ectópico expresar A2780cp (*
P
& lt; 0,05) y OVCA433 (**
P
& lt; 0,01) en comparación células con el control de vectores (*
P Hotel & lt; 0,05). (C) ensayo de migración Transwell y el gráfico de barras mostraron una mayor tasa migratoria en FOXM1B y FOXM1C células que expresan ectópica de A2780cp (*
P Hotel & lt; 0,05) y OVCA433 (*
P Hotel & lt; 0,005 ) en comparación con sus controles de vector (V). (D) ensayo de invasión celular Transwell y el gráfico de barras mostraron una mayor tasa de invasión a través de la membrana recubierta con Matrigel en FOXM1B y FOXM1C ectópica de las células que expresan A2780cp (*
P Hotel & lt; 0,05) y OVCA433 (*
P
& lt; 0,01) en comparación con sus controles de vector (V). Los experimentos anteriores se realizaron tres veces de forma independiente y el resultado se representó.
La inhibición efectiva de expresión FOXM1 por tioestreptona requiere p53
El tioestreptona antibiótico tiazol puede inhibir específicamente la expresión de genes en FOXM1 nivel de promotor en líneas celulares de cáncer de mama [26], y por lo tanto se utilizó para agotar la expresión de FOXM1 en células de cáncer de ovario. Tras el tratamiento tioestreptona, observamos diferentes respuestas de FOXM1 en líneas celulares de cáncer de ovario que llevan diferentes estados de p53 genotípicas: OVCA433 (p53 de tipo salvaje), A2780cp (p53 mutante) y SKOV3 (p53 borran). células OVCA433 y A2780cp mostraron una caída pronunciada de la expresión de FOXM1 en un tiempo y manera dosis-dependiente, así como un aumento de la expresión de p53 en dosis más alta (20 mM) de tioestreptona (Fig. 3A). Por otro lado, SKOV3 era resistente a la tioestreptona y expresión FOXM1 mantuvo en 10, 30 y 50 mM. Estos hallazgos sugieren que p53 puede estar implicada en el mecanismo de acción de tioestreptona. Teniendo en cuenta los papeles muy opuestos de p53 y FOXM1 en la regulación del ciclo celular y el impacto negativo de p53 en la expresión FOXM1 se muestra en los resultados anteriores de micro-array [5], [27], [28], [29], [30], nos evaluó la expresión de FOXM1 en la alteración de la expresión de p53 en células de cáncer de ovario. La transfección transitoria de p53 reduce notablemente FOXM1 no sólo en el nivel de proteína (Fig. 3B), sino también en el nivel de mRNA (Fig. 3C) en OVCA433, A2780cp y SKOV3. Estos resultados indican que p53 regula negativamente tanto los niveles de proteína de FOXM1 mRNA y p53 y es esencial para la tioestreptona para ejercer la inhibición en la expresión de FOXM1 en células de cáncer de ovario.
(A) transferencia de Western reveló la baja regulación de FOXM1 y sobre regulación de p53 en líneas celulares de cáncer de ovario; OVCA433 y A2780cp, pero no en SKOV3 tras el tratamiento de tioestreptona en diversas dosis e intervalos de tiempo. (B) Western Blot mostró que la transfección transitoria con p53 podría suprimir la expresión FOXM1 en las células de cáncer de ovario (OVCA433, A2780cp y SKOV3). (C) PCR en tiempo real indica la baja regulación de
FoxM1
transcripciones sobre la transfección transitoria de p53.
El descenso de regulación de FOXM1 perjudica la migración celular /invasión
la hipótesis de que tioestreptona puede reprimir la célula de cáncer de ovario migración /invasión mediante la inhibición de la expresión de FOXM1. Desde tioestreptona podría inducir efecto apoptótico sobre las células del cáncer [26], los ensayos XTT se realizaron tres veces para excluir el factor de reducción de la viabilidad de células que pueden afectar a la precisión de utilizar el tiempo de cierre de heridas para la evaluación de la migración celular. De hecho, la viabilidad celular de las líneas celulares anteriores no mostró cambios significativos en el tratamiento del intervalo de dosificación de 0 a 10 M tioestreptona (Fig. S1). Tras el tratamiento con tioestreptona, OVCA433 células mostraron una represión evidente de la migración celular, con ~ 50% de disminución de la velocidad de cierre de la herida en comparación con el control no tratado en el ensayo de curación de la herida (
P
& lt; 0,05). (Fig 4A ). se observó efecto inhibidor similares sobre la migración celular en las células A2780cp (datos no mostrados). Sin embargo, el tratamiento de SKOV3 no mostró influencia significativa en la célula migratoria inhibición (Fig. S2). aproximadamente 37% la migración de células Además, el tratamiento de 10 mM de tioestreptona en OVCA433 también redujo drásticamente (
P
& lt; 0,05), y la invasión de células 75% (
P
& lt; 0,05) en comparación habilidades con los controles en el ensayo de Matrigel (Fig. 4B). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que FOXM1 regula significativamente la proliferación celular y la migración de células /invasión en las células de cáncer de ovario.
(A) Wound ensayo de curación mostraron menor tasa de cierre de la herida de las células OVCA433 tiostrepton tratado en comparación con el control sin tratar (*
P Hotel & lt; 0,05). (B) Transwell ensayo de migración y el gráfico de barras mostró significativamente menor número de células migratorias a través de la membrana recubierta con Matrigel en las células OVCA433 FoxM1 empobrecida en que el control (*
P Hotel & lt; 0,05) (
superior
). Transwell ensayo de invasión celular y el gráfico de barras mostraron una menor tasa de invasión en las células OVCA433 FoxM1-agotado después del tratamiento tioestreptona, en comparación con el control (*
P Hotel & lt; 0,05) (
menor
). (C) de Western blot reveló la baja regulación de FOXM1 en líneas celulares de cáncer de ovario (OVCA433 y OV2008) tras el tratamiento con U0126 para varios intervalos de tiempo. (D) de la herida ensayo de curación demostró una menor tasa de cierre de la herida de U0126 tratados OVCA433 células en comparación con el control no tratado (*
P
& lt; 0,05). Tres experimentos independientes se realizaron y el resultado se representó.
actividad de ERK regula la migración celular mediada por FOXM1 en las células de cáncer de ovario
A medida que el estudio anterior, implicó la asociación plausible de la actividad de ERK y expresión FOXM1 (Fig. 1A y 1B), es interesante investigar el mecanismo molecular subyacente. OVCA433 y células OV2008 fueron tratados con el inhibidor de MEK U0126 y se evaluaron los niveles de pERK y FOXM1 en diferentes puntos de tiempo por análisis de transferencia Western. Se observó una notable disminución del nivel de pERK en ambas líneas celulares a los 30 minutos y se observó una reducción concomitante de la expresión FOXM1 (Fig. 4C). Además, la inhibición de la expresión FOXM1 sostenido siempre que la actividad de ERK permaneció suprimida (Fig. 4C). Desde ERK se encuentra aguas arriba de FOXM1 [23], [24], que razonó que la inhibición de la actividad de ERK deben derogar la migración celular de las células de cáncer de ovario a través FOXM1 abajo de la regulación. De hecho, usando el ensayo de curación de la herida, las células tratadas con OVCA433 U0126 mostraron un aumento significativo del tiempo de cierre de la herida (2 veces más) en comparación con el control (
P
& lt; 0,05) (Fig. 4D). Por otra parte, no hubo una reducción de la expresión de FOXM1 y la motilidad celular en las células SKOV3 (p53 suprimido) tras el tratamiento de U0126 (Fig. S3), lo que indica que se requiere la presencia de p53 para U0126 o inhibición FOXM1 tioestreptona mediada. Tomados en conjunto, estos resultados apoyan un papel esencial en la mediación de FOXM1 el efecto de ERK en la migración celular en las células de cáncer de ovario.
MMP-9 y uPAR son FoxM1 abajo objetivos que regulan la migración celular /invasión
proteasas extracelulares como metaloproteasa-9 (MMP-9) y del receptor de uroquinasa (uPAR) son marcadores a la adquisición de la capacidad metastásica [2]. Por lo tanto, se examinaron los niveles de
MMP-9 Opiniones y
uPAR
para confirmar el efecto de FOXM1 sobre la motilidad celular y la invasión. Al suprimir la expresión FOXM1 con 5 y 10 mM tioestreptona en OVCA433, los niveles tanto de
MMP-9 Opiniones y
uPAR
se redujo en aproximadamente un 20 a un 30% (Fig. 5). Por el contrario, transitoria sobreexpresión de FOXM1 aumentó
MMP-9 Opiniones y
uPAR
niveles de ~1.7 veces y aproximadamente 2,4 veces, respectivamente (Fig. 5). Estos datos sugieren que FOXM1 regula la migración celular /invasión a través de transcripcionalmente hasta la regulación de la expresión de
MMP-9 Opiniones y
uPAR
.
Semi-RT-PCR cuantitativa mostró que la inhibición de la expresión FOXM1 por tioestreptona (5 y 10 mM) en OVCA433 causó una disminución de
MMP-9 Opiniones y
uPAR
expresiones (
la izquierda), mientras que la transfección transitoria con FOXM1 plásmido de expresión (1 y 2 mg) en OVCA433 mostró un aumento de
MMP-9 Opiniones y
uPAR
expresión (
derecha). El valor numérico en cada grupo especial se refería al nivel de expresión de mRNA en relación con el control.
Discusión
En este estudio, hemos demostrado que FOXM1 era aberrante hasta reguladas en el cáncer de ovario , particularmente en alto grado subtipo. Del mismo modo, el aumento de fosfo-ERK en concomitante con FOXM1 se asoció significativamente con el cáncer de ovario de alto grado. por tanto, hemos propuesto que la sobreexpresión FOXM1 podría provenir de señalización de ERK activada constitutivamente que contribuye a la capacidad metastásica de las células cancerosas. Nuestro estudio indica que la ERK /FOXM1 cascada de señalización puede ser un objetivo prometedor para la intervención terapéutica en el cáncer de ovario.
Nosotros y otros grupos han informado anteriormente de que FOXM1 es frecuentemente desregulado en una variedad de cánceres humanos [31]. Es importante destacar que la expresión FOXM1 aumento se asoció con la progresión del tumor de los cánceres humanos [6], [9], [10], [11], [12]. Sin embargo, el papel funcional de FOXM1 en el cáncer de ovario siguen siendo en gran parte inexplorado. Aquí, hemos demostrado que los niveles de ARNm y proteínas tanto de FOXM1 fueron hasta reguladas en los tejidos de cáncer de ovario y líneas celulares. FOXM1 sobreexpresión se correlaciona significativamente con tumores de ovario de alto grado, lo que indica que FOXM1 puede desempeñar un papel oncogénico en cáncer de ovario, especialmente en el subtipo de alto grado. Por lo tanto, hemos explorado el efecto de FOXM1 en la migración celular /invasión que es un escenario tumorigénico común que se observa en los tumores agresivos de alto grado
Las dos variantes de empalme transcripcionalmente activas de FOXM1.;
FOXM1B
y
¿Cuáles son FOXM1C demostrado ser elevados en numerosos cánceres humanos. En particular, FOXM1B se demostró para promover la angiogénesis, el crecimiento tumoral de células de glioma y la metástasis de HCC en ausencia de Arf mientras FOXM1C fue encontrado para mejorar el crecimiento celular y la capacidad independiente de anclaje de células de cáncer cervical [6], [7], [15 ], [dieciséis]. Aquí, la expresión forzada de cualquiera FOXM1B o FOXM1C podría promover la proliferación celular, la migración y la invasión de células de cáncer de ovario. Aunque nuestros resultados mostraron que FOXM1C incrementa preferiblemente la proliferación celular mientras FOXM1B promovió la migración de células /invasión, la reducción simultánea de ambas isoformas FoxM1 utilizando tioestreptona llevó a efectos tanto de la proliferación celular, así como de células de migración /invasión correspondiente. El efecto de FOXM1 fue confirmado mediante el examen de las expresiones de marcadores conocidos en la migración celular /invasión,
MMP-9 Opiniones y
uPAR
, que están en línea con el papel metastásico de FOXM1 informó en otros tipos de cáncer humanos [9], [16], [32], [33]. Ya sea FOXM1 regula directamente estos marcadores u otros efectores requiere más investigación. Sin embargo, todas estas observaciones sugieren que la aberrante regulación de FOXM1 atribuye las propiedades oncogénicas en el cáncer de ovario de alto grado.
ERK es uno de un mediador crucial en el eje de señalización de Raf /ERK /MAPK mantenimiento de diversa celular función, incluyendo la proliferación celular, la apoptosis, así como la migración [34]. Anteriormente, ERK se ha demostrado que es constitutivamente activa en el cáncer de ovario y de nuestra identificación del nivel de expresión alto de pERK en el cáncer y líneas celulares de ovario de alto grado histológico indica su papel crucial en la causa de la tumorigénesis agresivo [35]. Curiosamente, se encontró que los niveles de pERK y FoxM1 se correlacionan estrechamente durante la progresión del cáncer, especialmente el cáncer de ovario de alto grado. Especulamos que la expresión elevada FOXM1 se desencadena por la activación constitutiva de ERK, lo que conduce a la motilidad celular mejorada en el cáncer de ovario. Como era de esperar, su relación se confirmó mediante la manipulación de la actividad de ERK, lo que resultó en cambios paralelos de expresión FOXM1. En otro estudio, los motivos se asemejan a la secuencia diana ERK se han encontrado en FOXM1 y la activación de la actividad de ERK fue demostrado inducir la capacidad de transactivación de FOXM1C [22]. Por lo tanto, la supresión de la actividad de ERK por U0126 reduciría la fosforilación FOXM1 que finalmente conduce a la inhibición de la expresión de FOXM1 mediante la interrupción de su propio bucle de retroalimentación positiva [36]. A pesar de que nos dio un indicio de que la transactivación de FOXM1 depende de la fosforilación de ERK en el nivel post-transcripcional, hay una falta de informes con respecto a los atributos funcionales de eje activado ERK /FOXM1 señalización en el cáncer de ovario. En el estudio de curación de heridas, de hecho, la disminución de la tasa de cierre de la herida debido a la actividad ERK inhibe y la reducción de la expresión FOXM1 tras el tratamiento U0126 sugiere fuertemente que FOXM es uno de los principales efectores de la señalización de ERK. Por otra parte, tioestreptona y U0126 suprimen la migración de células en un grado similar (40% en comparación con el 50%). Tomados en conjunto, creemos que hasta reguladas actividad de ERK y el consiguiente aumento de la expresión FOXM1 contribuyen aún más la inducción de comportamientos oncogénicos, el apoyo que ERK /FOXM1 eje de señalización facilita la migración de células de cáncer de ovario.
Los estudios previos han demostrado la efecto prometedor de tioestreptona en menoscabo de las conductas mediadas por tumorigénicas FOXM1 [26], [37], [38]. Dada la sensibilidad diferencial de FOXM1 a la baja regulación mediante tratamiento tioestreptona en líneas celulares con diferentes estados de p53, es tentador especular la importancia de p53 por la acción de tioestreptona. Basado en el hecho de que la pérdida de la función de p53 es un acontecimiento común en los tumores y FOXM1 está regulada negativamente por p53, se especuló que la pérdida de la expresión de p53 puede causar la desregulación de FOXM1 y de ese modo causar catástrofe celular e incluso cáncer. Aquí, el p53 suprime la línea celular SKOV3 no mostraron respuesta de FOXM1 a varias dosis de tioestreptona, así como inhibidor de MEK, U0126, mientras FOXM1 podría fácilmente ser suprimida en múltiples dosis en OVCA433 y A2780cp que llevan los genes de tipo salvaje y p53 mutado, respectivamente. Estudios anteriores mostraron que tioestreptona puede inducir apoptosis efecto sobre las células cancerosas mediante la estabilización de la expresión de p53 [39] y la sobre regulación de p53 en dosis mayores, puede ayudar aún más la supresión de FOXM1. Curiosamente, tioestreptona o U0126 no tenían influencia en la realización SKOV3 gen p53 eliminado, mientras que la expresión ectópica de p53 suprimió la expresión de FOXM1, tanto a nivel de ARN y proteínas, en consonancia con otros estudios [28], [30]. Esto descubre el papel necesario de p53 en la mediación del efecto supresor de tioestreptona en la expresión FOXM1. Además de perjudicar la capacidad de migración de células /invasión, otro grupo también mostró que el uso de tioestreptona también podría aumentar la apoptosis y detención proliferativa en células de cáncer humano que subraya aún más el valor terapéutico de tioestreptona [26], [37], [38], [39], [40]. En conjunto, nuestro estudio apoya que las funciones de tioestreptona por la supresión de la expresión de p53 a través de FOXM1 para aliviar la tumorigenicidad posteriormente y hasta la regulación de p53 para inducir la muerte celular.
En conclusión, nuestro estudio reveló una relación entre ERK /FOXM1 señalización eje y el comportamiento metastásico de las células de cáncer de ovario. Por otra parte, hemos descubierto un papel crítico de p53 en la mediación de la acción de tioestreptona. Por lo tanto, tanto el U0126 y tioestreptona representan puntos de partida prometedores para establecer la terapia contra el cáncer en el cáncer de ovario a través de la represión de la FOXM1.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y cultivo celular
se utilizaron cinco células epiteliales superficiales de ovario humanas inmortalizadas: HOSE10-2, HOSE11-12, HOSE17-1, HOSE20-3 y HOSE21-3 (del profesor George Tsao, la Universidad de Hong Kong). Se utilizaron nueve líneas celulares de cáncer de ovario: A2780s A2780cp, OV2008, C13 (de profesor Benjamin Tsang, La Universidad de Ottawa), OV420, OV429, OV433, OVCAR3 y SKOV3 (American Type Culture Collection, Rockville). Todas las líneas celulares se incubaron a 37 ° C en 5% de CO
2, ya sea en medio esencial mínimo o medio de Eagle modificado por Dulbecco (Gibco-BRL, Gaithersburg) con 10% de suero bovino fetal (Gibco) y 1% de penicilina-estreptomicina ( Gibco).
plásmidos y transfección
Los lentiviral plásmidos Pcdh-FOXM1B y Pcdh-FOXM1C fueron generados por subclonación FOXM1B y FOXM1C cDNAs de pcDNA3- FOXM1B y plásmidos pcDNA3-FOXM1C en Pcdh-MSCV- MCS-EF1-GFP-Puro plásmido lentiviral (SBI, Mountain View, CA), respectivamente. El plásmido pRcCMV-p53 fue del Prof. Randy YC Poon (Sección de Bioquímica y Biología Celular de la Universidad de Hong Kong de Ciencia y Tecnología, Hong Kong). LipofectAMINE ™ reactivo de transfección 2000 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) se utilizó para la transfección de células de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Los vectores vacíos Pcdh-MSCV-MCS-EF1-GFP-puro y pcDNA3.0 se utilizaron como controles negativos. Establecer FOXM1B y FOXM1C de forma estable que expresan las células, las células infectadas lentiviral fueron seleccionados por 2 mg /ml de puromicina (Sigma) durante 2 semanas y verificados por Western blot.
semi-cuantitativa (SQ-PCR) y cuantitativo ( QPCR) la transcriptasa inversa-reacción en cadena de la polimerasa
ARN total fue aislado por TRIzol (Invitrogen) según el protocolo del fabricante. El ADN complementario se sintetizó usando el kit de reactivo de la transcripción reversa (Applied Biosystems, Foster City). Posteriormente, el cDNA se utilizó para realizar la PCR utilizando cebadores específicos de genes
FOXM1B gratis (adelante, 5'-TTGCCCCCAAGGTGCTGCTA-3 'y revertir, 5'-GGAGATTGGGACGAATCCTC-3'),
FOXM1C gratis ( adelante, 5'-CACCCATCACCAGCTTGTTT3 'y revertir, 5'-GGAGATTGGGACGAATCCTC-3'),
MMP9 gratis (hacia adelante, 5'-CATCGTCATCCAGTTTGGTG e inversa, 5'-GCCTTGGAAGATGAATGGAA-3 ') y
uPAR
(adelante, 5'-GCCTTACCGAGGTTGTGTGT-3 'e inverso, 5' GGCAGATTTTCAAGCTCCAG -3 ') bajo la condición de 94 ° C (5 min), seguido de 30-35 ciclos de 95 ° C (30 segundos), 57 ° C (30 segundos) y 72 ° C (30 segundos), y finalmente 72 ° C (10 min) y 4 ° C. La cantidad relativa de genes se normalizó en contra GAPDH ARNm.
Q-PCR se realizó mediante ensayos de expresión génica y TaqMan ensayo Expresión Génica SYBR Green. Para validar la expresión de
FoxM1
isoformas, cebadores específicos dirigidos contra la
FOXM1B
y
FOXM1C
fueron diseñados de acuerdo a Kalin
et al
[11] y adquirido de Applied Biosystems. Para examinar la expresión de p53, las sondas TaqMan específicas (Applied Biosystems) incluyen en la mezcla de PCR fueron sometidos a PCR bajo la condición de 95 ° C durante 2 minutos, 40 ° C Ciclos de a 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 1 minuto. La cantidad relativa de ARN en cada muestra se determinó por el método de CT comparativo con el software 7500 Sistema de SDS (versión 1.3.1), de la que se comparó la diferencia de plegado para el control interno
18S
y
TBP
y la diferencia veces en relación se normalizó al calibrador. El nivel relativo de expresión de gen diana se interpretó como la diferencia veces al control endógeno.
transferencia de Western e inmunohistoquímica (IHC) se analizan los
proteína total se preparó mediante la adición de una cantidad adecuada de tampón de lisis 1x al sedimento celular.