Extracto
fenetil isotiocianato (fenil isocianato) es un componente de quimioprevención del cáncer prometedor de las verduras crucíferas comestibles con
in vivo
eficacia contra el cáncer de próstata en roedores experimentales. respuesta quimiopreventivo del cáncer a PEITC se caracteriza por su capacidad de inhibir múltiples vías de señalización oncogénicas, incluyendo factor nuclear-kB, Akt, y del receptor de andrógenos. El presente estudio demuestra, por primera vez, que el tratamiento PEITC activa Notch de señalización en maligna, así como las células de próstata humanos normales. La exposición de las células humanas de cáncer de próstata (LNCaP, PC-3 y DU145) y una línea normal humano de células epiteliales de la próstata (PrEC) para PEITC resultó en la escisión (forma activa) de Notch1 y Notch2, y aumento de la actividad transcripcional de Notch. En las células LNCaP PC-3 y, el tratamiento PEITC causó la inducción de ligandos Notch Jagged1 y Jagged2 (PC-3), la sobreexpresión de componentes complejos gamma-secretasa Presenilin1 y Nicastrin (PC-3), el enriquecimiento nuclear de troceados Notch2, y /o hasta -Reglamento de
Notch1
,
Notch2
,
Jagged1
, y /o
Jagged2
ARNm. apoptosis PEITC inducida en células LNCaP y PC-3 fue significativamente atenuada por ARN de interferencia de Notch2, pero no por la inhibición farmacológica de Notch1. Inhibición de la PC-3 y la migración de células LNCaP resultante de la exposición PEITC fue aumentada significativamente por desmontables de proteína Notch2, así como la inhibición farmacológica de la activación de Notch1. expresión nuclear de la proteína Notch2 escindido fue significativamente mayor en PC-3 xenoinjertos de ratones tratados con PEITC y próstatas de ratones TRAMP dorsolaterales PEITC alimentados en comparación con el control respectivo. Debido a que la señalización Notch está implicada en la metástasis de transición y epitelio-mesenquimal, el presente estudio sugiere que el efecto anti-metastásico del fenil isocianato se puede aumentar mediante un régimen de combinación que implica un inhibidor de Notch
Visto:. Kim SH, Sehrawat A, Sakao K, Hahm ER, Singh SV (2011) Notch activación por fenetil isotiocianato atenúa su efecto inhibitorio sobre la migración de células del cáncer de próstata. PLoS ONE 6 (10): e26615. doi: 10.1371 /journal.pone.0026615
Editor: S. K. Batra, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 15 Julio, 2011; Aceptado: September 29, 2011; Publicado: 24 Octubre 2011
Derechos de Autor © 2011 Kim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por el CA101753-08 SR1 subvención del Instituto Nacional del cáncer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
modalidades prácticas y seguras para la quimioprevención del cáncer de próstata clínicamente son atractivos debido a la alta mortalidad asociada a esta enfermedad maligna en los hombres estadounidenses [1]. productos vegetales, incluyendo componentes de frutas y verduras, siguen atrayendo la atención para el descubrimiento de nuevos agentes quimiopreventivos del cáncer [2]. isotiocianato de fenetilo (PEITC) es un tal agente quimiopreventivo del cáncer prometedor abundantes en los vegetales crucíferos comestibles tales como berro [3]. La evidencia de un efecto protector de las verduras crucíferas y sus componentes, incluyendo fenil isocianato, contra el cáncer de próstata se deriva de los estudios observacionales basados en la población, así como las investigaciones de laboratorio [3] - [9]. Por ejemplo, un estudio de casos y controles de base poblacional sugiere una asociación inversa entre la ingesta de verduras crucíferas y el riesgo de cáncer de próstata [4].
In vivo
eficacia quimiopreventivo del fenil isocianato contra el cáncer de próstata Ahora se ha establecido en un modelo de ratón transgénico (ratón transgénico adenocarcinoma de próstata modelo; de aquí en adelante abreviado como TRAMP) [5], [6]. La alimentación de 3 mol fenil isocianato /g de dieta redujo significativamente la incidencia y la carga (área afectada) de cáncer mal diferenciado en la próstata dorsolateral de los ratones TRAMP [6]. respuesta quimiopreventivo del cáncer a PEITC no se limita a cáncer de próstata como la inhibición de la carcinogénesis química o la supresión del desarrollo del cáncer espontáneo de otros sitios (
por ejemplo
, pulmón, colon y esófago) por este componente de la dieta también se ha documentado [7] - [9]. Además, el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de próstata subcutáneo en ratones atímicos se retrasó significativamente por la administración de PEITC o su
N-acetilcisteína
conjugado [10] - [12]. En particular, la administración oral fenil isocianato aumentada respuesta a docetaxel proapoptótico
in vivo Hoteles en xenoinjertos de cáncer de próstata [13].
Seguridad, la biodisponibilidad, la selectividad hacia las células cancerosas, y la posibilidad de dirigir múltiples vías oncogénicas son deseables atributos de un agente quimiopreventivo del cáncer clínicamente útil. Investigación hasta el momento indica que PEITC cumple todos estos criterios. En primer lugar, PEITC es bien tolerado por los roedores experimentales [6] - [9]. En segundo lugar, las determinaciones farmacocinéticos indican una excelente biodisponibilidad de PEITC [14], [15]. En tercer lugar, PEITC también muestra selectividad hacia las células del cáncer en la causa de la apoptosis y la autofagia [11], [16], [17]. Finalmente, PEITC es capaz de suprimir múltiples vías de señalización oncogénicas que son hiperactivos en el cáncer humano de próstata [18], incluyendo el factor nuclear kappa B (NF-kB) [19], Akt [20], transductor de señales y activador de la transcripción 3 (STAT3 .) [21], y el receptor de andrógenos [22]
en el presente estudio se extiende estas observaciones [19] - [22] y examina el efecto del tratamiento con fenil isocianato en la activación de Notch 1 y Notch2, que pertenecen a una familia de receptores transmembrana implicados en el desarrollo del cáncer de próstata y metástasis [23], utilizando células de cáncer de próstata humano cultivadas (LNCaP, PC-3, LNCaP-C4-2, y DU145), una línea de células epiteliales de próstata humana normal (PrEC), PC- 3 xenoinjertos de ratones control y tratados con fenil isocianato [13], [16], y la próstata dorsolateral de control y los ratones TRAMP fenil isocianato alimentados [6].
Resultados
fenil isocianato tratamiento aumenta los niveles de escindido Notch1 y Notch2 en células de cáncer de próstata
activación dependiente de ligando de Notch es complejo que requiere la escisión por la γ-secretasa complejo [23], [24]. receptores Notch se activan tras la unión de sus ligandos adyacentes (
por ejemplo
, Jagged1 y Jagged2), que se cree que induce un cambio conformacional en el receptor Notch que resulta en la exposición de un sitio de escisión S2 para factor de necrosis tumoral-α enzima convertidora de [23], [24]. Posteriormente, los receptores Notch se someten a otra escisión mediada por el complejo γ-secretasa en un sitio ubicado dentro del dominio transmembrana Notch [24]. resultado neto de esta división es la liberación del dominio intracelular Notch en el citoplasma, que entonces se transloca al núcleo para regular la expresión del gen diana [23], [24]. Nivel de proteína Notch1 escindido se aumentó después del tratamiento con PEITC tanto en LNCaP (Fig. 1A) y células PC-3 (Fig. 1B) aunque con diferentes cinética y la intensidad. Por el contrario, el tratamiento PEITC causó un aumento robusto y sostenido en el nivel de proteína Notch2 escinde tanto en LNCaP (Fig. 1A) y PC-3 líneas de células (Fig. 1B), especialmente en la dosis de 5 mM. Basado en NOTCH2 datos de interferencia de ARN que se muestran más adelante, la banda inferior en la transferencia Western Notch2 muestra en la Fig. 1B es no específica. Efecto del tratamiento PEITC en la expresión de proteínas Jagged1 y Jagged2 fue diferente entre LNCaP y células PC-3. línea de células LNCaP tratadas con PEITC generalmente exhibió una disminución en los niveles de proteínas y JAGGED1 Jagged2 (Fig. 1A). En agudo contraste con LNCaP, transitorio (Jagged1) o sostenida (Jagged2) la inducción de la expresión de la proteína Jagged era claramente visible en tratados con PEITC células PC-3 (Fig. 1B). respuestas diferenciales también eran perceptibles en relación con efecto del tratamiento con fenil isocianato en proteínas y Presenilin1 nicastrin entre células LNCaP y en especial en el punto de tiempo de 8 horas 3-PC.
inmunotransferencia para escindido Notch1, Notch2 troceados, Jagged1, Jagged2, Presenilin1 y Nicastrin usando lisados a partir de (A) LNCaP, (B) PC-3, y (C) células LNCaP-C4-2 después de 8, 16, o 24 horas de tratamiento con dimetil sulfóxido (DMSO) o PEITC (2,5 o 5 M). La flecha en el panel B identifica escinde Notch2, la banda inferior es no específico basado en siRNA resultados que se muestran en la Fig. 4A. Blots fueron despojados y volvieron a sondar con el anticuerpo anti-actina. Inmunotransferencia para cada proteína se llevó a cabo al menos dos veces usando lisados preparados de manera independiente. Los números por encima de banda representan cambios en los niveles de proteína relación a las correspondientes de control tratado con DMSO.
PC-3 células de línea, que es independiente de los andrógenos, es relativamente más agresivo en comparación con las células LNCaP sensibles a andrógenos con respecto a la proliferación,
in vivo
crecimiento de xenoinjertos modelo, y la migración celular. Nos preguntamos si la respuesta diferencial de LNCaP
frente
PC-3 células a alteraciones mediadas por fenil isocianato en componentes de señalización Notch se relaciona con fenotipo independiente de andrógenos. Hemos tratado esta cuestión utilizando una variante independiente de andrógenos de las células LNCaP (LNCaP-C4-2). Respuesta de las células LNCaP-C4-2 a los cambios mediados por PEITC en proteínas de señalización Notch fue generalmente similar a la observada en las células LNCaP parentales (Fig. 1C). En conjunto, estas observaciones indican que mientras que las células PC-3 y LNCaP diferencialmente respondieron a los cambios mediados por ligandos en PEITC Notch y complejo γ-secretasa, la escisión de las proteínas de Notch1 y NOTCH2 tras la exposición PEITC fue consistente en cada línea celular probada. Además, la transición de las células LNCaP a la independencia androgénica (LNCaP-C4-2) no tiene un impacto significativo sobre los cambios mediados por fenil isocianato en los niveles de componentes de señalización Notch.
fenil isocianato de tratamiento aumenta la actividad transcripcional de Notch
Se analizó si la escisión mediada-fenil isocianato de Notch1 y Notch2 tradujo en un aumento de la actividad transcripcional de Notch. Como se muestra en la Fig. 2A, el tratamiento de LNCaP y, células PC-3 con 5 M PEITC resultó en un incremento estadísticamente significativo en la actividad de informador de luciferasa de RBP-Jk (un modulador de aguas abajo de la señalización de Notch) en comparación con sulfóxido de dimetilo (DMSO) tratados con los controles. Se utilizó otra línea bien caracterizado resistente a la castración de próstata humano de células de cáncer (DU145) para determinar el efecto del tratamiento PEITC sobre la actividad transcripcional de Notch. Como se puede ver en la Fig. 2A, el tratamiento fenil isocianato aumento de la actividad de luciferasa RBP-Jk en las células DU145 también. Además, las células DU145 tratadas con PEITC exhiben una cinética similar de Notch1 y la escisión Notch2 (Fig. 2B) como se observa en la línea celular PC-3 (Fig. 1B).
(A) Efecto del tratamiento en PEITC la actividad de luciferasa RBP-Jk (una medida de la actividad transcripcional de Notch) en LNCaP, PC-3, las células DU145, y PrEC después del tratamiento de 8 ó 16 horas con sulfóxido de dimetilo (DMSO) o 5 mM PEITC. Los resultados mostrados son la media ± SD (n = 3). * Significativamente diferente (
P Hotel & lt; 0,05) en comparación con el control tratado con DMSO por ANOVA de un factor seguido por el test de Dunnett (LNCaP y PC-3) prueba t de Student o de (DU145 y PrEC). (B) inmunotransferencia para escinde Notch1 y se escindió Notch2 usando lisados de células DU145 y PrEC tratados con DMSO (control) o PEITC (2,5 o 5 M) para los períodos de tiempo indicados. Blots fueron despojados y volvieron a sondar con el anticuerpo anti-actina. La flecha en el panel B (células DU145) identifica escinde Notch2, la banda inferior es no específico basado en siRNA resultados que se muestran en la Fig. 4A. Inmunotransferencia para cada proteína se llevó a cabo al menos dos veces usando lisados preparados de manera independiente. Los números encima de las bandas representan cambios en los niveles de proteína en relación con el control correspondiente tratado con DMSO. Cada experimento se repitió al menos dos veces.
A continuación, se utilizó una línea de células epiteliales de próstata humana normal (PrEC) para determinar si la activación mediada por Notch 1 y fenil isocianato de Notch2 era exclusivo de las células cancerosas de próstata. Este fue un objetivo de investigación digno de considerar diferencias notables se han observado en cuanto a efecto de fenil isocianato entre las células prostáticas cancerosas y normales. Por ejemplo, hemos demostrado anteriormente que la línea celular PrEC es significativamente resistente a la inhibición mediada por PEITC de la fosforilación oxidativa, la generación de especies reactivas de oxígeno, y la inducción de apoptosis en comparación con las células LNCaP PC-3 y [11], [17]. Además, PC-3 y las células PrEC responder de forma diferente a los cambios mediados por PEITC en la expresión de genes de defensa antioxidante [25]. De manera similar a las células de cáncer de próstata (Fig. 1), el tratamiento PEITC resultó en niveles incrementados de troceados Notch1 y Notch2 en las células PrEC especialmente en el punto de tiempo de 16 horas en ambos 2,5 y 5 M concentraciones (Fig. 2B). De acuerdo con los resultados, mediada por aumento en la actividad PEITC indicador de luciferasa RBP-Jk también se observó en las células PrEC después del tratamiento de 16 horas con 5 mM PEITC (Fig. 2A). Basándose en estos resultados, se concluye que PREC y células cancerosas de próstata (PC-3, LNCaP, LNCaP-C4-2, y DU145) se comportan de manera similar con respecto a la activación mediada por PEITC de Notch.
Efecto de PEITC el tratamiento de los niveles nucleares de troceados Notch2
Debido a que el efecto del tratamiento con fenil isocianato era relativamente más pronunciada y sostenida en comparación con la escisión Notch2 escindido Notch1, se procedió a determinar los niveles de NOTCH2 escindidos en el control tratado con DMSO y LNCaP tratadas con fenil isocianato y células PC-3. PEITC tratados LNCaP y células PC-3 mostraron un marcado incremento en los niveles nucleares de Notch2 escindido en comparación con el control tratado con DMSO (Fig. 3A). Estos resultados indicaron que el tratamiento resultó en PEITC enriquecimiento nuclear de Notch2 escindido en las células de cáncer de próstata, que es coherente con el aumento observado de la actividad transcripcional de Notch por tratamiento PEITC (Fig. 2A)
.
(A) microscópico de inmunofluorescencia imágenes que representan los niveles nucleares de proteína Notch2 escindido en LNCaP y células PC-3 después de tratamiento de 8 horas con sulfóxido de dimetilo (DMSO) o 5 mM PEITC a 100 × aumento del objetivo. La cuantificación de
Notch1
,
Notch2
,
Jagged1
, y
Jagged2
los niveles de mRNA de tiempo real RT-PCR en LNCaP (B) y ( C) células PC-3 después de tratamiento de 8 horas con DMSO (control) o PEITC (2,5 o 5 mM). Los resultados mostrados son la media ± SD (n = 3). * Significativamente diferente (
P
& lt; 0,05) en comparación con el control tratado con DMSO por ANOVA de una vía con el ajuste de Dunnett. Cada experimento se repitió al menos dos veces.
Efecto del tratamiento con fenil isocianato en
Notch1
,
Notch2
,
Jagged1
, y
Jagged2
niveles de mRNA
los datos para el efecto del tratamiento con fenil isocianato en los niveles de mRNA de
Notch1
,
Notch2
,
Jagged1
, y
¿Cuáles son Jagged2 muestra en la Fig. 3B (LNCaP) y la fig. 3C (PC-3). La expresión de
Notch1 gratis (2,5 y 5 mM fenil isocianato) y
Jagged1 gratis (5 mM fenil isocianato) ARNm se incrementó significativamente después del tratamiento de 8 horas de células LNCaP con fenil isocianato (Fig. 3B). Un tratamiento similar fenil isocianato resultó en la supresión de la
Notch2 gratis (5 mM fenil isocianato) y
Jagged2 gratis (5 micras fenil isocianato) niveles de mRNA en células LNCaP (Fig. 3B). Por otro lado, PC-3 células tratadas durante 8 horas con 5 mM fenil isocianato exhibieron una inducción significativa de
Notch1
,
Notch2
,
Jagged1
, y
Jagged2 expresión
mRNA comparación con el control tratado con DMSO (Fig. 3C). inducción significativa de
Notch1
,
Jagged1
, y
Jagged2
ARNm con 2,5 M de tratamiento fenil isocianato también se observó en las células PC-3 (Fig. 3C). Una vez más, estos resultados apuntan hacia la célula diferencias específicos de la línea en mediada por alteraciones en la expresión de fenil isocianato
Notch1
,
Notch2
,
Jagged1
, y
Jagged2
ARNm.
ARN de interferencia de Notch2 confiere protección contra la apoptosis inducida por el fenil isocianato
O'Neill et al [26] han demostrado previamente que Notch2 regula la apoptosis en las células MDA-MB-231. Dado que el tratamiento fenil isocianato aumentó consistentemente los niveles de proteína Notch2 escindido en cada línea celular probado, era lógico para determinar si Notch2 contribuyó a la apoptosis inducida por el fenil isocianato. Como se muestra en la Fig. 4A, el nivel de proteína de escindido Notch2 se redujo en aproximadamente un 40 a 60% después de la transfección transitoria de células LNCaP y PC-3 con un Notch2 orientada-pequeños ARN de interferencia (siRNA) en comparación con las células transfectadas con un control (no específica) siRNA. mediada por aumento de fenil isocianato en los niveles de proteína escindida Notch2 era claramente visible en el control de siRNA LNCaP transfectadas y las células PC-3, que fue casi completamente abolidos por RNA de interferencia de Notch2 (Fig. 4A). Desmontables de proteína Notch2 por sí solo no tiene ningún impacto significativo sobre la liberación de fragmento de ADN de histona asociada en el citosol, que es un método bien aceptado para la cuantificación de la apoptosis, en cualquiera de las líneas de células (Fig. 4B). Por otra parte, la apoptosis inducida por PEITC era relativamente más pronunciada en LNCaP y PC-3 células transfectadas con el ARNsi de control en comparación con las transfectadas con siRNA dirigidos-Notch2 (Fig. 4B). Estos resultados indicaron que Notch2 knockdown protección contra la apoptosis inducida por PEITC confirió
.
(A) La inmunotransferencia de proteínas Notch2 escindido usando lisados de LNCaP y células PC-3 transfectadas transitoriamente con un control (no específica) siRNA o una Notch2 orientada siRNA y se trató durante 24 horas con sulfóxido de dimetilo (DMSO) o 5 mM PEITC. Los números encima de las bandas representan cambios en los niveles de proteína en relación con las células de control siRNA transfectadas tratadas con DMSO. Flecha (PC-3) identifica escinde Notch2, la banda inferior es inespecífica. (B) de liberación fragmento de ADN de histona asociada en el citosol (una medida de la apoptosis) en células LNCaP y PC-3 transfectadas transitoriamente con un siRNA de control o un Notch2 orientada siRNA y se trató durante 24 horas con DMSO (control) o 5 M fenil isocianato. Los resultados se expresan como la apoptosis enriquecimiento relativo a las células control siRNA transfectadas tratadas con DMSO. (C) inmunotransferencia para escinde Notch1 y escinde proteínas NOTCH2 utilizando lisados de LNCaP y células PC-3 tratadas durante 8 horas o 24 horas con DMSO (control) o 5 mM PEITC en ausencia o presencia de 50 mM DAPT. Los números encima de las bandas representan cambios en los niveles de proteína en relación con el control correspondiente tratado con DMSO. (D) de histona asociada liberación fragmento de ADN de apoptosis en el citosol en células LNCaP y PC-3 tratadas durante 24 horas con DMSO (control) o 5 mM PEITC en ausencia o presencia de 50 mM DAPT. Los resultados se expresan como la apoptosis enriquecimiento relativo al control tratado con DMSO. Resultados (paneles B y D) son la media ± SD (n = 3). * Significativamente diferente (
P Hotel & lt; 0,05) entre los grupos indicados por ANOVA de una vía seguido por la prueba de comparación múltiple de Bonferroni. Cada experimento se repitió dos veces, y se muestran los datos representativos de uno de tales experimentos.
Hemos diseñado experimentos usando un inhibidor farmacológico de la γ-secretasa {N- [N- (3,5-L-difluorophenacetyl alanil)] - éster S-fenilglicina-t-butilo; de aquí en adelante abreviado como DAPT} A fin de probar el papel de Notch en la apoptosis inducida por el fenil isocianato. aumento en los niveles de proteína Notch1 escindido PEITC mediada por, pero no escinde Notch2, fue notablemente suprimida por co-tratamiento con 50 mM DAPT (Fig. 4C). Como era de esperar, el tratamiento DAPT sola disminución de los niveles de Notch1 escindido y Notch2 tanto en LNCaP y células PC-3, aunque en proporciones variables (Fig. 4C). apoptosis inducida por fenil isocianato, o bien no se alteró en absoluto (células PC-3) o aumentó ligeramente (células LNCaP) por co-tratamiento con DAPT (Fig. 4D). Sobre la base de estos resultados, se concluye que la activación de Notch2, pero no Notch1, contribuye a la apoptosis inducida por el fenil isocianato, al menos en las células PC-3.
ARN de interferencia de Notch2 propugne mediada por la inhibición de la migración celular fenil isocianato
Debido a la señalización de Notch está implicada en la invasión celular y la transición epitelio-mesenquimal (EMT) [27], [28], hemos diseñado experimentos funcionales para determinar las consecuencias de la activación de Notch en la capacidad del fenil isocianato para inhibir LNCaP y PC-3 células migración. La transfección transitoria con siRNA dirigidos-Notch2 solo resultó en la supresión de LNCaP (Fig. 5A) y PC-3 (Fig. 5C) la migración de células en comparación con las células siRNA transfectadas de control correspondientes como se determina por el ensayo de cámara de Boyden. La migración de LNCaP transfectadas con ARNsi de control (Fig. 5B) y PC 3-células (Fig. 5D) también se redujo significativamente tras el tratamiento con 5 mM PEITC. Por otra parte, la inhibición de LNCaP (Fig. 5B) y PC-3 fenil isocianato-mediada (Fig. 5D) la migración celular se aumentó de manera significativa por la precipitación de la proteína Notch2.
Imágenes representativas (Boyden cámara de ensayo) que representa la migración de (a) LNCaP y (C) células PC-3 transfectadas con un control (no específica) siRNA o una Notch2 orientada siRNA y se trató durante 24 horas con sulfóxido de dimetilo (DMSO) o 5 mM PEITC a 200 × magnificación. La cuantificación de las células LNCaP migrados (B) y (D) células PC-3 de los experimentos que se muestran en los paneles A y C. De tres a cuatro campos de cada filtro se anotó para células migradas en un microscopio invertido a 200 × magnificación. Los resultados mostrados son la media ± SD (n = 3). * Significativamente diferente (
P Hotel & lt; 0,05) entre los grupos indicados por ANOVA de una vía seguido por la prueba de comparación múltiple de Bonferroni. Cada experimento se repitió dos veces, y se muestran los datos representativos de uno de tales experimentos.
supresión farmacológica de la activación Notch1 propugne mediada por la inhibición de la migración celular fenil isocianato
DAPT solo causó una disminución modesta en LNCaP (Fig. 6A) y PC-3 (Fig. 6C) la migración de células en comparación con el control respectivo tratado con DMSO. Similar a los datos utilizando Notch2 siRNA, co-tratamiento con DAPT aumentada mediada por la inhibición de PEITC LNCaP (Fig. 6B) y PC-3 (Fig. 6D) la migración celular. Estos resultados indicaron que Notch1 y Notch2 la activación por fenil isocianato repercute negativamente en su capacidad para inhibir la migración de células de cáncer de próstata.
Imágenes representativas LNCaP y PC (C) 3-células (Boyden cámara de ensayo) que representa la migración de (A) después de tratamiento de 24 horas con sulfóxido de dimetilo (DMSO) o 5 mM PEITC en ausencia o presencia de 50 mM DAPT a 200 × magnificación. La cuantificación de las células LNCaP migrados (B) y (D) células PC-3 después de tratamiento de 24 horas con DMSO o 5 M PEITC y /o 50 mM DAPT. De tres a cuatro campos de cada filtro se anotó para células migradas en un microscopio invertido. Los resultados mostrados son la media ± SD (n = 3). * Significativamente diferente (
P Hotel & lt; 0,05) entre los grupos indicados por ANOVA de una vía seguido por la prueba de comparación múltiple de Bonferroni. Cada experimento se repitió dos veces, y se muestran los datos representativos de uno de tales experimentos.
El análisis inmunohistoquímico para el efecto de fenil isocianato en la proteína escindida Notch2
in vivo
utilizamos tejidos archivados de nuestros estudios realizados previamente [6], [13], [16] para determinar
in vivo
relevancia de los hallazgos celulares (Fig. 1). Debido a que el efecto del tratamiento PEITC era más consistente y sostenida en escindido Notch2, el análisis inmunohistoquímico fue restringida a esta proteína. imágenes inmunohistoquímicas representativos para la expresión Notch2 escindido en PC-3 secciones de xenoinjerto de tumor de control y ratones tratados con PEITC se muestran en la Fig. 7A. De acuerdo con los resultados mostrados en las células cultivadas PC-3 (Fig. 3A) la expresión nuclear de escindido Notch2 fue significativamente mayor en PC-3 xenoinjertos de ratones tratados con PEITC comparación con el control (Fig. 7A). Del mismo modo, el nivel nuclear de la proteína Notch2 escindido en la próstata dorsolateral fue significativamente mayor en los ratones TRAMP en comparación con el control (figura 7B). PEITC alimentado
(A) Representante H & amp;. E tinción y la tinción inmunohistoquímica para la expresión de la proteína Notch2 escindido en PC-3 xenoinjertos de tres ratones de los grupos indicados (barra de escala, 50 micras; magnificación de 400 ×). La amplificación del área seleccionada se muestra en el recuadro. La cuantificación de la expresión nuclear de la proteína Notch2 en PC-3 xenoinjertos de ratones control y tratado con fenetil isotiocianato (fenil isocianato) se muestra en el gráfico de barras (media ± SD, n = 3). (B) La inmunohistoquímica que muestra la expresión de proteínas escinde Notch2 en la próstata dorsolateral de cuatro ratones TRAMP de los grupos indicados (barra de escala, 50 micras; magnificación de 400 ×). La amplificación del área seleccionada se muestra en el recuadro. La cuantificación de la expresión nuclear de la proteína Notch2 escindido en la próstata dorsolateral de control y ratones TRAMP PEITC alimentados se muestra en el gráfico de barras (media ± SD, n = 4). La significación estadística se determinó mediante la prueba t de Student.
Discusión
El papel preciso de la señalización de Notch en el desarrollo del cáncer de próstata aún no está clara, pero los estudios han tratado de resolver este problema con el uso de líneas celulares de cáncer de próstata y biopsias de cáncer de próstata humano. Down-regulación de Jagged1 se ha demostrado que inhibe la proliferación de células de cáncer de próstata [29]. El mismo grupo de investigadores informó más tarde que el ARN de interferencia de Notch1 confirió protección contra la migración de células de cáncer de próstata y la invasión [30]. Al mismo tiempo, la sobreexpresión de Notch1 constitutivamente activa también se ha demostrado que inhibe la proliferación de células LNCaP [31]. Debido a que la señalización Notch es bastante complejo que implica interacción entre cuatro receptores (Notch1-Notch4) y cinco ligandos [Jagged1, Jagged2, ligandos Delta-like (Dll1, DLL3, y Dll4)] [23], [24] y cada componente de la señalización de Notch no es comúnmente estudiado [29] - [31], es plausible que la discrepancia se debe a cambios compensatorios en otros componentes provocados por desmontables de Notch1 o Jagged1. Sin embargo, la expresión Jagged1 en biopsias de cáncer de próstata se asocia con un aumento de la metástasis y la recurrencia [32]. El presente estudio revela que PEITC activa Notch 1 y Notch2 en las células prostáticas cancerosas y normales. Por otra parte, la administración fenil isocianato provoca un aumento significativo de los niveles nucleares de Notch2 escindido
in vivo
en los tumores de próstata a partir de dos diferentes modelos de roedores. También demostramos que la activación de Notch 1 y Notch2 reduce la capacidad del fenil isocianato para inhibir la migración de células de cáncer de próstata. Sobre la base de estas observaciones, nos vemos tentados a especular que el efecto anti-metastásico del fenil isocianato se puede aumentar mediante un régimen de combinación que implica un inhibidor de Notch.
LNCaP y PC-3 células presentan notables diferencias con respecto a mediada fenil isocianato alteraciones en los componentes de señalización Notch, especialmente ligandos Notch y componentes gamma-secretasa. Dos posibilidades obvias merecen atención para explicar estas diferencias en la respuesta fenil isocianato entre las células LNCaP sensibles a andrógenos (p53 de tipo salvaje)
frente
resistentes a la castración y p53 nula células PC-3. Una posibilidad se refiere a la diferencia en el estado de p53 entre LNCaP y células PC-3 como Notch1 se ha demostrado que es un objetivo directo de p53 [33]. Restauración de la expresión de p53 en líneas celulares de cáncer humano se ha demostrado que un máximo de regular la expresión de Notch1 [33]. Debido a que las células PC-3 y DU145, ambos de los cuales carecen de p53 funcional, se comportan de manera similar con respecto a la activación mediada por PEITC de Notch1 y Notch2, posibilidad de que diferencial de respuesta entre LNCaP y las células resistentes a la castración (PC-3 y DU145) se manifiesta, parcialmente si no completamente, por la p53 no puede ser descartada en la actualidad. Al mismo tiempo, somos conscientes de que la regulación de la expresión, así como la activación de Notch1 es bastante compleja mediada por otros factores además de p53, incluyendo Nrf2, ETS transcripción miembro de PEA3 factor familiar, la señalización del receptor del factor de crecimiento epidérmico, y Akt por nombrar algunos [34] - [37]. Si bien se necesitan más estudios para resolver este interrogante en torno a p53, es razonable concluir que la respuesta diferencial entre las células LNCaP y PC-3 no está relacionado con la capacidad de respuesta a andrógenos ya que las células LNCaP y el Anexo de la variante LNCaP-C4-2 independiente de los andrógenos respuesta generalmente comparable a los cambios mediados por PEITC en componentes de señalización Notch. En este contexto, es importante mencionar que
Notch
objetivo HEY (Hairy /reforzador de fractura relacionada con adorno YRPW) es un receptor de andrógenos selectivos co-represor [38].
La activación de Notch2 por la sobreexpresión de su dominio intracelular promueve la apoptosis en células MDA-MB-231 células [26]. Es de interés para determinar las consecuencias de la activación de Notch en la respuesta a proapoptótico fenil isocianato en nuestro modelo. A diferencia de Notch1 [30], una caída del 40-60% de la proteína Notch2 no tiene un impacto significativo en la apoptosis en LNCaP o células PC-3. Sin embargo, la apoptosis que resulta de la exposición PEITC se atenúa significativamente por Notch2 desmontables al menos en células PC-3. Por otro lado, la supresión de la activación de Notch1 con DAPT no tiene ningún efecto sobre la respuesta a proapoptótico PEITC. Basándose en estos resultados se concluye que Notch1 es prescindible para la muerte celular resultante de la exposición PEITC en las células LNCaP PC-3 y. Mecanismo por el cual Notch2 caída confiere protección contra la apoptosis inducida por el fenil isocianato aún no está claro. La inhibición de varias vías anti-apoptóticos, tales como NF-kB y STAT3, junto con alteraciones en la expresión de Bcl-2 proteínas de la familia han sido implicados en la inducción de apoptosis por fenil isocianato [10], [11], [17], [19] , [39]. Es posible que Notch2 efecto altera desmontables de PEITC en algunas de estas vías para conferir protección contra la apoptosis.
La metástasis es la causa principal de mortalidad por cáncer de próstata. En particular, Notch se ha implicado en EMT [27], que promueve la metástasis [40]. Además, el tratamiento de LNCaP y células PC-3 con γ-secretasa DAPT inhibidor se ha demostrado que inhibe la motilidad celular [41]. El presente estudio revela que la motilidad tanto de LNCaP y células PC-3 se reduce significativamente por la caída de la proteína Notch2 usando siRNA (disminuido, pero no significativo en LNCaP), así como la inhibición mediada por DAPT de activación Notch1 (reducido pero no significativo en PC- 3). inhibición Además, mediada por PEITC de LNCaP y la migración de células PC-3 se ve aumentada por la precipitación de la proteína Notch2, así como la inhibición farmacológica de Notch1 de escisión (PC-3 solamente). Mecanismo por el cual Notch2 caída inhibe la migración celular sigue siendo difícil de alcanzar, pero este problema se ha estudiado para Notch1 [28]. agotamiento dirigida de Notch1 inhibe PC-3 y la migración celular 22Rυ1 por reducción de la expresión de la metaloproteinasa de matriz 9 y uroquinasa activador del plasminógeno [28]. Es posible que Notch2 caída provoca respuesta similar en la matriz metaloproteinasa-9 y activador del plasminógeno uroquinasa.
En conclusión, el presente estudio demuestra que el tratamiento con fenil isocianato promueve la escisión de Notch 1 y Notch2 que conduce a su activación transcripcional en tanto cancerosos ( LNCaP, PC-3 y DU145) y las células normales de la próstata (PrEC). apoptosis inducida por PEITC en células de cáncer de próstata es modestamente atenuada por desmontables de Notch2, pero no por la inhibición farmacológica de la activación de Notch1.