cáncer
Extracto
próstata se compone de células secretoras y una población de células inmaduras. La función de las células inmaduras y su relación mutua con las células secretoras son aún poco conocidos. células inmaduras o bien tienen una relación jerárquica de las células secretoras (modelo de células madre) o representar una población emergente inducible por estimulación adecuada de células diferenciadas. Factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) receptor c-MET se expresa específicamente en células de la próstata inmaduros. Nuestro objetivo es determinar el papel de las células inmaduras en el cáncer de próstata en un análisis de la ruta de HGF /c-MET.
Gene-perfiles de expresión de células de cáncer de próstata DU145 estimuladas con HGF reveló la inducción de una firma molecular asociado con las células, que se caracterizan por la sobre regulación de CD49b, CD49f, CD44 y SOX9 del tallo y la baja regulación de CD24 ( "firma del tallo-como"). Se confirmó la adquisición de un fenotipo de tallo como por PCR cuantitativa, análisis de FACS y transferencia Western. Además, el HGF condujo a la activación de la vía de Notch relacionados con células madre mediante la regulación de sus ligandos-1 Jagged y Delta-como centrarse en la actividad 4. Pequeñas moléculas SU11274 y PHA665752 c-MET fueron ambos capaces de bloquear los efectos moleculares y biológicas de HGF. Knock-down de c-MET por la infección shRNA resultó en una reducción significativa y la demora de ortotópico tumor formación en ratones NMRI machos. El análisis inmunohistoquímico reveló en prostatectomías enriquecimiento significativo de las células c-MET positivos en el frente invasivo, y demostró la co-expresión de c-MET con marcadores madre-como CD49b y CD49f.
En conclusión, la activación de c-MET en células de cáncer de próstata inducida por un fenotipo similar al tallo, lo que indica una relación dinámica entre las células diferenciadas y madre-como en este tipo de cáncer. Su mediación del tumor formación eficiente
in vivo
y la expresión del receptor predominante en el frente invasivo implican que el c-MET regula la infiltración del tumor en los tejidos circundantes supuestamente por la adquisición de un fenotipo similar al tallo.
cita: van Leenders GJLH, Sookhlall R, Teubel WJ, de Ridder CMA, Reneman S, Sacchetti A, et al. (2011) La activación de c-MET induce un vástago fenotipo similar en el cáncer de próstata humano. PLoS ONE 6 (11): e26753. doi: 10.1371 /journal.pone.0026753
Editor: H. Fazlul Sarkar, Wayne Facultad de Medicina de la Universidad del Estado, Estados Unidos de América
Recibido: 14 Enero, 2011; Aceptado: 3 de octubre de 2011; Publicado: 14 Noviembre 2011
Derechos de Autor © 2011 van Leenders et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los Países Bajos Organización para la Investigación y Desarrollo de la Salud (ZonMW; conceder 907-00-138; subvención personal para el Dr. van Leenders; http://www.zonmw.nl/); Fundación para la Investigación Científica de Urología (SUWO); Fundación Adessium; Fundación Zabawas, Países Bajos. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
en el epitelio de la próstata, la homeostasis del tejido es mediado por las células madre que residen en el epitelio glandular basal [1]. Después de la división asimétrica células madre dan lugar a células de tránsito de amplificación, que están presentes tanto en basal y luminal del epitelio, y que finalmente se diferencian en células secretoras luminales. Varios marcadores membranosas se expresan diferencialmente en tallo y las células diferenciadas en roedores benigna y el epitelio de próstata humano, incluyendo Sca-1
+, α
6-integrina /CD49f
+, α
2-integrina /CD49b
+, CD133
+, CD117
+, CD44
+ y CD24
- [2] - [9]. La combinación de estos marcadores podría favorecer delimitate tallo, de tránsito y de amplificación de las células diferenciadas terminalmente en el epitelio normal. Por ejemplo, las células madre α supuestamente expresa
2β
1-integrina
+ /CD133
+, células de tránsito de amplificación están a
2β
1-integrina
+ /CD133
-, y en fase terminal son células diferenciadas a
2β
1-integrina
- /CD133
-. [3], [7]
Las poblaciones celulares con biológica características parecidas a las de las células madre benignos también se han identificado en los tumores malignos [10] - [13]. En el cáncer de próstata, α
2β
1-integrina
+ /CD133
+ células poseen la potencia de auto-renovación y diferenciación multidireccional
in vitro
[8], [ ,,,0],14]. Además, CD44
+ /CD24
- células aisladas a partir de líneas celulares de cáncer de próstata muestran un alto nivel de formación de tumor de potencial
in vivo
[4]. A pesar de su aparente variabilidad en el potencial clonogénico y iniciadoras del tumor, la relación mutua entre las células no maduras y diferenciadas aún es poco conocido. En correspondencia con su relación en tejidos normales, una relación jerárquica estricta entre las llamadas células madre cancerosas (CSC de) y las células diferenciadas se ha postulado [12] - [14]. De acuerdo con este modelo, CSC de progenitores son directos e irreversibles de células diferenciadas. Recientemente, sin embargo, se demostró que las células diferenciadas pueden adquirir características CSC en mamaria y cáncer de colon [15], [16]. En particular, las características fenotípicas y biológicos contribuyeron a las células madre se pueden obtener, cuando las células más diferenciadas se someten a la transición epitelio-mesenquimal (EMT), ya sea por la depresión forzada de E-cadherina o por factores secretados por el micro-entorno como el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF ) [15], [16]. Desde su naturaleza exacta y la relación con otros tipos de células son objeto de controversia, nos referimos a la población de células presentan características de células madre como las células madre similares.
HGF y su receptor tirosina quinasa c-MET son importantes mediadores de la organogénesis , regeneración de tejidos y la cicatrización de la herida [17]. Dentro del epitelio normal de la próstata, c-MET se expresa específicamente en basal y las células luminales atróficas, donde supuestamente media la regeneración de las glándulas secretoras dañados [18], [19]. En el cáncer de próstata, c-MET está presente en niveles bajos, con una minoría de células que muestran expresión alta en proteínas [18], [20], [21]. Anteriormente, los demás y nos han demostrado que el c-MET y marcador de células basales de la queratina 5 son co-expresados dentro de la misma población de células de cáncer de próstata [14], [18]. Desde la vía HGF /c-MET tiene una función reguladora en la migración y la invasión
in vitro
, nos han sugerido que esta población de células es especialmente propensa a la infiltración en los tejidos circundantes [18], [22].
se sabe poco sobre el papel de c-MET en relación con las células de cáncer de próstata y cómo-madre similares a
in vitro
estudios sobre células madre similares a traducir al cáncer en pacientes reales. En este estudio, hemos demostrado que la activación de c-MET conduce a la inducción de un fenotipo de tallo como en el cáncer de próstata. Knock-down de c-MET más fuertemente reducido de tumores en ratones desnudos formación. Por último, demostrar que el c-MET se expresa preferentemente en el perímetro de las piezas de prostatectomía humanos y es co-localizada con sus objetivos corriente abajo a
2-integrina y α
6-integrina. Estos datos indican que las células madre similares a mediar en el crecimiento del tumor en el frente invasivo del cáncer de próstata.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
El estudio fue aprobado por el animal nacional Comité experimento (DEC; 102-08-01; EUR1396). Todas las muestras de los pacientes se utilizaron de forma anónima después de consentimiento informado por escrito adecuado y bajo la aprobación de la ética humanas Junta de Revisión Institucional (METC; MEC02.0957).
Células y materiales
DU145 línea celular de cáncer de próstata y células 293T de riñón embrionario (HEK) humanos se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, EE.UU.). DU145 se mantuvo a 37 ° C /5% de CO
2 en RPMI 1640 que contiene 5% de suero de ternera fetal (FCS) y penicilina /estreptomicina (P /S) (Lonza, Verviers, Bélgica). Para los experimentos de estimulación, las células DU145 se sembraron durante la noche en medio RPMI /FCS. Después de 1 día, el medio se reemplazó por 5% de dextrano de carbón (DCC) tratados RPMI (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.). Después de la adaptación durante la noche, HGF (25 ng /ml; Sigma) se añadió al medio de cultivo y las células se recogieron por incubación con EDTA 2 mM (Sigma) durante 20 min. Las pequeñas moléculas SU11274 (1,0 M; Sigma) y PHA665752 (0,1 M; Calbiochem, Nottingham, Reino Unido). Disuelto en dimetilsulfóxido (DMSO) se utilizaron para la inhibición de c-MET
Análisis de microarrays
células DU145 se estimularon durante 2, 8 y 24 horas con HGF o vehículo, y el ARN se aisló usando el reactivo RNAzol B (Tel-test Inc., Friendswood, EE.UU.). Después de aislamiento de ARN con cloroformo, isopropanol y etanol, el ADN fue digerido utilizando el kit de ADN libre (Ambion, Huntingdon, Reino Unido). calidad y la cantidad de ARN se midieron usando RNA 6000 Nano kit en un 2100 Bioanalyzer (Agilent, Palo Alto, CA, EE.UU.). Se seleccionaron 8,5; las muestras con los números de la integridad del ARN de & gt. 5 g de ARN total a partir de muestras estimuladas y de control se utilizaron para preparar ARN antisentido con biotina según el protocolo de un ciclo del fabricante (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE.UU.). La hibridación de Affymetrix GeneChips U133plus2.0 Humano (54,614 conjuntos de la sonda, lo que representa aproximadamente 47.000 transcripciones), manchas, lavado, y los procedimientos de exploración se realizaron como se describe por Affymetrix (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE.UU.), y realizada por Erasmus MC Centro de Biomics. microarrays de datos se procesaron y se normalizó utilizando el software de Affymetrix Microarray Suite. RMA cuantil normalización se realizó y los valores de expresión (EVs) entre arrays se normalizaron mediante el establecimiento de la media de cada uno de los 6 arrays a 150; valores & lt; 30 fueron puestos a 30. Para cada punto de tiempo
2log se calcularon las proporciones entre HGF y células tratadas con vehículo. matriz de datos son compatibles con MIAME y se han presentado a GEO (GSE16659). La vinculación con otras bases de datos se realizó mediante SRS7; el programa Treeview se utilizó para la generación de imágenes mapa de calor [23], [24].
Cuantitativo PCR en tiempo real
Cuantitativo en tiempo real PCR se realizó utilizando Taqman PCR Reactivos RXN Básico incluyendo MQ, Taq Buffer, MgCl
2, dNTPs, AmpliTaq G (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Se utilizaron las siguientes sondas: Hs02379687_s1 (CD24); Hs00174139_m1 (CD44); Hs01041017_m1 (CD49f); Hs00165814_m1 (SOX9); Hs00158148_m1 (CD49b). La cantidad de gen diana se normalizó a GAPDH (Hs99999905_m1).
Para el análisis de los inhibidores de c-MET en CD49b, el ARN total se aisló con reactivo RNAzol B (Tel-Test) de acuerdo con el protocolo del fabricante. reacción de RT se realizó con oligo (dT) 12-18 cebador (Invitrogen, La Jolla, CA). Después de la adición de primero-Strand Buffer, dithithreitol, dNTPs y ARNsin, reacciones de RT se iniciaron por MMLV-RT (Invitrogen) y se incubaron durante 1 hora a 37 ° C. PCR cuantitativa se realizó mediante mezcla maestra SYBR verde (Applied Biosystems). CD49b adelante 5'-ACG CAG CAA CAC AGA ATT GA-3 ', 5'-GAA revertir GAA CCG GAG CTT CCA TA-3', 5'-GAPDH hacia adelante ACT GTG GTC ATG AGT CCT TC-3 ', revertir 5' -CAT GTT CGT GGG CAT TG-3 'y 5'-PBGD hacia adelante CAT GTC TGG TAA CGG CAA TG-3' y revertir 5'-GGC GTA CGA TTT CAA TGT TG-3 '. Las señales fueron analizados por ABI Prism sistema 7700 (Applied Biosystems). Cantidad de genes diana se determinó utilizando las curvas de calibración a partir de diluciones seriadas. Para la determinación de Notch-receptores y ligandos, RT-PCR se realizó usando los conjuntos de cebadores y cycli como se muestra en la Tabla S1 a una temperatura de hibridación de 60 ° C.
Citometría de flujo y Western blotting
Para el análisis de las proteínas membranosas 0,5 × 10
6 DU145 células se incubaron con anti-CD49b (1:500; Chemicon, Hampshire, Reino Unido), anti-CD49f (1:10,000; Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti- CD44-FITC (1:200; BD, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.), anti-CD24-PE (1:10; BD) y anti-CD133-PE (AC133 clon; 1:100; Miltenyibiotec; Bergisch Gladbach, Alemania ), en 50 l de PBS /2% de FCS durante 30 min. sobre hielo. Después del lavado, las células se incubaron con anticuerpos secundarios marcados con Alexa Fluor 488 (1:500) durante 15 min. Después de la suspensión en 300 l de PBS /2% de FCS con Hoechst 33258 (2 mg /ml) para seleccionar las células vivientes, la expresión de proteínas se midió utilizando un FACSAria citómetro de flujo (BD) equipado con tres láseres (407, 488 y 633 nm).
Para el análisis de SOX9 y la proteína c-MET, estimulados y control de las células se lisaron en tampón RIPA (10 mM Tris pH 7,4, NaCl 150 mM, 1% Triton x 100, 1% de desoxicolato, 0,1% SDS, EDTA 5 mM) que contiene inhibidores de proteinasa (completo; Roche, Basilea, Suiza). Las concentraciones de proteína se midieron usando reactivos de proteínas Biorad (Biorad Laboratories, München, Alemania). 40 g de proteína total se cargaron en un gel de SDS-PAGE 10% y se transfirieron a papel de nitrocelulosa (Protan, Schleicher y Schuell, Dassel, Alemania). Después de bloquear en 5% NFDM /TBST (Protifar, Nutricia, Zoetermeer, Países Bajos) durante 1 hora, manchas de transferencia se incubó a 4 ° C durante la noche con 0,2 mg /ml anti-SOX9 (clon AF3075; R & amp; D, Minneapolis, EE.UU.) o 1:1,000 c-MET (clon C12; Santa Cruz). Después del lavado, las transferencias se incubaron con 1:1,000 anti-cabra-HRP o anti-conejo-HRP (Dako, Glostrup, Dinamarca) durante 1 hora, se procesan usando BM quimioluminiscencia Blotting Substrato (Roche) y se cuantificaron con el programa ImageJ.
MTT y ensayos de adhesión celular
5.0 × 10
3 DU145 células fueron estimuladas en placas de 96 pocillos con 25 ng HGF /ml durante 0, 3 y 6 días. Los cultivos se incubaron con tiazolilo bromuro de tetrazolio azul (MTT 5 mg /ml; Applichem, Darmstadt, Alemania) durante 4 horas, después de lo cual el producto metabólico se suspendió en 100 l tamponadas DMSO y se mide a 570 nm con un lector 550 de microplacas BIO-RAD (Biorad). Para la cuantificación de la adhesión celular, 3,0 × 10
5 estimulado DU145 células se sembraron en placas de 12 pocillos recubiertos con colágeno I (Becton Dickinson Labware, Bedford, Reino Unido). Después de la adhesión de 15 min., Las placas se lavaron, se incubaron con 1 ml de medio de DCC que contiene 5 mg /ml MTT y se determinó la densidad óptica.
infección Lentiviral
células HEK 293T se sembraron en matraces recubiertos con 0,1% de gelatina /PBS y se dejaron crecer a 50 hasta 60% de confluencia. partículas lentivirales se produjeron después de la transfección de células HEK 293T con 20 mg de ADN del vector (shRNA pLKO.1, ID167, clon NM_000245.x-502s1c1; Sigma) junto con 15 g pPAX
2 y 6 mg pMD
2G se añadió usando CaPO
4 precipitación, después de lo cual dH
2O, 2,5 M CaCl
2 y HEPES solución salina tamponada (pH 7,05). La mezcla de transfección se dejó incubar durante 20 a 30 min. a temperatura ambiente antes de que se añadió a las células HEK 293T. Los sobrenadantes de cultivo celular que contiene lentivirus shRNA se recogieron 24 y 48 horas después de la transfección, y se pasan a través de un filtro de 0,45-micras. Para determinar la eficiencia de transfección de células HEK 293T fueron transfectadas simultáneamente con la proteína verde fluorescente (GFP). Revueltos shRNA (Sigma) se utilizó como control. a continuación, DU145 estaba infectado con el virus recogido (1:01) durante la noche y los clones infectados se seleccionaron mediante clonación por dilución.
inyección ortotópico
1.0 × 10
se inyectaron 5 DU145 células en el lóbulo dorsolateral del nu /nu Naval Medical Research Institute (NMRI) junto ratones macho con 1,0 × 10
6 PRSC fibroblastos de próstata en 20 l de medio RPMI /DCC contiene HGF humano (25 ng /ml) [25]. Las inyecciones se realizaron con una aguja 30G Microlance (Becton Dickinson, Alphen a d Rijn /, Países Bajos) en una punta Luer 700 microlitros jeringa (Hamilton, Bonaduz, Switserland) después de la incisión abdominal bajo anestesia. El volumen del tumor (TV) se controló cada semana mediante ultrasonografía transrectal (Endosonics Europe BV, Rijswijk, Países Bajos). Los ratones fueron sacrificados a una TV & gt; 1000 mm
3 o después de 3-4 meses. La próstata se analizó histológicamente junto con los ganglios linfáticos abdominales y pulmones.
La inmunohistoquímica
La inmunohistoquímica para c-MET se llevó a cabo en 94 prostatectomías radicales, incluidos en parafina fijado en formol (RP). Las secciones de 4 micras se dewaxed y rehidratada utilizando xileno y etanol. peroxidasa endógena se inactivó y la recuperación de antígenos se realizó durante 15 min. de irradiación de microondas (700 W) en Tris-EDTA (pH = 9). Los portaobjetos se incubaron con anticuerpo de conejo anti-humano c-MET (1:100; C12; Santa Cruz) durante la noche a 4 ° C y se visualizó usando el sistema EnVision (DAKO). Para la cuantificación de c-MET, la presencia de células fuertemente positivas se anotó en el perímetro, arbitrariamente definida como la exterior 2 mm del tumor y en comparación con el centro.
Para los estudios de co-localización, 6 N líquida
2 toboganes RP congeladas fueron fijado con acetona y se incubaron con anti-c-MET (1:100), y CD49b de ratón anti-humano (1:100; HAS-3; Abcam) o rata CD49f anti-humana (1 :100; Abcam) durante la noche a 4 ° C. Después del lavado, los portaobjetos se incubaron con biogenin porcina anti-conejo (1:150; DAKO). Combinado con anti-ratón o anticuerpo anti-rata marcada con Alexa 488 (1:100) durante 30 min, seguido de avidina-Cy3 (1 :100) la formación del complejo de 30 min. a temperatura ambiente.
Estadísticas
efectos de crecimiento de los fibroblastos gingivales como los inhibidores de c-MET se evaluaron con el estudiante de
t-test
. Expresión inmunohistoquímica de c-MET en RP fue analizada con Pearson χ
2 test. la formación del tumor en ratones se evaluaron usando ambas pruebas, todo con el programa SPSS versión 15.0 (SPSS Inc., IL, EE.UU.). Un valor de p de dos lados por debajo de 0,05 fue considerado significativo.
Resultados
Descubrimiento de HGF /c-MET genes
Anterior RT-PCR y Northern blot análisis demostró regulada que c-MET se expresa en líneas celulares de cáncer de próstata independientes de andrógenos DU145 y PC3, pero no en LNCaP dependiente de andrógenos [18], [20]. La estimulación de DU145 con HGF resultó en la dispersión y la migración celular en 2D-cultivo (Figura 1A), mientras que los brotes estrelladas se forman en matrices 3D Matrigel (Figura 1B). Durante la dispersión, las células DU145 obtenga una forma de huso en contraste con su forma epitelioide normal, mientras que el crecimiento celular se inhibió en un 21% después de 3 días (p & lt; 0,003) y 10% después de 6 días (p = 0,024) (Figura 1C). Aunque posee PC3 c-MET proteína, la estimulación de HGF no indujo cambios morfológicos (observaciones no publicadas) supuestamente debido a su falta de un complejo funcional α-catenina /E-cadherina [26].
, el HGF inducida por la transformación de los grupos de células epitelioides hacia células fusiformes individuales en la cultura de 2 dimensiones.
B Opiniones, en 3 dimensiones Matrigel brotes se originaron a partir de nódulos celulares compactos después de la estimulación de HGF.
C
, la proliferación celular se inhibe en un 21% (p & lt; 0,003) después de 3 días y 10% (p = 0,024) después de 6 días de estimulación HGF (control
barras negras
-; HGF
barras grises
+).
Un
,
B Opiniones magnificación × 40 original.
Para explorar las vías moleculares relevantes para la función de c-MET en el cáncer de próstata, se realizó un análisis de microarrays de expresión de células DU145 estimularon con HGF. Los genes fueron seleccionados sobre la base de un doble arriba o hacia abajo-regulación por parte de al menos una sonda puesta a punto en el tiempo las 24 horas y un promedio de expresión con una diferencia de 1,41 veces. En total, 371 genes cumplen estos criterios de los cuales 238 fueron hacia arriba y hacia abajo 133-regulada por HGF (Tabla S2); los genes top 20 arriba y hacia abajo-regulados se representan en la figura 2A.
Un
, Top 20 arriba y abajo de los genes regulados después de la estimulación de HGF durante 24 horas, combinado con el gen respectivo perfiles-expresión después de la estimulación para 2 y 8 horas. .
B Opiniones, Efecto de HGF en los genes asociados con el fenotipo de células madre de la próstata
Hemos encontrado que diversos marcadores membranosas utilizados para la selección de células madre se han mejorado después de 24 horas: α
2-integrina /CD49b, α
6-integrina /CD49f y CD44, mientras que CD24 se regula hacia abajo (Figura 2B). El factor de transcripción SOX9 también fue inducida por HGF. Se requiere SOX9 para la diferenciación temprana de epitelio prostático durante la embriogénesis y se reactiva en la carcinogénesis de próstata que implica una función relevante en células de la próstata inmaduros [27]. La expresión de otros dos marcadores de células madre putativa prostática CD133 y LGR5 estaba por debajo de los límites de detección [14], [28].
genes Validación del Reglamento fenotípica de tallo como la inducción de células
de células madre asociadas por la vía /c-MET HGF fue validado en tres experimentos independientes DU145 utilizando PCR cuantitativa. Un efecto regulador de HGF se demostró para todos los genes seleccionados (Figura 3). Después se reguló hacia abajo 24 horas de estimulación de CD24 (0,4 veces), mientras que CD49b (2,6 veces), CD49f (2,0 veces), CD44 (1,8 veces) y SOX9 (2,9 veces) fueron todos mejorada. Posteriormente, el análisis FACS confirmó la sobre regulación de las proteínas membranosas CD49b, CD49f, CD44, CD24 y represión del (Figura 4A). Los efectos sobre la expresión de la proteína fueron más prominentes para CD49b con un aumento general de 240%. expresión membranosa de CD49f y CD44 fue sólo ligeramente mejorado después de la estimulación de HGF (22% y 26%, resp.). Desde SOX9 se localiza en el núcleo, se realizó un análisis de Western blot para confirmar su regulación por HGF. Como era de esperar, la expresión de la proteína SOX9 se indujo fuertemente en las células DU145 estimulados hasta 521% después de 24 horas (Figura 4B).
Cuantitativa en tiempo real PCR confirmó la inducción de CD49b, CD49f, CD44 y mRNA SOX9, junto con la baja regulación de CD24.
Un
, FACS demostró la regulación de CD49b (240%), CD49f (22%), CD44 (26%), junto con baja regulación de CD24 (-69%) después de la estimulación de HGF. delgada línea gris representa el marcaje con anticuerpo secundario solamente (control negativo), DU145 línea de negro delgado sin HGF, y línea gruesa negro DU145 con HGF.
B
, Western blot mostraron aumento de la expresión SOX9 a la estimulación de HGF de 2 a 24 horas.
C
, FACS demostró la inducción de doble etiquetado CD44
+ /CD24
- células DU145 (de control 8%
frente
HGF 26%) guía empresas.
Tanto CD44
+ /CD24
- y α
2β
1-integrina
+ /CD133
+ perfiles de seleccionar las células madre-como en el cáncer de próstata [4] , [14]. Tras la estimulación de HGF, el CD44
+ /CD24
- población se enriqueció 3,25 veces (del 8% al 26%) en combinación con una disminución de 0,8 veces (de 91% a 73%) de CD44 más madura
+ /CD24
+ células (Figura 4C). La selección para α
2β
1-integrina
+ /CD133
+ células se dedican con frecuencia en un primer momento por la adherencia a corto plazo para colágeno I Matrix, que selecciona las células de alto integrina expresar [3] . Para verificar si la activación de c-MET aumenta la fracción de unir rápidamente las células inmaduras, se cuantificó la adhesión al colágeno I después de 15 minutos. Dentro de este período, 0,037% (media; SD 0,006%) de las células de control unidos a colágeno I. activación HGF de células DU145 significativamente (p & lt; 0,01) enriquecido para adherirse rápidamente las células (media 0,055%; SD 0,011%). Con el análisis FACS, la expresión de CD133 en DU145 estaba por debajo de los límites de detección y no se ve afectado por la estimulación de HGF (datos no mostrados).
HGF activa vía de Notch
señalización Notch desempeña un papel importante en el desarrollo de la próstata y se ha implicado en la función CSC [29] - [31]. El análisis del perfil de expresión de genes demostró la sobreexpresión (3,0 x) del objetivo Notch aguas abajo HES-1 a la estimulación de HGF. Por lo tanto, se investigaron los efectos de HGF en los receptores Notch y sus ligandos. Se encontró que la activación de c-MET llevó a la sobre regulación de ligandos Notch Jagged-1 y Delta-como (DLL) 4 (Figura 5). El ligando Jagged-2, los receptores Notch-2 y Notch-3 no se vieron afectadas, mientras que Notch-1 receptor fue regulada hacia abajo a la estimulación de HGF (datos no presentados), lo que implica que la activación Notch resultado de la sobre expresión de ligandos dentados-1 y DLL-4.
estimulación HGF llevó a la sobre-expresión de Notch ligandos Jagged-1 y dll-4 ARN, y la muesca diana aguas abajo HES-1.
Inhibidores de c-MET desarrollo del bloque del fenotipo de tallo similares.
el reconocimiento de células inmaduras en tumores malignos humanos desarrollo de agentes farmacéuticos específicos dirigidos a este biológicamente importante población iniciados. Las moléculas pequeñas y SU11274 PHA665752, que inhiban la actividad enzimática de c-MET bloquearon completamente la dispersión de células en cultivo y la formación de brotes estrelladas en Matrigel (datos no mostrados) [32], [33]. la reducción del crecimiento mediada por HGF fue revertido significativamente al nivel de la línea base (p & lt; 0,001) por PHA665752, pero no por SU11274 (p = 0,186) (Figura 6A). SU11274 (p & lt; 0,001) y PHA665752 (p = 0,016) revertido significativamente tanto la inducción de CD49b (Figura 6B), así como la inhibición de CD24 (ambos p & lt; 0,001) dentro de las 24 horas (Figura 6C). Debido a HGF sólo moderadamente afectados los niveles CD49f y CD44, no se evaluaron los efectos farmacológicos sobre estos marcadores.
Un
, la proliferación celular se inhibe por SU11274 tanto en el control (
barras negras
-) y HGF células estimuladas (
barras grises
+), de modo que no invirtió HGF reducción del crecimiento mediada (p = 0,186). PHA665752 no afectó a la proliferación celular en las células de control, y bloquea la inhibición del crecimiento inducida por HGF (p & lt; 0,001).
B Opiniones,
C
, Tanto SU11274 y PHA665752 bloquearon HGF mediada por la inducción de CD49b (
B Opiniones) y la inhibición de CD24 (
C
). Las desviaciones estándar representan tres experimentos independientes.
La expresión de c-MET-tumoral eficaz modula la formación de
in vivo
Para analizar el papel de c-MET en el tumor -Formación
in vivo
, se infectaron células DU145 con lentivirus que expresan shRNA dirigido a un receptor c-MET y seleccionaron tres clones de c-Met negativos (Figura 7A). Los clones DU145 negativo c-MET tenían morfología similar a la línea parental, cuando crecen en cultivo 2D o 3D, pero no reaccionaron a HGF por la dispersión o la formación de brotes estrelladas (datos no mostrados). inyección ortotópico de parental DU145 resultó en 90% (9/10) la formación de tumores; estos ratones fueron sacrificados con una televisión de 1.357 mm
3 (media, rango de 1016 a 1860 mm
3) después de 42,6 días (media, rango 38-52 días). Control de las células DU145 infectadas con shRNA revueltos condujeron a la formación de tumores en el 100% (5/5). Estos ratones se sacrificaron todo debido a la gran televisión después de 59 días (media, rango 52-66 días) (Figura 7B). reducción significativa de la formación de tumores se produjo en los clones DU145 con silenciada c-MET. En total el 55% (11/20) de los clones (6/10 Sh167#14, 3/5 Sh167#5 y 2/5 Sh167#6) dio lugar a tumores, de los cuales sólo uno fue sacrificado debido a la gran TV ( 1013 mm
3; 81 días). Quince ratones fueron sacrificados a 119 días (media, rango 109-124 días), de los cuales 6 tenían tumores pequeños (media de TV 477 mm
3; intervalo de 137 a 788 mm
3). Cuatro ratones murieron prematura entre los 52 y los 102 días todos los pequeños tumores que muestran (TV significan 225 mm
3; intervalo de 137 a 304 mm
3) (Figura 7C). En ninguna de las metástasis ratones fueron observados. Tomados en conjunto, funcional c-MET mediada la formación de tumores eficientes en DU145 parental (p & lt; 0,02) y dio lugar a tumores significativamente más grandes en las células de control DU145 (p & lt; 0,001).
Un
, tres clones DU145 (5, 6, 14) con baja para expresión de la proteína c-MET negativo (Western blot) se generaron por la infección estable shRNA.
B Opiniones, inyección ortotópico de 1,0 × 10
5 DU145 con funcionales c-MET dio lugar a la formación de tumores eficientes en 9/10 (
negro
) y 5/5 DU145 de control parental células (
verde
) infectados con ARN codificado.
C
, tumor ortotópico formación se redujo significativamente en DU145 con baja expresión de c-MET. Un total de 6/10 DU145Sh167#14 (
negro
), 3/5 DU145Sh167#5 (
verde
) y 2/5 DU145Sh167#6 (
rojo
) inyecciones dieron lugar a tumor-formación. Sólo un tumor alcanzó un televisor de 1000 mm
3 durante el período de estudio de 52-124 días.
Las células que expresan c-MET se encuentran en frente invasivo del cáncer de próstata.
las células tumorales con alta expresión de c-MET se enriquecen específicamente en la parte delantera invasiva de los carcinomas colorrectales, donde median la EMT, la migración y la invasión de la matriz [34], [35]. Para determinar la expresión de c-MET en la parte delantera invasiva en el cáncer de próstata, se comparó la presencia de células que expresan c-MET de alta en el perímetro y el centro de la pieza de PR bien fijos-(N = 94). En general alta c-MET que expresan las células (Figura 8A) se encontraron en 37 casos (39,4%). El perímetro contenía más alta c-MET células que el centro del tumor en 27 casos (73,0%) que expresa. En 6 casos (16,2%) de estas células fueron más abundantes en el centro, mientras que en 4 de RP (10,8%) no hubo diferencia en la expresión (Pearson χ
2; p & lt; 0,001). La expresión de c-MET en células basales benignos preexistentes dentro de todo el portaobjetos sirvió como un control interno para excluir artefactos de tinción de fijación inducida. Un total de 25 casos reveló la expansión del tumor en el tejido adiposo extra-prostática; en 10 áreas tumorales extra-prostática (40,0%) se encontraron células que expresan altos c-MET (Figura 8B).
c-MET es altamente expresado en células de cáncer de próstata dispersos (
Un
) , y en particular en los frentes de invasoras en el tejido graso peri-prostático (
B Opiniones); puntas de flecha indican las células positivas. aumento original × 100.
Por último, se realizaron estudios de co-expresión en la pieza de PR para validar c-MET co-expresión con marcadores de células madre similares en los pacientes. tinciones de inmunofluorescencia para c-MET, CD49b y CD49f demostraron la expresión difusa de todos los marcadores en las células basales de las glándulas preexistentes. La expresión fue baja y ausente en la gran mayoría de las células luminales normales y malignas. Receptor c-MET se expresó de forma esporádica a niveles elevados en células malignas individuales. Estas células co-expresan CD49b y CD49f, lo que indica que las células c-MET positivos de hecho co-expresan un fenotipo de células madre como en el cáncer de próstata humano (Figura 9).
inmunofluorescencia doble etiquetado de c-MET ( Cy3; rojo) con CD49b o CD49f (Alexa 488; verde). Co-expresión de c-MET tanto con CD49b y CD49f estaba presente en las células del cáncer de próstata dispersos (
flechas
). aumento original × 100.
Discusión
Por lo menos tres diferentes poblaciones celulares pueden ser discriminados en el cáncer de próstata humano. Mientras que las células exocrinas y neuroendocrinos diferenciados representan los tipos de células predominantes, la evidencia está aumentando que una población menor de células inmaduras es determinante para el comportamiento biológico del cáncer de próstata. Analógica a epitelio glandular de la próstata normales, Collins et al. madre inmaduras distinguido (α
2β
1-integrina
+ /CD133
+) y células de tránsito de amplificación (α
2β
1-integrina
+ /CD133
-) en las muestras de cáncer de próstata humano por la capacidad clonogénico, proliferativa y de diferenciación
in vitro
[14]. Aunque CD133 es propuesto como un marcador general para las células progenitoras del tumor, su especificidad para las células madre tumorales reales sigue siendo objeto de debate [10] - [12], [14], [36], [37]. En el cáncer de colon, por ejemplo, se ha propuesto que la CD44
+ /CD24
- /CD133
- perfil representa la población de células madre tumor mientras CD133
+ en lugar marcas de células más diferenciadas [38