Extracto
Estudios previos mostraron que la diabetes mellitus tipo 2 (DM2) está vinculada a un mayor riesgo de desarrollar cáncer de colon. La insulina y la insulina factor de crecimiento similar 1 (IGF-1) se incrementan en pacientes con DM2. El aumento de la insulina y el IGF-1 pueden ser responsables para el desarrollo de cáncer de colon. En este estudio, hemos investigado los efectos y mecanismos de la insulina y el IGF-1 en el desarrollo del cáncer de colon
in vitro
y
in vivo
. La insulina y el IGF-1 solo o junto elevados proliferación y la reducción de la apoptosis en células de cáncer de colon MC38. Mientras tanto, la insulina y el IGF-1 promueve la fosforilación de extracelular-quinasa regulada señal media (ERK1 /2) y c-Jun N-terminal quinasa (JNK). El tratamiento con ERK1 /2 o inhibidor de JNK en presencia de insulina y IGF-1 disminuyó significativamente linfoma de células B 2 (Bcl-2) y el aumento de la proteína X asociada a Bcl-2 expresión (Bax) y, finalmente, aumento de la apoptosis y se inhibe la proliferación . el crecimiento del tumor de colon de aceleración se encontró en un modelo de ratón de la DM2 con
db /db
ratones que tiene alto nivel de insulina endógena y de IGF-1. Además, la inhibición de ERK1 /2 o JNK suprime el desarrollo de tumor de colon
in vivo
. Estos resultados sugieren que la activación de ERK1 /2 y JNK señalización de la insulina y el IGF-1, al menos en parte, es responsable del desarrollo de cáncer de colon con DM2
Visto:. Teng JA, Wu SG, Chen JX, Li Q, F Peng, Zhu Z, et al. (2016) La activación de ERK1 /2 y JNK MAPK señalización de insulina /IGF-1 es responsable para el desarrollo de cáncer de colon con diabetes mellitus tipo 2. PLoS ONE 11 (2): e0149822. doi: 10.1371 /journal.pone.0149822
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos |
Recibido: Abril 27, 2015; Aceptado: 4 Febrero de 2016; Publicado: 22 Febrero 2016
Derechos de Autor © 2016 Teng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio es apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81160107, JAT), Guangxi Investigación de Ciencia y Técnica de la Fundación para el Desarrollo del plan (No. 1104003B-69, JQ), y la Fundación de Ciencias Naturales de Guangxi (núm 2010GXNSFB013083, JAT). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
en las últimas décadas, debido al rápido crecimiento económico y los cambios en el estilo de vida en china, la incidencia y los casos de diabetes han aumentado rápidamente. En China, la prevalencia de la diabetes fue de 9,7%, lo que representa 92,4 millones de personas que viven con diabetes, especialmente diabetes mellitus tipo 2 (DM2) [1]. DM2 se asocia con una mayor incidencia de mortalidad por cáncer [2, 3]. En particular, el riesgo de cáncer de mama [4], páncreas [5], el hígado [6] y el colon [7, 8] El cáncer se incrementa en los pacientes con DM2. DM2 aumenta el riesgo de cáncer de colon hasta en tres veces que la población general, lo que hace que el cáncer de colon uno de los cánceres más comunes en los pacientes con DM2 [9].
Los mecanismos que subyacen a la conexión de la DM2 con cáncer de colon son complicados y aún no dilucidado completamente. DM2 se asocia con hiperinsulinemia y elevado factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1). La insulina, un importante factor de crecimiento que actúa como un mitógeno de células, cuando en altas concentraciones aumentar el riesgo de cáncer de colon en la promoción del crecimiento de tumores [10]. Y el tratamiento con insulina puede elevar aún más el riesgo de cáncer de colon en pacientes con DM2 [11]. La insulina estimula la proliferación celular mediante la unión a los receptores de insulina o 1-IGF receptores, o por la inhibición directa de las proteínas de unión de IGF-, lo que aumenta la disponibilidad de IGF-1 al receptor de IGF [12]. La señalización de la insulina o IGF-1 se prueba como un regulador del crecimiento potente vinculado con la carcinogénesis en diferentes líneas de células [13]. Estudios anteriores mostraron una asociación entre la elevación de IGF-1 y el riesgo de cáncer de colon [14, 15]. La correlación entre la insulina o IGF-1 y los riesgos de cáncer de colon en los pacientes con DM2 se acepta ampliamente [16, 17]. señal activada por mitógenos proteína quinasa (MAPK) contiene 3 vías principales: extracelulares proteínas quinasas reguladas 1/2 (ERK1 /2), c-Jun N-terminal quinasa (JNK) y las señales de P38. Estudios anteriores demostraron que la señal de MAPK, que actúa como aguas abajo de la insulina y el IGF-1 de señalización proliferativa, juega un papel en la proliferación de varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de próstata [18-20] de mama, colon y. Sin embargo, debido a la falta de modelo de cáncer de colon ideal, con DM2, todavía no está claro cómo esta señal a regular la proliferación de cáncer de colon en un entorno de DMT2.
Este estudio tuvo como objetivo determinar el mecanismo de la insulina /IGF-1 en el crecimiento del cáncer de colon en un entorno de DMT2. Con este fin, un ratón células derivadas de células de cáncer de colon MC38-line con insulina /IGF-1 de tratamiento y un modelo DM2 espontánea ratón con aloinjertos de tumor se utilizan para imitar el entorno DM2
in vitro
y
en
vivo. La insulina /IGF-1 proliferación elevada y reducción de la apoptosis en las células MC38. Mientras tanto, los efectos de la insulina /IGF-1 en las células MC38 fueron ERK1 /2 y JNK dependiente. el crecimiento del tumor de colon de aceleración se encontró en un modelo de ratón de la DM2, que tiene alto nivel de insulina y el IGF-1. Por lo tanto, se sugiere que la activación de ERK1 /2 y JNK señalización de la insulina y el IGF-1, al menos en parte, es responsable de regular el desarrollo y la formación de cáncer de colon con DM2.
Materiales y Métodos
cultivo de células
el cáncer de colon línea celular MC38 fue derivado originalmente de C57BL /6 ratones tratados con el carcinógeno 1,2-dimetilhidracina [21], que se adquirió de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y se cultivaron en medio DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10%, 1% de glutamina y 1% de penicilina /estreptomicina. Las células se mantuvieron a 37 ° C y 5% de CO
2 en un ambiente húmedo. El medio se reemplazó cada 48 horas y se trataron con tripsina las células cuando se alcanza el 80% de confluencia. Las células se privaron de suero durante la noche y después se trató con 5 ng /ml o 50 ng /ml de concentraciones de insulina (Sigma, St. Louis, MO) y el IGF-1 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) disueltos en solución salina tamponada con fosfato (PBS). En los ensayos de ERK1 /2 o JNK inhibición, se añadieron 40 M PD98059 ERK1 /inhibidor 2 (Sigma, St. Louis, MO) o 20 mM JNK SP600125 inhibidor (Sigma, St. Louis, MO) disuelto en sulfóxido de dimetilo (DMSO) en células cultivadas.
proliferación de las células de ensayo
la proliferación celular se determinó utilizando un kit de recuento de células-8 (CCK-8) (Dojindo, Kumamoto, Japón) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, las células MC38 fueron sembradas en placas de 96 pocillos a 8000 células por pocillo. Después de la incubación durante la noche, las células se trataron con 50 ng /ml de insulina y 50 ng /ml de IGF-1 con o sin 40 mM ERK1 PD98059 /inhibidor de 2 o 20 mM JNK SP600125 inhibidor durante 24, 48 o 72 horas. A continuación, 10 l 2- (2-metoxi-4-nitrofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- (2,4-disulfofenil) -2H-tetrazolio sal monosódica (WST-8) se añadió a cada pocillo y se incubaron a 37 ° C durante otras 2 horas. Entonces, la absorción óptica a la longitud de onda de 450 nm se midió utilizando un lector de microplacas (Thermo Scientific, Waltham, MA).
análisis del ciclo celular
En
in vitro ciclo celular
análisis, las células MC38 con diferentes tratamientos para 72 horas se cosecharon y se fija con 70% de etanol enfriado en hielo durante 4 horas. A continuación, las células fijadas se incubaron con 400 l 0,5 mg /ml de yoduro de propidio (PI) durante 30 min a 4 ° C. Las células teñidas se analizaron con un FACS Calibur (BD, Franklin Lakes, NJ). La cuantificación de la fluorescencia se realizó por citometría de flujo para determinar la cinética del ciclo celular de las células MC38 en /G1-fase G0, S-fase y /M-fase G2.
apoptosis de la célula de análisis
La apoptosis tasa se evaluaron en 7
TH días de cultivo por Anexina V-FITC apoptosis Kit de Detección I (BD, San Diego, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, 1 × 10
6 células tripsinizadas se lavaron por PBS y re-suspenden en Anexina V tampón de unión. Las células se tiñeron con 5 l de FITC anexina V y PI 5 l durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Las células teñidas se analizaron mediante FACS Calibur (BD, Franklin Lakes, NJ) en 1 hora.
análisis de Western Blot
células MC38 o tejidos tumorales lisados se prepararon usando tampón de lisis que contiene proteasa y occidental inhibidores de la fosfatasa en hielo. Los extractos celulares se centrifugaron a 12.000 rpm durante 15 min a 4 ° C y se utilizó el sobrenadante para transferencia Western. La concentración de proteína se midió mediante el ensayo de Bio-Rad utilizando el protocolo del fabricante (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Veinte g de proteínas del sobrenadante se separaron en 10% SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (Millipore, Billerica, MA) durante 1 hora. Las membranas fueron bloqueadas por la leche en polvo sin grasa al 5% en solución salina tamponada con Tris que contiene 0,05% de Tween-20 durante 2 horas, seguido de incubación con anticuerpos primarios durante la noche a 4ºC. Los anticuerpos primarios de GAPDH (Cat#4695s), ERK1 /2 (Cat#5174), p-ERK1 /2 Thr202 /Tyr204 (Cat#4370), JNK (Cat#9252), p-JNK Thr183 /Tyr185 (Cat#9251), P38 (Cat#8690), p-P38 Thr180 /Tyr182 (Cat#4511) y Caspase3 (Cat#9664) eran de Señalización celular Tecnología (Beverly, MA), Bcl-2 (Cat#SC-509), Bax (Cat#sc-20067) y ciclina D1 (Cat#SC-753) eran de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). A continuación, la membrana se incubó con rábano picante de conejo o de ratón conjugado con peroxidasa de anticuerpos secundarios durante 1 hora a temperatura ambiente. Las bandas inmunorreactivas se detectaron utilizando Super Señal West Pico sustrato quimioluminiscente (Thermo Scientific, Rockford, IL).
estudios de crecimiento tumoral en el modelo de ratón de la diabetes tipo 2
Este proyecto fue aprobado por el Cuidado de Animales y el empleo del hospital Popular de la región autónoma de Guangxi, Nanning, china (# 2011-005). B6.BKS-Lepr varones
db ratones (
db /db
) y sus compañeros de camada heterocigóticos (
db /+
) fueron adquiridos de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Todos los procedimientos que se siguieron los Institutos Nacionales de Salud directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Los animales fueron alojados en una instalación libre de patógenos específicos bajo la norma 12 horas de luz /oscuridad ciclo y alimentados comida estándar de roedores y agua
ad libitum
. Ocho semanas de edad
db /db
ratones fueron utilizados como modelo de diabetes tipo 2 mientras que el
db /+
ratones como controles sanos. células MC38 se expandieron en medio DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% y 1% de penicilina /estreptomicina
in vitro
. 2 × 10
6 células MC38 en suspensión en 0,1 ml de PBS se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de cada ratón para iniciar el crecimiento del tumor. Para el
in vivo
/2 y JNK estudios de bloqueo ERK1, 10 mg /kg PD98059 o se administró 30 mg /kg SP600125 por vía intraperitoneal (ip) cada 3 días cuando el volumen del tumor alcanzó 100 mm
3 (7- 8 días después de la iniciación del tumor) y se prolongó durante otras 2 semanas. 1% de DMSO fue utilizado como tratamiento de control. Los tamaños de los tumores se midieron cada 3 días con calibradores cuando los tumores comenzaron a crecer. Cualquier una dimensión del tumor superó 20 mm o la carga tumoral era mayor que 10% del peso corporal se considera que los puntos finales de la observación. El volumen del tumor se calculó mediante la fórmula: volumen del tumor = anchura
2 × longitud x π /6 [22]. CO
2 y la dislocación cervical ratones fueron utilizados para la eutanasia. Los tumores fueron extirpados y el peso del tumor fue registrado al final de los experimentos. Una parte de los tumores de ambos grupos se utilizaron para lisado tumoral en los experimentos de Western Blot.
Las mediciones de glucosa en la sangre, la insulina y el IGF-1 |
Los ratones se mantuvieron en ayunas durante 6 horas, y la glucosa en sangre concentración se controló en la sangre venosa extraída de la vena de la cola utilizando un glucómetro (Roche, Basilea, Suiza). En el sacrificio, se recogieron muestras de sangre para medir las concentraciones séricas de insulina y IGF-1. La insulina en suero y el IGF-1 se determinaron mediante un inmunoensayo enzimático de acuerdo con el protocolo del fabricante (I + amp; D Systems, Minneapolis, MN).
El análisis estadístico
software
SPSS 17.0 (SPSS Inc. , Chicago, IL) fue utilizado para el análisis estadístico. Los resultados cuantitativos se expresan como la media ± desviación estándar (DE). El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de la t de Student entre dos grupos o de una vía ANOVA para datos de múltiples grupos. los valores & lt P;. 0,05 se consideraron significativos
Resultados
La insulina /IGF-1 promueve la proliferación de células de cáncer de colon y la progresión del ciclo celular
in vitro
estudios anteriores han demostrado que la insulina y el IGF-1 tienen efectos pro-proliferación en diferentes células del cáncer [13]. Especulamos que la insulina o IGF-1 tuvieron los mismos efectos en las células MC38, una línea celular de cáncer de colon de ratón derivada. Dado que la insulina en la sangre y los niveles de IGF-1 aumentaron en pacientes con DM2, combinación de insulina y el IGF-1 (insulina /IGF-1) también se utilizó para imitar este entorno
in vitro
. De hecho, encontramos que, o bien la insulina o IGF-1 promovió la expansión de las células MC38
in vitro gratis (figura 1A). Para determinar los efectos pro-proliferativos de la insulina y el IGF-1, se aplicó un ensayo de CCK-8 para detectar la viabilidad celular. Como era de esperar, ya sea insulina o IGF-1 promueve la proliferación de células MC38 de una manera dependiente de la dosis. Además, la combinación de la insulina y el IGF-1 mostró un efecto aditivo en la proliferación (Fig 1B).
células MC38 se cultivaron con diversas concentraciones de insulina y IGF-1 durante 72 horas. Los grupos de control se trataron con PBS. se observó (A) la morfología de la célula. (B) Las células se recogieron para el análisis de proliferación con CCK-8 ensayo. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt; 0.001 versus control,
#P & lt; 0,05;
## P & lt; 0,01 entre los dos grupos indicados, n = 3 por grupo. El análisis del ciclo (C) de la célula de las células tratadas de insulina /IGF-1. contenido de ADN se midió mediante tinción con PI en citometría de flujo. Los porcentajes de fases del ciclo celular se muestran en cada panel. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos separados.
Seguidamente se dirigió a la cuestión de si la insulina /IGF-1 promueve la progresión del ciclo celular en las células MC38. Para el análisis del ciclo celular, el contenido de ADN se midió mediante tinción con PI en citometría de flujo después de 72 horas de la insulina y el tratamiento con IGF-1. Análisis del ciclo celular mostró que la insulina /IGF-1 redujo significativamente la proporción de células MC38 en /1-fase G0, y mejoró la proporción de células MC38 en la fase S (Fig 1C). Por lo tanto, estos datos muestran que la insulina /IGF-1 promueve la proliferación de células de cáncer de colon y la progresión del ciclo celular
in vitro
.
insulina /IGF-1 inhibe las células de cáncer de colon apoptosis
in vitro
la apoptosis juega un papel importante durante el crecimiento del cáncer. Para evaluar si la insulina /IGF-1 afectó a la apoptosis de las células MC38
in vitro
, las células se cultivaron con insulina y el IGF-1 solo o ambos juntos durante 72 horas. Las células se recogieron para el análisis de apoptosis por anexina V y PI tinción en citometría de flujo. El ensayo de apoptosis mostró que la insulina y el IGF-1 solo o ambos juntos disminuyeron las células apoptóticas totales (Fig 2A y 2B). Para identificar adicionalmente la etapa de la apoptosis, la etapa temprana y células apoptóticas de última fase se midieron también. Como era de esperar, todos los tratamientos redujeron apoptosis etapa temprana y apoptosis etapa tardía, excepto IGF-1 por sí solo no podría afectar a la apoptosis etapa tardía (Fig 2A y 2C). Los resultados revelaron que la insulina /IGF-1 inhibe las células de cáncer de colon apoptosis
in vitro
.
células MC38 fueron cultivadas con insulina y el IGF-1 solo o ambos juntos durante 72 horas. Los grupos de control se trataron con PBS. Las células (A) se recogieron para el análisis de la apoptosis mediante la anexina V y PI tinción de citometría de flujo. La primera etapa (Anexina V + /PI) y la fase tardía (Anexina V + /PI +) eventos apoptóticos fueron cerrada. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos separados. La cuantificación de porcentaje total (B) y el porcentaje temprano /tardío etapa (B) de células apoptóticas después de los tratamientos. * P & lt; 0,05; ** P & lt;. 0,01 frente al control, n = 3 por grupo
La insulina /IGF-1 activa ERK1 /2 y JNK señalización de las células de cáncer de colon
in vitro
estudio anterior mostró que la señal de Ras-Raf-MAPK, que actúa como aguas abajo de insulina /IGF-1 de señalización juega un papel en la proliferación de varios tipos de cáncer [18-20]. Para determinar si la señal de Ras-Raf-MAPK involucrado en la insulina /IGF-transducción 1sinaling, detectamos las 3 principales moléculas de abajo (/2, JNK y p38 ERK1) vía de señalización Ras-Raf-MAPK. células MC38 fueron cultivadas durante 72 horas con diferentes tratamientos y se recogieron para el análisis de transferencia de western (Fig 3A). Se encontró que la insulina, IGF-1 y la insulina /IGF-1 aumentó la fosforilación de ERK1 /2 y JNK, excepto P38 (Fig 3B-3D). Además, no había efecto aditivo cuando la insulina y el IGF-1 se utilizan juntos (Fig 3B y 3C). Por lo tanto, estos datos muestran que la insulina /IGF-1 activa ERK1 /2 y JNK de señalización de las células del cáncer de colon
in vitro
.
células MC38 fueron cultivadas con insulina y el IGF-1 solo o ambos juntos durante 72 horas y después se recogió para el análisis de Western Blot. Los grupos de control se trataron con PBS. (A) análisis de transferencia de Western de p-ERK1 /2, ERK1 /2, p-JNK, JNK, p-P38 y expresión de la proteína P38 en las células tratadas. GAPDH sirvió como control de carga. Las transferencias que se muestran son representativos de tres experimentos separados. Semi-cuantificación de la expresión de ERK1 (B) /2 y pERK1 /2, (C) de JNK y p-JNK, (D) p38 y proteínas P-P38. Plegables cambios se normalizaron por grupos de control. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt;. 0.001 versus control, n = 3 por grupo
inhibición de la señalización ERK1 /2 o JNK suprime la proliferación y anti-apoptóticos efectos de la insulina /IGF-1
en vitro
A continuación evaluó si los efectos de la señal de la insulina /IGF-1 fue ERK1 /2 y JNK dependiente. células MC38 fueron tratados con insulina /IGF-1 con o sin 40 mM PD98059 ERK1 /inhibidor de 2 o 20 mM JNK SP600125 inhibidor durante 24, 48 o 72 horas. Las tasas de proliferación se midió mediante el uso de CCK-8 kit. Como se muestra en la figura 4A, el efecto proliferativo de insulina /IGF-1 fue abolida por cualquiera de PD98059 o SP600125. También se detectaron los efectos de ERK1 2 /inhibidor (figura 4B) y el inhibidor de JNK (figura 4C) en la fosforilación, la apoptosis y la proliferación de western blot. La insulina /IGF-1 combinado aumentó drásticamente la expresión de la proteína anti-apoptótica de Bcl-2, la proteína de proliferación de ciclina D1 y la disminución de la expresión de la proteína apoptótica Bax y la caspasa 3. trataron con PD98059 o SP600125 podría revertir estos efectos. Los resultados mostraron que la inhibición de la señalización de ERK1 /2 o JNK suprime la proliferación y anti-apoptóticos efectos de la insulina /IGF-1
in vitro
.
células MC38 fueron cultivadas con insulina y IGF 1 solo o ambos juntos durante 72 horas. ERK1 /2 PD98059 inhibidor de (B), SP600125 inhibidor de JNK (C) o su vehículo DMSO a los cultivos cuando las células MC38 fueron tratados con insulina y IGF-1. Las células se recogieron (A) para el análisis de proliferación con CCK-8 de ensayo a 24, 48 y 72 horas. ** P & lt; 0,01; *** P & lt; 0,001 entre los dos grupos indicados, n = 3 por grupo. (B y C) el análisis de Western blot para p-ERK1 /2, ERK1 /2, p-JNK, JNK, ciclina D1, Bcl2, expresión de la proteína Bax y Caspase3 en las células MC38 tratados. GAPDH sirvió como control de carga. Las transferencias que se muestran son representativos de tres experimentos separados.
endógena de insulina y el IGF-1 se incrementan en la diabetes tipo 2 mouse modelo
macho de ocho semanas de edad
db /db
ratones fueron utilizados para establecer un modelo de diabetes tipo 2 espontánea. Si bien su
db /+
compañeros de camada se utilizaron como controles normales. Al comienzo de los experimentos, el peso corporal y la glucosa en sangre fueron probados para confirme si el modelo diabético tuvieron éxito. Se encontró que el
db /db
ratones eran obesos en comparación con sus
db + /
camada que consiguió el peso normal (Figura 5A). La glucemia en ayunas en
db /db ratones
se elevó drásticamente (Figura 5B). a continuación, se determinó si la insulina en suero y el IGF-1 se cambiaron en estos ratones. insulina sérica se incrementó en
db /db ratones
como se esperaba (Figura 5C). Lo que es más, el suero de IGF-1 en
db /db ratones
fue también aumentó significativamente (Figura 5D). Estos resultados indican que
db /db
ratones son modelos ideales para la diabetes tipo 2 con alto nivel de insulina y el IGF-1.
Varón
db /db
se utilizaron ratones como tipo de ratón 2 modelos de diabetes, mientras que
db /+
camada como controles normales. El peso corporal (A), glucosa en sangre (B), la insulina (C) y el IGF-1 (D) se determinaron antes de la inyección de células MC38 en 8
ª semana. * P & lt; 0,05; *** P & lt;. 0.001, n = 5 por grupo
endógena de insulina /IGF-1 acelera el crecimiento del tumor de colon en el tipo 2 del ratón modelo de diabetes
A fin de validar los efectos de insulina endógena /IGF-1 en el crecimiento del tumor de colon, células MC38 se inyectaron por vía subcutánea en el crecimiento
db /db
o
db /+
ratones para iniciar tumor. Los volúmenes tumorales se midieron en diferentes puntos temporales después de la inoculación, y pesos de los tumores se midieron después de sacrificio. Se encontró que el crecimiento del tumor fue más rápida, y el peso del tumor fue más pesado en
db /db
ratones que
db /+
ratones (Fig 6A y 6B). A continuación se detectó la fosforilación de ERK1 /2 y JNK, ciclina D1, Bcl-2, caspasa 3 y Bax en el tejido tumoral. Ambos p-ERK1 /2 y las expresiones p-JNK fueron mayores en
db /db
ratones (Figura 6C y 6D). Las expresiones de ciclina D1 y Bcl-2 se aumentaron, mientras que las expresiones de Bax y caspasa 3 se redujeron en
db /db
ratones, que era consistente con las observaciones
in vitro
(Fig 6E y 6F). Los resultados mostraron que la insulina endógena /IGF-1 acelera el crecimiento del tumor de colon en un tipo de ratón modelo de diabetes 2.
2 × 10
6 células MC38 en suspensión en 0,1 ml de PBS se inyectaron por vía subcutánea en el em
db /db
y
db /+ ratones
para iniciar el crecimiento del tumor
in vivo
. (A) El tamaño del tumor se midió cada 3 días. * P & lt; 0,05; *** P & lt; 0,001. (B) Los tumores se extirparon y se ponderan 3 semanas después de la inyección de células. *** P & lt; 0.001. Una masa tumoral representante de cada grupo fue expuesto en la tabla (barra de escala = 1 cm). (C y E) análisis de transferencia de Western de p-ERK1 /2, ERK1 /2, p-JNK, JNK, ciclina D1, Bcl-2, la expresión de proteínas Bax y Caspase3 en los tumores. GAPDH sirvió como control de carga. Las transferencias que se muestran son representativos de tres experimentos separados. (D y F) Semi-cuantificación de la expresión de ERK1 /2 y pERK1 /2, JNK y p-JNK, ciclina D1, Bcl-2, la proteína Bax y Caspase3. Plegables cambios se normalizaron por grupos de control. * P & lt; 0,05; ** P & lt;. 0,01 frente al control, n = 3 por grupo
La inhibición de la señalización ERK1 /2 o JNK suprime el desarrollo de tumores de colon en un tipo de ratón modelo de diabetes 2
A al final de este estudio, para averiguar si el desarrollo de tumores de colon en
db /db
ratones fue de ERK1 /2 o JNK dependiente, utilizamos ERK1 /2 o inhibidor de JNK para tratar que lleva el tumor de colon
db /db
ratones. Se encontró que el efecto de ERK1 inhibidor /2 o JNK era dependiente de la dosis y 10 mg /kg PD98059 o 30 mg /kg SP600125 mostró un mejor efecto para bloquear tumoral ERK1 /2 o JNK señalización respectivamente
in vivo
(S1 figura). Tal y como esperábamos, PD98059 o SP600125 mostraron una supresión significativa en el crecimiento del tumor de colon
in vivo
, que era consistente con los resultados encontrados
in vitro gratis (figura 7A). Las mediciones de la masa tumoral al final de los experimentos mostraron resultados similares (Figura 7B).
2 × 10
6 células MC38 en suspensión en 0,1 ml de PBS se inyectaron por vía subcutánea en el
db /db
ratones para iniciar el crecimiento del tumor
in vivo
. se administró 10 mg /kg PD98059 o 30 mg /kg por vía intraperitoneal SP600125 cada 3 días cuando el volumen del tumor alcanzó 100 mm
3. 1% de DMSO fue utilizado como tratamiento de control. (A) El tamaño del tumor se midió cada 3 días. * P & lt; 0,05; *** P & lt; 0,001. (B) Los tumores se extirparon y se ponderan 3 semanas después de la inyección de células. *** P & lt; 0,001. Una masa tumoral representante de cada grupo fue expuesto en la tabla (barra de escala = 1 cm). (C y E) análisis de transferencia de Western de p-ERK1 /2, ERK1 /2, p-JNK, JNK, ciclina D1, Bcl-2, la expresión de proteínas Bax y Caspase3 en los tumores. GAPDH sirvió como control de carga. Las transferencias que se muestran son representativos de tres experimentos separados. (D y F) Semi-cuantificación de la expresión de ERK1 /2 y pERK1 /2, JNK y p-JNK, ciclina D1, Bcl-2, la proteína Bax y Caspase3. Plegables cambios se normalizaron por grupos de control. ** P & lt; 0,01; *** P & lt;. 0.001 versus control, n = 3 por grupo
También se detectó la expresión de proteínas específicas y aguas abajo después de PD98059 o tratamiento SP600125 en este modelo (Figura 7C-7F). Tal y como esperábamos, PD98059 y SP600125 bloqueados específicamente ERK1 /2 y JNK, respectivamente,
in vivo gratis (Figura 7C y 7D). Tanto PD98059 y SP600125 redujeron la expresión de la ciclina D1 y Bcl-2, pero aumentó la expresión de caspasa 3 y Bax (Fig 7E y 7F). Estos resultados confirman que la inhibición de la señalización ERK1 /2 o JNK suprime el desarrollo del tumor de colon en el tipo 2 del ratón modelo de diabetes.
Discusión
En el presente estudio, se observó que la insulina y el IGF 1, actúan como mitógenos de células de cáncer de colon, activar la ERK1 /2 y la señalización de JNK MAPK, lo que resulta en la aceleración del ciclo celular, crecimiento celular y la anti-apoptosis en células de cáncer de colon MC38. Por otra parte, se confirmó estos hallazgos
in vivo
mediante el establecimiento de un modelo de aloinjerto de tumor de colon con DM2.
La diabetes se caracteriza por defectos en la homeostasis de la glucosa y la función de la insulina. DM2, que se caracteriza por resistencia a la insulina y los niveles altos de insulina, representa el 90-95% de la diabetes mellitus [23]. Décadas de pruebas epidemiológicas muestran que DMT2 se asoció con un mayor riesgo de cáncer en diferentes sitios, incluyendo colon y recto, hígado, páncreas, mama y vejiga [24]. Nuestro estudio anterior encontró que DMT2 podría ser uno de los factores de riesgo importantes patógenos para el cáncer colorrectal en chino [25]. Sin embargo, también hubo algunos investigadores afirmaron que estas asociaciones podrían ser causados por sesgos en la literatura [26, 27]. Una revisión reciente de paraguas que se evaluaron las asociaciones entre la diabetes tipo 2 y el riesgo de desarrollar cáncer en 20 sitios, mostró que sólo el colorrectal, de mama, colangiocarcinoma intrahepático, y el cáncer de endometrio tenían pruebas sólidas para justificar el riesgo de desarrollar cáncer y sin indicios de sesgo [28].
los mecanismos de la DMT2 promueve el desarrollo de cáncer aún no se han investigado, incluyendo hiperinsulinemia, alto nivel de IGF-1 y la hiperglucemia en la diabetes tipo 2 [29]. Nuestros estudios anteriores mostraron que la insulina glargina promovió el crecimiento del cáncer de colon humano (HCT-116 y las células SW480) y el cáncer de mama (MCF-7 células)
in vitro
[30, 31]. Lo que es más, se cree que el tratamiento con insulina glargina aumentar el riesgo de desarrollar cáncer de colon [32]. Además, la hiperinsulinemia también conduce a aumentar el nivel de IGF-1 bioactivo, que es un potente mitógeno que puede resultar en la carcinogénesis [33]. Sin embargo, un ensayo controlado aleatorio no apoyan la hipótesis de que la hiperglucemia se relaciona con mayor riesgo de cáncer [34]. Por lo tanto, la hiperinsulinemia y alto nivel de IGF-1 pueden ser sus principales mecanismos. Los resultados de nuestro estudio apoyan esta hipótesis. Hemos encontrado que la combinación de insulina y IGF-1 promovió significativamente el crecimiento y el ciclo celular de las células de cáncer de colon MC38 murino de un solo uso de la insulina o IGF-1
in vitro
. Este resultado también demostró que la insulina /IGF-1 tuvo un efecto aditivo en la proliferación de las células MC38.
vías, que convierten las señales extracelulares en respuestas celulares específicas a través de la serie de eventos de fosforilación de señalización MAPK, juegan un papel importante en el colon el desarrollo del cáncer y la metástasis [35]. ERK1 /2, p38 y JNK son los 3 grandes familias de MAPK se encuentran activados en el cáncer colorrectal. Los estudios anteriores sugirieron que la /2 vía ERK1, pero no la JNK o la ruta de p38, es un importante regulador de la proliferación celular en el cáncer colorrectal [36]. Las otras dos vías de MAPK, la P38 y JNK, median la apoptosis y la respuesta inflamatoria [36]. Sin embargo, los efectos de la activación de JNK pueden ser diversas en la regulación de la apoptosis cuando la célula que recibe el estímulo diferente. Para el instante, factores de crecimiento conducen a la proliferación y la anti-apoptosis a través de vía de JNK, mientras que las citoquinas inflamatorias (por ejemplo TNF-α) conducen a la apoptosis [37]. Ha sido ampliamente aceptado que la insulina o IGF-1 promueve la proliferación de diversos tipos de cáncer mediante la activación de MAPK señalizaciones [18-20]. Nuestro presente estudio mostró claramente que la insulina /IGF-1 activado señalización P38 MAPK ERK1 /2 y JNK MAPK pero no en la proliferación de células MC38. La inhibición de ERK1 /2 o JNK demostró que ambas de estas señalizaciones MAPK contribuyeron a la proliferación y la anti-apoptosis. Sin embargo, Carlson et al. informó que la insulina no mejoraba /2, JNK o p38 fosforilación de ERK1 en los adipocitos de pacientes T2MD [38]. Mientras Gogg et al. mostró que la señalización de MAPK (ERK1 /2) se incrementó pero la señalización de la insulina fue afectada en las células endoteliales microvasculares subcutáneo de pacientes T2MD [39]. Los estudios mencionados anteriormente y nuestros resultados indican que la activación y los efectos de la señalización de MAPK por insulina o IGF-1 en diferentes líneas celulares pueden ser varias.
A continuación, la intención de confirmar nuestra hipótesis con un modelo de ratón de la DMT2
in vivo
. La falta de modelos animales que imitan fiables DM2 humana ha retrasado las investigaciones de los mecanismos específicos implicados en las interacciones entre DM2 y el desarrollo del cáncer. Durante estas décadas, varios modelos de ratón con DM2 se introdujeron en los estudios diabéticos. Hay 2 tipos de modelo de ratón de la DM2: inducidos y espontáneos modelos DM2 [40]. dieta alta en grasas más dosis baja de estreptozotocina es un enfoque frecuentemente utilizado para la diabetes tipo 2 inducida en ratones. Sin embargo, a largo tiempo requerido para la inducción, la hiperinsulinemia inestable y gran variación son las limitaciones de este modelo. [41]. Los ratones deficientes en el receptor de leptina (
db /db
ratones) son relativamente adecuado para el modelo de DM2 espontánea [42]. En el presente estudio, se encontró que el nivel de glucosa en sangre, la insulina sérica y el IGF-1 eran extremadamente superior en
db /db ratones
que
db /+
ratones a las 8 semanas de edad. Estos parámetros se correlacionaron con los pacientes con DM2. Además, tanto
db /db
ratones y células de cáncer de colon MC38 que se usaron fueron con C57BL /6 antecedentes, lo que hizo posible para nosotros establecer un aloinjerto de tumor de colon MC38 en
db /db
ratones. Por lo tanto,
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ratones se convirtió en el modelo de DM2 espontánea ideal en nuestro estudio. Kazuya et al. informaron que
db /db
ratones eran susceptibles a desarrollar displásico azoximetano inducida y lesiones neoplásicas tempranas en el colon [43].