Extracto
Durante la última década, la creciente evidencia ha implicado al virus JC virus neurotrópico humano en la patología del cáncer de colon. Sin embargo, los mecanismos de JC oncogénesis mediada por virus todavía no están totalmente determinadas. Uno de los candidatos para mediar estos efectos es la viral temprana producto transcripcional del antígeno T, que tiene la capacidad de inactivar las proteínas reguladoras del ciclo celular tales como p53. En los meduloblastomas, antígeno T se ha demostrado que obligar a la proteína Wnt vía de señalización de β-catenina; sin embargo, los efectos de esta interacción en las proteínas reguladoras del ciclo celular aguas abajo siguen siendo desconocidos. A la luz de estas observaciones, se investigó la asociación de antígeno T y β-catenina nuclear en los casos de cáncer de colon y de los efectos de este complejo en la activación de la transcripción y el ciclo celular reguladores c-myc y ciclina D1
in vitro
. La amplificación génica ha demostrado la presencia de secuencias virales en 82.4% de los casos y que detecta la expresión del antígeno T en 64.6% de los casos por inmunohistoquímica. Además, se encontró que el antígeno T de β-catenina y co-localizados en los núcleos de las células tumorales y se confirmó la unión física entre estas dos proteínas
in vitro
. La presencia nuclear de antígeno T y β-catenina como resultado la mejora significativa de la actividad promotora TCF-dependiente y la activación de los objetivos de abajo β-catenina, c-Myc y ciclina D1. Estas observaciones proporcionan una prueba para un papel de la JCV T antígeno en la desregulación de la vía de señalización Wnt y en la patogénesis del cáncer de colon
Visto:. Ripple MJ, Parker Struckhoff A, Trillo-J Tinoco, Li L, Margolin DA, McGoey R, et al. (2014) La activación de c-myc y ciclina D1 por JCV T antígeno y β-catenina en cáncer de colon. PLoS ONE 9 (9): e106257. doi: 10.1371 /journal.pone.0106257
Editor: Shao-Jun Tang, Universidad de Texas Medical Branch, Estados Unidos de América
Recibido: 10 de mayo de 2014; Aceptado: July 30, 2014; Publicado: 17 Septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Ripple et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue posible gracias a la concesión de RR021970 P20 de los Institutos Nacionales de Salud, a LDV. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma colorrectal (CRC) sigue siendo un grave problema de salud en todo el mundo a pesar de los avances en el diagnóstico y el tratamiento. Ocupa el tercer lugar en la incidencia de cáncer en general y es la segunda causa más común de mortalidad por cáncer en los Estados Unidos, donde se estima que hay 140.000 nuevos casos y 50.000 muertes relacionadas con el CRC cada año [1]. El riesgo de desarrollar cáncer de colon esporádico en la población general es del 5%, pero esta incidencia aumenta con la edad, debido a la acumulación de alteraciones genéticas y epigenéticas [2]. Algunas de estas alteraciones pueden ser causados por factores ambientales, incluyendo virus, que han sido implicados en varios otros tipos de cáncer. Varios estudios independientes han establecido que aproximadamente el 20% de todos los cánceres son causados por agentes infecciosos [3], [4]. Uno de estos agentes es la neurotrópico humano virus JC (JCV), un miembro de la
Polyomaviridiae
familia, que también incluye SV-40, el virus BK (BKV) y el recientemente descubierto de la célula de Merkel poliomavirus (MCPyV), encontraron para ser integrado por clonación en un alto porcentaje de carcinomas de células de Merkel. JCV se ha establecido como el agente causal de la leucoencefalopatía multifocal progresiva (LMP), una enfermedad desmielinizante que afecta a los pacientes con VIH [5], y más recientemente en los pacientes sometidos a terapia inmunomoduladora [6]. Durante la última década, varios laboratorios han demostrado que JCV está asociada con varios cánceres humanos, incluyendo tumores cerebrales [7], [8], cáncer de pulmón [9], y tumores malignos de las vías digestivas superior e inferior [10] - [12 ].
JCV es un virus ubicuo que infecta a una gran proporción de la población en general. De acuerdo con estudios seroepidemiológicos, infección primaria por el virus JC se produce en la primera infancia y más de un 70-90% de los adultos son positivos para anticuerpos contra el virus JC [13], [14]. Aunque la infección primaria es asintomática, la ruta propuesta de transmisión es a través del tracto respiratorio, después de lo cual JCV establece una infección latente en el riñón. En aproximadamente el 30% de los individuos seropositivos sanos, JCV se elimina en la orina en condiciones normales [15], [16]. Como resultado, las partículas JCV intactas se han aislado a partir de muestras de aguas residuales urbanas en bruto de todo el mundo [17], [18], que junto con el hallazgo de ADN viral en las células epiteliales de la parte superior e inferior tracto digestivo [19], sugiere un punto de entrada para el virus a través del tracto gastrointestinal a través de la exposición al agua o alimentos contaminados adicional. Es importante destacar que, Bofill-mas,
et al
mostraron que las partículas virales aisladas a partir de las aguas residuales se mantuvo intacta después del tratamiento a un pH de 1 durante 30 minutos, lo que indica que la ingestión de agua o alimentos contaminados, puede ser suficiente para la infección de la JCV tracto gastrointestinal [20]. Muchos estudios ya que, han demostrado la presencia de secuencias genómicas JCV y la expresión de antígeno T en los tejidos de los tumores gastrointestinales, incluyendo carcinoma de esófago [11], carcinoma gástrico [12], [21], [22], pólipos adenomatosos esporádicos [ ,,,0],23], y los adenocarcinomas colorrectales [10], [24] - [30]
el genoma del virus JC es de aproximadamente 5,2 kb de tamaño y se puede dividir en tres regiones:. la región genómica viral temprana (EVGR), la región tardía viral genómico (LVGR), y la región de control no codificante (NCCR), que contiene el origen de replicación, y está situado entre principios y finales de regiones genómicas. El EVGR codifica una proteína oncogénica de gran alcance, antígeno T grande, mientras que el LVGR codifica las proteínas de la cápside viral VP1, VP2 y VP3, así como la agnoproteína, un pequeño accesorio de productos [31]. El modelo actual de la oncogénesis JCV mediada implica la integración de porciones del genoma JCV, en particular el gen del antígeno T, que se propone aumentar el riesgo de desarrollar cáncer debido a la expresión subsiguiente de T-antígeno. En apoyo de este modelo, Theodoropoulos
et al
mostró que la carga viral del virus JC fue de 10 a 50- veces más altos que en los adenomas y adenocarcinomas de colon en comparación con el tejido normal correspondiente [32]. Además, Coelho
et al
ha demostrado recientemente que el tejido CRC tiene una frecuencia relativa significativamente más alta de secuencias genómicas que JCV mucosa normal adyacente y mucosa normal distante [33].
Las capacidades de transformación de T JCV -Antigen
in vitro
son bien conocidos [34].
In vivo
T antígeno causa una variedad de tumores del sistema nervioso central cuando se inyecta en el cerebro de roedores y primates no humanos, que van desde los meduloblastomas a gliales tumores [35] - [37]. Los ratones transgénicos que expresan JCV T-antígeno de la NCCR desarrollar tumores de origen neuroectodérmico, incluyendo los meduloblastomas, tumores gliales, y tumores de la vaina nerviosa periférica malignos [38] - [40]. Este proceso de transformación se produce a través de la interacción de antígeno T con proteínas reguladoras del ciclo celular clave, incluyendo p53, Rb, y la molécula de señalización central en la vía de señalización Wnt, β-catenina [41] - [43].
β-catenina es a menudo dysregulated en el cáncer de colon [44], [45]. Los niveles de β-catenina están estrechamente controlados por la destrucción de su complejo, que consiste en las proteínas APC, Axin, GSK3, y CK1, que marcan que para la ubiquitinación. Las mutaciones en los componentes del complejo de destrucción puede resultar en la localización nuclear aberrante de β-catenina, un mecanismo bien establecido de la carcinogénesis en el cáncer colorrectal [44], [46], que conduce a la activación de Wnt genes diana vía en ausencia de la señalización de Wnt y resulta en la proliferación celular sin control [2]. Mientras que la vía Wnt está activada por mutaciones genéticas en más del 90% de los casos de cáncer de colon [47], la expresión de β-catenina nuclear sólo detectó en aproximadamente el 50% de los casos [48], lo que sugiere que hay factores adicionales que contribuyen a la nuclear localización de β-catenina en el cáncer de colon. Se ha demostrado que JCV T antígeno tiene la capacidad de unirse β-catenina a través de una interacción con el C-terminal de β-catenina [41], y que T antígeno puede estabilizar β-catenina en células de glioblastoma [49]. Además, el antígeno T tiene una señal de localización nuclear clásica (NLS) y se expresa fuertemente sobre todo en los núcleos de las células neoplásicas [10], [42], [50]. Por lo tanto, hemos tratado de determinar el efecto de la JCV T antígeno en la localización nuclear de β-catenina y el papel de este complejo en la activación de genes diana β-catenina como un mecanismo en el desarrollo y progresión del cáncer de colon.
en el estudio actual, se mide la prevalencia de secuencias genómicas antígeno T y expresión de proteínas en los tejidos de cáncer de colon humano usando una colección de muestras de biopsia bien caracterizados. Es importante destacar, que demuestran una asociación de antígeno T y β-catenina nuclear en muestras de cáncer de colon humano y ampliar esta asociación por elucidar los efectos moleculares de esta interacción en la desregulación de la cascada de señalización Wnt y la activación de los objetivos de β-catenina usando líneas celulares de cáncer de colon.
Materiales y Métodos
muestras clínicas
Un total de 113 muestras incluidas en parafina de-identificados de carcinoma colorrectal y pólipos pre-neoplásicas se obtuvieron de los archivos de patología de las siguientes instituciones: LSUHSC-Nueva Orleans (34 muestras) y la Clínica Ochsner (79 muestras). Los tumores eran eran histológicamente clasificados y caracterizados por inmunohistoquímica de acuerdo con la clasificación de la OMS de los tumores del tracto gastrointestinal.
Extracción de ADN y análisis
Un microtomo dedicado se utiliza para la sección de los bloques de parafina con el fin de evitar la contaminación. Además, el bloque de soporte de la hoja y se trataron en autoclave periódicamente, y se utilizó un nuevo, la cuchilla desechable para cada muestra. Se extrajo ADN de aproximadamente 10 secciones de 10 micras de grosor de cada una de las muestras de tejido utilizando el Kit QIAamp Tissue, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen). la amplificación por PCR del gen del antígeno T se realizó usando pep1 y PEP2 cebadores (nucleótidos 4255-4272 y 4408-4427, respectivamente), que amplifican secuencias en la región N-terminal de JCV antígeno T (secuencia PEP1: AGTCTTTAGGGTCTTCTACC; secuencia de PEP2 : AGGTGCCAACCTATGGAACA). Para la amplificación de la región de control (CR), se utilizaron los cebadores NCRR1 y NCRR2, correspondiente a los nucleótidos 4993-5004 y 258-279, respectivamente (secuencia NCRR1: GCAAAAAAGCGAAAAACAAGGG; secuencia NCRR2: CAGAAGCCTTACGTGACAGCTGG). La amplificación se llevó a cabo en 250 ng de ADN molde con el sistema FailSafe PCR (Epicentre) en un volumen total de 25 l. PCR se llevó a cabo en las siguientes condiciones: desnaturalización a 95 ° C durante 10 min, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 15 s, hibridación a 62 ° C durante 30 s, y extensión a 72 ° C durante 30 s. Como etapa de terminación, el tiempo de extensión del último ciclo se aumentó a 7 min. Las muestras amplificadas en ausencia de plantilla de ADN sirvieron como un control negativo, mientras que el ADN extraído de células BSB8 positivo T antígeno se utilizó como control positivo para cada procedimiento. transferencia de Southern se realizó mediante la resolución de 10 l de cada reacción PCR en un gel de agarosa al 2%. El gel se trató a continuación durante 15 min cada una con HCl 0,2 M para la despurinización, 1,5 M NaCl /NaOH 0,5 M para la desnaturalización, y 1,5 M NaCl /0,5 M Tris-HCl (pH 7,4) para la neutralización, seguida de la transferencia de los fragmentos amplificados desde el gel a membranas de nylon (Hybond-N; Amersham). Las membranas fueron pre-hibridan durante 1 h en solución EasyHyb (Roche), seguido de hibridación en la misma solución que contiene 2 g de oligonucleótido marcado con DIG específico para JCV antígeno T (nucleótidos 4.304-4.405) durante la noche. Los cebadores utilizados para la síntesis de la sonda marcada con DIG son PEP INT 1 (TTGGGATCCTGTGTTTTCATC) y PEP INT 2 (AATGGGAATCCTGGTGGAAT). Para la sonda CR se utilizó cebadores de nucleótidos 62-81. Las sondas fueron sintetizados mediante el etiquetado y detección de ADN Kit DIG (Roche). Las membranas se hibridaron durante la noche, se lavaron y se desarrollaron usando el DIG Lavar y almacenador intermediario del bloque Set siguiendo las instrucciones del fabricante (Roche).
secuenciación del ADN de la región de control se realizó a través de ABI Prism 3730x /analizador de ADN. Para la amplificación de ADN del gen de limpieza, GAPDH, se utilizaron los siguientes cebadores:.
5 'TTC TCC CCATTC CGT CTT CC 3' y 3 'GTA CAT GGT ATT CAC CAC CC 5'
histológico e inmunohistoquímico Análisis
parafina embebido previamente fijadas en 10% formalina tamponada se seccionó con un espesor de 4 micras y montados en portaobjetos cargados. Las secciones se colocan en un horno a 65 ° C para fundir la parafina y luego desparafinaron en tres cambios de xileno durante 30 min cada uno. Las secciones fueron rehidratadas a través de una serie graduada de alcoholes de hasta el agua, y la recuperación de antígeno no enzimática se llevó a cabo en citrato de sodio 0,01 M (pH 6,0) a 97 ° C en un horno de vacío durante 35 min. Después de un período de enfriamiento de 25 min, las secciones se aclararon con PBS, y la peroxidasa endógena se inactivó mediante la incubación de los portaobjetos en metanol /3% H
2O
2 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se bloquearon en suero de caballo al 2% y se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios a temperatura ambiente en una cámara humidificada. Los anticuerpos utilizados para detectar las proteínas virales incluyen un anticuerpo monoclonal de ratón contra SV40 antígeno T grande que reacciona de forma cruzada con JCV antígeno T (clon pAb416, 1:100 dilución; Calbiochem) y un anticuerpo monoclonal de ratón anti-β-catenina (clon E -5, 1:100 dilución, Santa Cruz Biotechnology). Después de enjuagar las secciones en PBS, los portaobjetos se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios anti-ratón biotinilados y, a continuación, se enjuagaron en PBS. El tejido se incubó posteriormente con complejos de avidina-biotina-peroxidasa durante 1 hora a temperatura ambiente de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Vector Laboratories), y por último, las secciones se desarrollaron con un sustrato de 3,3'-diaminobencidina (Sigma), a contratinción con hematoxilina y coverslipped con Permount (Fisher). Para evaluar la fracción de células inmunomarcadas en especímenes de cada caso paciente, el índice de marcaje define como el porcentaje de células positivas del número total de células tumorales se determinó contado.
doble etiquetado de inmunofluorescencia
Por inmunofluorescencia y el doble etiquetado de las secciones embebidas en parafina, de desparafinación, recuperación de antígeno, enfriamiento rápido de la peroxidasa endógena y el bloqueo se realizaron como se ha descrito anteriormente. Para el doble etiquetado de inmunofluorescencia de las células HCT116 en cultivo, las células se lavaron con PBS, se fijaron en acetona fría, y se bloquearon en PBS que contenía 5% de suero de caballo y 0,1% de BSA durante 2 h. Las secciones o células se incubaron con el ratón anti-T-antígeno anticuerpo (clon pAb416, 1:100 dilución, Oncogene Science) y el anticuerpo anti-β-catenina de conejo (D13A1 clon, 1:100 dilución Cell Signaling) durante 16 horas seguido de lavado en PBS y la incubación en anticuerpo anti-ratón de rodamina y anti-conejo anticuerpo de fluoresceína (1:200 dilución; vector Laboratories). Por último, las secciones se lavaron en PBS y se montaron en medio de montaje acuoso con DAPI (Vector Laboratories), y se visualizaron en un microscopio confocal (Olympus FV1000).
transfección transitoria y Luciferase construye
células HCT116 fueron amablemente proporcionados por el Dr. Hamid Boulares. Las células se transfectaron usando Xtreme Gen-HP (Roche). Las siguientes construcciones se utilizaron para ensayos de luciferasa: M72 Súper 16x TOPflash reportero construir: Addgene plásmido 17165; M51 Súper 8x FOPFLASH: Addgene plásmido 12457; promotor de c-Myc: Addgene plásmido 16595; Ciclina D1 promotor: plásmido Addgene 32727. Estas construcciones indicadoras se transfectaron solo o junto con pcDNA-T-antígeno y /o pcDNA-β-catenina y se ensayó para la actividad de luciferasa usando un sistema de ensayo de luciferasa (Promega) a las 24 horas después de la transfección.
extracción de proteínas, co-inmunoprecipitación y análisis
citoplasmática y extractos de proteínas nucleares de células HCT116 se recogieron en el uso de tampón de lisis citoplasmática y nuclear de tampón de lisis como se describe anteriormente [51]. Brevemente, las células se tripsinizaron, sedimentaron a 2000 g durante 5 minutos, y se resuspendieron en 500 ul de tampón de lisis citoplásmica durante 10 minutos en hielo. Después de la lisis de la membrana celular, los núcleos se sedimentaron a 14.000 g durante 10 minutos. Los núcleos se lavaron una vez en tampón de lisis citoplásmica, se sedimentaron y se lisaron en tampón de lisis 250 ul nuclear durante 20 minutos a 4 ° C con agitación. 500 mg de extracto de proteína total se incubó con 10 g anti-T-antígeno o anticuerpo anti-β-catenina durante la noche a 4 ° C con agitación. Los complejos antígeno-anticuerpo fueron entonces inmunoprecipitaron con /G cuentas de Proteína A magnéticos (Pierce), se lavó en tampón HNTG (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, 10% de glicerol, 0,1% Triton X-100), desnaturalizado y se analizaron por SDS-PAGE .
Declaración de Ética
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las directrices y la aprobación de la Junta de Revisión Institucional de la Universidad del Estado de Louisiana. Las 113 muestras humanas en parafina de carcinomas colorrectales y pólipos pre-neoplásicas, que fueron recogidos de los archivos de patología de LSUHSC Nueva Orleans (34 muestras) y la Clínica Ochsner (79 muestras). La Junta de Revisión Institucional de la Universidad Estatal de Louisiana (IRB) renunció a la necesidad de consentimiento por escrito, ya que las muestras son de archivo, sin identificación y seguimiento bajo las directrices del NIH para la exención como el tejido que serían descartados y no se remontan a los pacientes (Protocolo IRB#8077).
resultados
La expresión del antígeno T y β-catenina en las muestras de cáncer de colon
El producto de la transcripción temprana del virus JC, T-antígeno, es un pozo -conocido proteína oncogénica potente, que ha sido detectado en una variedad de tumores. Con el fin de establecer la presencia de virus JC T antígeno, hemos realizado experimentos de inmunohistoquímica en un total de 113 casos fijados en formalina, incluidos en parafina de cáncer de colon a partir del 2 de Nueva Orleans instituciones médicas más grandes. La mayoría de estas muestras contenían mucosa, pólipos pre-neoplásicas y normales tanto
In situ Opiniones y carcinoma invasivo. Encontramos expresión de antígeno T por inmunohistoquímica en los núcleos de las células tumorales en 73 de las muestras (64,6%). Curiosamente, antígeno T también estaba presente en los núcleos de células epiteliales a partir de pólipos pre-neoplásicas, pero completamente ausente en el epitelio normal del colon (Figura 1, paneles de la izquierda).
La inmunohistoquímica en las zonas de epitelio del colon normal es negativo para el antígeno T, mientras que β-catenina se expresa en el citoplasma y la membrana (Paneles y B). la expresión del antígeno T se encuentra en los núcleos de las células epiteliales en los pólipos y las células neoplásicas en áreas de tumor invasivo (Paneles C y E, respectivamente). secciones consecutivas de los mismos casos muestran que β-catenina se encuentra ahora en el citoplasma y núcleos de las células epiteliales y tumorales (Paneles D y F, respectivamente). En el antígeno T de casos negativos sin embargo, β-catenina permanece en el citoplasma (paneles G y H). El análisis estadístico revela que el 67,6% de los casos de cáncer de colon positiva del antígeno T expresan β-catenina nuclear, mientras que sólo el 40,4% de los casos negativos expresan el antígeno T de β-catenina nuclear (G; p = 0,006) (Grupo I). El porcentaje relativo de núcleos positivos para la β-catenina en una sección se puntuó en una escala de 0-4. T antígeno casos positivos mostraron significativamente más núcleos positivos para la β-catenina que las muestras negativas antígeno T (F; * p & lt; 0,05) (Grupo J). Doble inmunofluorescencia etiquetado demuestra la co-localización de antígeno T (rodamina) y β-catenina (fluoresceína) en los núcleos de las células neoplásicas en un bolsillo de células neoplásicas debajo de un revestimiento epitelial de células negativas antígeno T, en la que β-catenina sigue siendo cytoplamic (Grupo K). Aumento original de todos los paneles de inmunohistoquímica es 600x y 1000x es inmunofluorescencia.
Anteriormente, hemos demostrado que en los meduloblastomas, T antígeno es capaz de atar y físicamente translocan β-catenina, la molécula central de la vía de señalización Wnt, en el núcleo [45], [52]. Para determinar si β-catenina está presente y asociado con antígeno T en el cáncer de colon, se realizó inmunohistoquímica en las mismas 113 muestras y se analizaron la expresión de β-catenina nuclear en grupos T antígeno-positivos y negativos. Se encontró que de las 71 muestras de cáncer de colon en total positiva del antígeno T, 48 mostraron expresión nuclear de β-catenina (67,6%), mientras que sólo el 17/42 (40,5%) de las muestras negativas antígeno T fueron positivas para β-catenina nuclear (p≤0.005, Figura 1I). En todos los casos negativos antígeno T, β-catenina se mantuvo en el citoplasma. Curiosamente, las mismas observaciones estaban presentes en los pólipos, donde β-catenina nuclear correlacionada con la expresión del antígeno T. En la mucosa normal, β-catenina se mantuvo localizada a su ubicación habitual en el citoplasma y la membrana. β-catenina nuclear de células positivas se califica en una escala de 0-4, con una puntuación de 0 indica que ~ 5% o menos células y una puntuación de 4 indica ~ 75% o más células con β-catenina nuclear. muestras del antígeno T positivos tuvieron una puntuación media de 1.463 (1.164 SD) para β-catenina nuclear, mientras que las muestras negativas antígeno T tenían una puntuación media de 0,8182 (DE 0,9580; p = 0.05, Figura 1J).
Finalmente, se realizó inmunofluorescencia doble etiquetado en un caso positivo que contenía las tres áreas (colon normal, pólipos y cáncer) y se encontró que en el colon normal, donde el antígeno T es negativo, β-catenina se expresa en el citoplasma; Sin embargo, en los pólipos y las células neoplásicas, que expresan el antígeno T de, β-catenina es co-localización con la oncoproteína JCV en el compartimento nuclear. Figura 1, Panel K muestra un área que contiene epitelio normal en la parte superior, sin expresión de antígeno T y citoplásmica β-catenina, mientras que un bolsillo subyacente de células neoplásicas que robustamente expresan antígeno T muestran la co-localización nuclear de β catenina.
Detección del virus JC T antígeno secuencias genómicas en muestras de cáncer colorrectal
Para confirmar la presencia del gen del antígeno T, se realizó la amplificación por PCR seguida de transferencia de Southern usando una gran sonda específica y sensible para JCV T antígeno en un número seleccionado de 34 casos de cáncer de colon que contenían ADN de alta calidad. Se muestra una representación esquemática del genoma JCV, que contiene la localización de cebadores para la amplificación de transferencia de Southern y la síntesis de la sonda (Figura 2A). La región de reconocimiento de sonda en el genoma del virus JC (pares de bases 4304-4405) es altamente variable entre JCV, BKV y SV40, con 20 nucleótidos desajustes entre JCV y el virus BK, y 33 nucleótidos desajustes entre JCV y SV40 en esa región. Mientras que los cebadores y pep1 pEP2 amplifican tanto JCV y BKV T antígeno nuestra sonda de reconocimiento de la región entre el PEP1 y cebadores pEP2 es altamente específico para JCV y no se une a BKV o SV40 [53].
Un esquema la representación de la cepa Mad-1 de la estructura genómica JCV que muestra los genes virales en las transcripciones de color rojo, temprana y tardía en gris, y las localizaciones de los cebadores utilizados para la amplificación del antígeno T (PEP1 y PEP2) y la síntesis de la sonda de transferencia de Southern (PEP INT1 y PEP INT2) (Panel A). Las secuencias genómicas de la región temprana del virus, que codifica el antígeno T de, se detectaron en 28 de 34 muestras seleccionadas. Se presenta un Southern blot representativo, con el número de casos por encima de cada carril. Se observaron resultados negativos cuando los mismos casos se pusieron a prueba con sondas para BKV y SV40. Los controles negativos muestran los resultados de reacciones que contienen ningún ADN y el control positivo representa la amplificación de genes usando pBJC, un plásmido que contiene ADN JCV como plantilla o plásmidos que contienen BKV y T de SV40 antígenos. PCR para GAPDH y electroforesis en agarosa se utilizó para confirmar la presencia de ADN genómico intacto en todos los casos. (Panel B). transferencias Southern de plásmidos que contienen el antígeno T de JCV, BKV y SV40 se probaron con sondas específicas para cada poliomavirus, lo que demuestra la especificidad de las sondas (Panel C). Una transferencia de Southern representante de amplificación por PCR de la región reguladora de control se muestra (Panel D, izquierda). La secuenciación reveló la presencia de Mad-1 y Mad 4 cepas con mutaciones puntuales en las diferentes muestras. Una secuencia representativa se muestra en azul, por debajo de la secuencia conocida de la región CR Mad-4 (negro); mutaciones puntuales se destacan en rojo (panel D, derecha).
Estamos amplificado secuencias genómicas de la región codificante del antígeno T en 28 muestras de las 34 muestras (82,4%), 21 de los cuales demostraron T expresión de la proteína -Antigen por inmunohistoquímica. En sólo seis casos hemos encontrado la presencia de ADN viral, pero sin expresión de la proteína, y ninguno de los casos tenían expresión del antígeno T en ausencia de secuencias genómicas virales. Hemos probado las secuencias amplificadas con sondas específicas para BKV y SV40, dando como resultado negativo en todos los casos. ADN genómico de alta calidad se confirmó en cada muestra por PCR para GAPDH. (Figura 2B). Por último, también a prueba nuestras sondas con plásmidos que contienen T-antígenos del virus JC, BKV un SV40, corroborando la especificidad de nuestras sondas, y sugiriendo que la inmunohistoquímica revela el antígeno T del virus JC y no la de los otros poliomavirus (Figura 2C ).
a continuación, hemos realizado experimentos de PCR con cebadores y sondas específicas para la región reguladora de la JCV. Que amplifica secuencias virales en 14 de los 34 casos. La figura 2D muestra una transferencia Southern representativa que contiene uno de estos casos, que también fue positiva para la región T-antígeno. La secuenciación de estos amplicones reveló que Mad-1 y Mad-4 fueron los dos manchas detectadas de JCV. Sin embargo todas estas secuencias contenían mutaciones puntuales individuales, diferentes unos de otros, lo que sugiere que estos son de hecho único y descartando la posibilidad de contaminación de laboratorio. Una secuencia representativa se muestra en azul, por debajo de la secuencia de los conocimientos de la Mad 4 cepa del virus JC en negro. Las mutaciones puntuales se destacan en rojo (Figura 2D). Además, un resumen detallado de los casos y los resultados de la amplificación por PCR y la secuenciación, así como inmunohistoquímica se presentan en la Tabla 1.
T-antígeno y β-catenina co-localizar al núcleo en células de cáncer de colon y co-inmunoprecipitado
in vitro
los estudios anteriores sugieren que T antígeno y β-catenina interaccionan directamente alterando la localización subcelular citoplasmática normal de β-catenina. Con el fin de corroborar estos resultados
in vitro
y para determinar si el antígeno T y β-catenina están presentes en el mismo compartimento celular en células de cáncer de colon, se realizó inmunofluorescencia doble etiquetado para estas dos proteínas en el colon HCT116 línea celular de cáncer transfectadas transitoriamente con T-antígeno. Se encontró que las células que expresan el espectáculo oncoproteína una fuerte expresión nuclear de β-catenina (Figura 3D-E, flechas), mientras que en las células que no fueron transfectadas y no expresan el antígeno T de, β-catenina permanece en el citoplasma (Figura 3D-e, puntas de flecha).
inmunocitoquímica doble etiquetado para β-catenina (Panel B, fluoresceína), y T-antígeno (Panel C, rodamina), realizado en células de cáncer de colon HTC116 transfectadas transitoriamente con T-antígeno muestran la co-localización de ambas proteínas en el núcleo de la mayoría de las células (Panel E, flechas), mientras que en células en las que no hay expresión de antígeno T no transfectadas, β-catenina permanece exclusivamente en el citoplasma (Panel e, puntas de flecha).
Para definir con más precisión la localización subcelular de la interacción física entre el antígeno T y β-catenina, se realizó un co-immunoprecipiation de extractos nucleares y citoplasmáticos de las células HCT116 transfectadas con una T antígeno vector de expresión o vector vacío como control. lisados nucleares y citoplásmicos se incubaron con un anticuerpo anti-antígeno T y los inmunocomplejos se analizaron mediante Western blot con anticuerpos contra el antígeno T y β-catenina. inmunoprecipitados T antígeno del núcleo y el citoplasma programa de co-precipitación de β-catenina en los dos compartimentos (Figura 4A). Se confirmó esta interacción en el experimento inverso (β-catenina IP, T antígeno-occidental secante Figura 4B). La especificidad de las fracciones nucleares y citoplasmáticas se confirmó mediante el sondeo carriles de entrada para Grb-2 (citoplasmática) y la lamina A /C (nuclear).
células HCT116 transfectadas con T-antígeno o vector vacío se fraccionaron para aislar nuclear y compartimentos citoplasmáticos y se inmunoprecipitaron con un anticuerpo contra el antígeno T (A) o β-catenina (B). T antígeno tira hacia abajo β-catenina en el citoplasma (panel superior, carril 6) y en el núcleo (panel superior, carril 8). El experimento inverso (IP β-catenina) confirma la interacción entre el antígeno T y β-catenina en el citoplasma (panel inferior, carril 6) y el núcleo (panel inferior, carril 8).
T -Antigen activa TCF transcripción dependiente de
Tras la confirmación de que T-antígeno y β-catenina co-localizar e interactuar en el núcleo, que investigaron los efectos de esta interacción en la activación de genes diana β-catenina. Hemos utilizado el constructo indicador TOPflash para medir los cambios en la β-catenina /TCF mediada por la transcripción. El constructo TOPflash contiene 16 elementos de unión TVC (TBE) que dirige la expresión del gen de luciferasa. HCT116 células fueron transfectadas con TOPflash y, o bien antígeno T, β-catenina, o ambos antígeno T y β-catenina. La luminiscencia se midió en 24 horas después de la transfección. Todos los grupos se transfectaron por separado con FOPFLASH para medir la luminiscencia de línea de base. T-antígeno o β-catenina sola activan significativamente TOPflash por 2 veces y 5 veces por el control del vector vacío, respectivamente. Sorprendentemente, las células que expresan el antígeno T y exógenos β-catenina mostraron un aumento de 113 veces en la actividad TOPflash sobre la línea base (Figura 5A, p≤0.001). Estos datos demuestran la capacidad del antígeno T y β-catenina para activar sinérgicamente los promotores de los genes diana β-catenina. Los valores se normalizan a las células transfectadas con FOPFLASH.
células HCT116 fueron co-transfectadas con el plásmido reportero de Wnt vía TOPflash construir y antígeno T, β-catenina, o ambos. Las células transfectadas con T-antígeno o β-catenina sola aumento de la actividad TOPflash aproximadamente de 2 a 5 veces sobre la línea de base. La co-transfección con tanto antígeno T y β-catenina resultó en incremento de 113 veces en la actividad TOPflash. Los valores se normalizaron a FOPFLASH (línea de base) grupos (Panel A). Para medir la activación de objetivos específicos β-catenina, experimentos similares se llevaron a cabo usando construcciones de luciferasa que contienen el promotores de ciclina D1 (panel C) c-Myc (Panel B) o. La expresión de antígeno T aumenta significativamente c-Myc y Ciclina D1 actividad promotora en células HCT116.