Extracto
El mecanismo de ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de resistencia-necrosis tumoral (TRAIL) en células de cáncer no se entiende completamente. Aquí, se muestra que la vía de supervivencia Akt juega un papel importante en la resistencia TRAIL en células de cáncer humano. Específicamente, encontramos que el tratamiento TRAIL activa la vía de supervivencia Akt y que la inhibición de esta vía por el inhibidor de PI3K LY294002 o desmontables de Akt sensibiliza a las células de cáncer resistentes a TRAIL. Desde Akt está regulada negativamente por el supresor de tumores PTEN, se analizó la sensibilidad TRAIL en células epiteliales PTEN desmontables próstata del ratón y encontramos que PTEN
- /- las células son más resistentes que PTEN
+ células /+ mientras que la sensibilidad de PTEN
+/- células cayeron en el medio. Además, hemos demostrado que la sobreexpresión de un mutante PTEN confiere resistencia TRAIL en PTEN
células + /+, el apoyo a un papel de PTEN en la sensibilidad a TRAIL. En las células T47D de mama resistentes a TRAIL, la sobreexpresión del mutante PTEN aumenta aún más su resistencia a TRAIL. En conjunto, nuestros datos indican que la inactivación de PTEN funcional y la consiguiente activación de la vía Akt previene la apoptosis inducida por TRAIL, lo que conduce a la resistencia a TRAIL. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que la resistencia TRAIL puede ser superado por la orientación PTEN o la vía de supervivencia Akt en células de cáncer
Visto:. Xu J, Zhou JY, Wei WZ, Wu GS (2010) La activación de la Akt Survival vía contribuye a la resistencia TRAIL en células cancerosas. PLoS ONE 5 (4): e10226. doi: 10.1371 /journal.pone.0010226
Editor: Dong-Jin Yan, Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 22 Febrero, 2010; Aceptado: March 19, 2010; Publicado: 19 Abril 2010
Derechos de Autor © 2010 Xu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por la subvención NIH /NCI R01 CA100073 y Programa de cáncer de mama del Departamento de Defensa W81XWH-07-1-05-21. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
TRAIL (o Apo2L) es un miembro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral que induce selectivamente la apoptosis en el cáncer, pero no las células normales, por lo que es un agente atractivo para la terapia del cáncer. TRAIL induce apoptosis a través de la activación de sus receptores de muerte DR4 (TRAIL-R2) y /o DR5 (KILLER, TRAIL-R1, TRICK2) [1], [2], [3], [4]. Cuando TRAIL se une a DR4 y /o receptores DR5, los receptores de muerte se convierten en trimerizado y luego reclutan la proteína adaptadora FADD (proteína asociada a Fas con el dominio de la muerte) y la procaspasa 8 o procaspasa 10 para formar el disco, que lleva a la caspasa 8 de activación [1 ], [2]. Caspasa 8 puede activar directamente las caspasas efectoras 3, 6 y 7 para activar la apoptosis o indirectamente induce la apoptosis a través de la vía de la apoptosis mitocondrial inducida por la caspasa 9 tBid mediada [2], [4].
A pesar de TRAIL es una atractivos agente terapéutico muchas células cancerosas son resistentes a este agente de [2]. Los mecanismos de resistencia TRAIL no se entienden completamente, pero pueden ocurrir a múltiples niveles de sus receptores de albacea caspasas dentro de su vía de señalización [2], [4]. Al nivel del receptor, las mutaciones en DR4 y DR5 se han encontrado en algunos tumores incluyendo cánceres de mama y de pulmón [4]. expresión de receptores señuelo aumento y disminución de la expresión de DR4 /DR5 se han correlacionado con la resistencia a TRAIL, aunque otros estudios indicaron que los niveles de expresión de receptores de TRAIL no se correlacionan con la sensibilidad TRAIL. A la muerte-inducción complejo de señalización de nivel (DISC), c-FLIP se cree que es un inhibidor importante para TRAIL señalización [5], [6]. Un estudio reciente mostró que el TRAIL sensibles cáncer de pulmón de células no pequeñas células (NSCLC) Monte disco en balsas lipídicas de la membrana plasmática que conduce a la activación de la caspasa 8, en tanto que conjunto de disco no balsa conduce a la contratación de c-FLIP y RIP y la activación de la pro-supervivencia vías tales como NF-kappa B y ERK1 /2 vías de señalización [7]. Además, se ha demostrado que los miembros anti-apoptóticos de la familia Bcl-2, incluyendo Bcl-2 y MCL-1, también están implicados en la resistencia a TRAIL [8], [9]. La activación de otras vías de supervivencia, incluyendo las vías Akt y NF-kB conduce a la supervivencia celular y la quimiorresistencia [10]. Consistentemente, se ha demostrado que la activación de la vía de Akt está estrechamente asociada con la resistencia a fármacos incluyendo la resistencia TRAIL [11], [12]. Sin embargo, el mecanismo exacto por el cual la vía de Akt causa resistencia TRAIL no se entiende completamente.
La PI3K /Akt vía de señalización es una vía de supervivencia prototípico que juega un papel central en diversas funciones celulares, incluyendo la proliferación, crecimiento, la supervivencia y el metabolismo [13]. Tras la estimulación del factor de crecimiento, la PI3K se activa para fosforilar fosfatidilinositol-3, 4-bifosfato (PIP2), generando phosphatidylinsitol-3, 4, 5-trifosfato (PIP3). PIP3 une a Akt, a continuación, se transloca a la membrana plasmática donde Akt se activa por la fosforilación secuencial en los residuos T308 y S473. La fosforilación en T308 está mediada por PDK-1 (quinasa 3'-phosphoinositide dependiente 1), mientras que la fosforilación en S473 puede ser mediada por varias quinasas incluyendo PDK-1 y mTORC2 [13]. Una vez activado, Akt puede fosforilar muchos sustratos para ejercer sus funciones. El sustrato mejor caracterizada de Akt mTOR es la serina /treonina quinasa (mamíferos objetivo de rapamicina). Akt puede fosforilar y activar directamente mTOR e indirectamente activar mTOR mediante la fosforilación e inactivación de complejo de esclerosis tuberosa 2 (TSC2). mTOR Activado forma un complejo con Raptor para activar la proteína ribosomal S6 quinasas (S6K) e inhibir 4E-BP, lo que lleva a un aumento de la traducción de proteínas [13]. Se sabe que la activación de la vía PI3K //mTOR Akt puede aumentar la supervivencia celular y la resistencia a la apoptosis inducida por un número de agentes [12], [13]. Por ejemplo, la sobreexpresión de Akt aumenta la resistencia TRAIL [11], [14]. Por otro lado, el PTEN gen supresor de tumores (fosfatasa y homólogo de tensina suprimido en el cromosoma diez) pueden desfosforilar PIP3 para funcionar como un regulador negativo de la señalización de PI3K /Akt /mTOR. inactivación PTEN conduce a la activación de la vía de señalización de PI3K /Akt /mTOR. Sin embargo, el mecanismo exacto por el que la vía PI3K /Akt /mTOR confiere resistencia TRAIL no se entiende completamente.
En este estudio, hemos demostrado que el aumento de activación de la vía Akt juega un papel importante en la resistencia a TRAIL. En concreto, se demostró que TRAIL activa la vía de Akt y que el bloqueo de la activación de Akt por el inhibidor de PI3K LY294002 o desmontables expresión de Akt de siRNA sensibiliza a las células resistentes a TRAIL. También se encontró que la reintroducción de tipo salvaje PTEN en las células knockout PTEN sensibiliza PTEN
- las células a RUTA mientras que la inactivación de PTEN en PTEN
+ + y células /PTEN
+/- conduce a la resistencia TRAIL - /. Estos resultados sugieren que el aumento de la activación de la vía de Akt a través de la inactivación de PTEN desempeña un papel importante en la resistencia a TRAIL.
Materiales y Métodos
Reactivos
LY294002 fue adquirido de Alexis Bioquímicos (San Diego, CA). TRAIL recombinante se adquirió de PeproTech (Rocky Hill, NJ). anticuerpos policlonales de conejo contra Akt fosforilada (Ser473), mTOR fosforilada, fosforilada p70S6K, fosforilada eIF4E, PTEN, Akt total y poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) se adquirieron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). El anticuerpo anti-actina se adquirió de Sigma. Los adenovirus que expresan de tipo salvaje y PTEN negativo dominante, así como los adenovirus de control que expresan galactosidasa (Ad-LacZ), fueron amablemente proporcionados por el Dr. Mengjer Lee (Universidad de Louisville).
líneas de células, condiciones de cultivo, y el tratamiento
Las células T47D de cáncer de mama humano se obtuvieron de American Type Culture Collection y se mantuvieron en DMEM con suero bovino fetal al 10% (FBS). células SKOV3 del cáncer de ovario humano se cultivaron en RPMI1640 con 10% de FBS, OVCA432 células se cultivaron en medio MCDB105 /M199 con 10% de FBS como se describe [15]. las células epiteliales de la próstata PTEN-knockout mouse (PTEN
- /- y PTEN
+/-) y las células normales (PTEN
+ /+) se obtuvieron del Dr. Young Chen (Wake Forest University) y se mantiene en DMEM con 10% de FBS, como se describe anteriormente [16]. Todas las líneas celulares se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera húmeda que consiste en 5% de CO
2 y 95% de aire.
siRNA transfección para la caída de Akt
Silencio de Señal siRNA para Akt y los correspondientes siRNA de control fueron adquiridos de señalización celular. Se realizaron las transfecciones como se sugiere por el fabricante, con ligeras modificaciones, como se describe anteriormente [17]. Brevemente, las células T47D se sembraron a 6 × 10
5 por pocillo en placas de seis pocillos. Al día siguiente, las células fueron transfectadas con siRNAs Akt o de control que no son objeto utilizando Oligofectamine (Invitrogen). Después de 24 h, las células transfectadas se trataron con tripsina y se sembraron a las 6 × 10
5 por pocillo en placas de seis pocillos. 48 h después, las células transfectadas se dejaron sin tratar o se trataron con TRAIL (100 ng /ml) durante 24 h y después se recogieron para la evaluación de la expresión de Akt y PARP escindida mediante análisis de transferencia Western. Para determinar la quimiosensibilidad, se colocaron las células con o sin la transfección a 8.000 por pocillo en placas de 96 pocillos y luego tratados con TRAIL durante 24 h, y la viabilidad celular se determinó por 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2 , (MTT) ensayos de 5-difeniltetrazolio.
ensayos de MTT
ensayos de MTT fueron descritas anteriormente [18].
análisis de transferencia Western
Los procedimientos para la preparación de células enteras lisados de proteínas y Western blot fueron descritas anteriormente [18].
infecciones Adenoviruse
PTEN
+ /+, PTEN
+/- y PTEN
- /- células epiteliales de próstata de ratón y células T47D de cáncer de mama humano se sembraron en placas de 60 mm a 8 × 10
5, 6 × 10
5, 5 × 10
5 y 8 × 10
5 células por placa, respectivamente. El día siguiente, las células se lavaron con medio normal y se infectaron con adenovirus que expresan de tipo salvaje PTEN, PTEN dominante negativo, o LacZ. Durante la infección, las células se agitaron suavemente cada 10 min durante 1 h, y después se mantuvo en medio que contiene adenovirus a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2. 24 h más tarde, las células infectadas se cambiaron a medio normal sin adenovirus y luego continuamente cultivaron durante otras 48 h. A las 72 h después de la infección, las células se trataron con tripsina y se sembraron en placa de 60 mm a 5 x 10
5 células. El día siguiente, las células se dejaron sin tratar o tratados con TRAIL (100 ng /ml) durante 48 h. Las células se recogieron para el análisis de Western blot y el ensayo MTT, respectivamente.
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando
t de Student
. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar, y
P
≤0.05 fue considerado significativo.
Resultados
Caracterización de la sensibilidad a TRAIL en un panel de mama y de ovario de células cancerosas líneas
Para entender los mecanismos de resistencia a TRAIL, lo primero que investigó la sensibilidad TRAIL en líneas celulares de cáncer de 14 mama incluyendo 3 y 11 líneas celulares de cáncer de ovario. Estas líneas celulares fueron tratados con diferentes dosis de TRAIL durante 24 h, y la proliferación celular se midió por el ensayo MTT. Higo. La figura 1 muestra que estas líneas celulares mostraron la sensibilidad diferencial TRAIL; MDA-231, DOV13, OV433 y OVCA420 células fueron sensibles a TRAIL mientras que el resto de las líneas eran resistentes a TRAIL, excepto MCF-7 células que mostraban resistencia modesta. Estos datos muestran que muchas líneas celulares de ovario y cáncer de mama son resistentes a TRAIL.
líneas celulares de cáncer de mama humano T47D, MDA231 y MCF7 y líneas celulares de cáncer de ovario DOV13, E52, OV90, OV433, OVCA432, RMG- 1, TOV-21G, TOV-112D, Caov3, OVCA420, y SKOV3 fueron tratados con diferentes dosis de TRAIL durante 24 h. La proliferación celular se determinó por ensayos de MTT. los datos de proliferación celular se expresan como porcentaje de las células no tratadas. Representativos de tres experimentos independientes.
La vía /mTOR Akt se activa en líneas celulares resistentes a TRAIL
Dado que muchos de mama y líneas celulares de cáncer de ovario son resistentes a TRAIL, es importante comprender el mecanismo subyacente de la resistencia a TRAIL. Se ha informado de que TRAIL puede activar varias vías pro-supervivencia, incluyendo ERK vías Akt, NF-kB y [19], [20], [21], [22]. Debido a que la activación de estas vías modula la supervivencia celular y la quimiorresistencia, es concebible que la activación de estas vías contribuye a la resistencia TRAIL. Para probar esta posibilidad, se trataron cuatro líneas resistentes T47D, SKOV3, OVCA432 y OV90 con 100 TRAIL ng /ml para diferentes períodos de tiempo y examinó la activación de las vías Akt, NF-KB y ERK, así como la expresión de la Bcl -2 proteínas de la familia. Como se muestra en la Fig. 2A-D, los niveles tanto fosforilada Akt y de la proteína mTOR se aumentaron tan temprano como 2 h y duró hasta 6 h después del tratamiento TRAIL, Nosotros también demostramos que tal activación no se debió a un aumento en el total de las proteínas Akt y mTOR, que se mantuvo constante (Fig. 2A-D). Por otra parte, hemos demostrado que p70S6K y elF4E, ambos son objetivos de abajo de la mTOR, se activan (Fig. 2A y D). Estos datos indican que TRAIL puede activar la vía /mTOR Akt en líneas celulares resistentes a TRAIL. Es importante destacar que hemos demostrado que Akt y mTOR no se activan en sensibles MCF-7 y las células OVCA420 TRAIL (Fig. 2E y F). Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que la activación de la vía /mTOR Akt es un evento común en líneas celulares de cáncer resistentes a TRAIL y que esta vía puede ser importante en la resistencia a TRAIL. Además, se encontró que TRAIL podría activar las vías de MEK /ERK y NF-kB en OV90 células, pero no en otras líneas celulares de tres (datos no mostrados). Además, la inhibición de la ERK y las vías de NF-kB por sus inhibidores farmacológicos correspondientes no afectó a la sensibilidad TRAIL en OV90 células (datos no presentados), lo que indica que la activación de estas dos vías puede no ser importante en la resistencia a TRAIL en esta línea celular.
T47D (a), SKOV3 (B), OVCA432 (C), OV90 (D), MCF7 (e) y células OVCA420 (F) fueron tratados con 100 TRAIL ng /ml durante 0, 2, 4 y se extrajo el 8 h (en las células T47D, se incluyó 6 h de tratamiento), y la proteína total. Los niveles de Akt total y fosforilada (
p-AKT
), y mTOR fosforilada (
p-mTOR
) se determinaron por análisis de transferencia Western. En las células T47D (A) y OV90 (D), también se examinaron los niveles de fosforilados p-p70S6K y elF4E fosforilada (p-elF4E). β-actina se utilizó como control de carga. Es de destacar que había dos bandas de Akt (Akt1 y Akt2) tanto en OVCA432 y OV90 células, mientras que sólo se detectó una banda de Akt en células T47D y SKOV3.
La inhibición de la activación de Akt sensibiliza a las células resistentes Trail
Desde la vía Akt se activa en todas las líneas celulares resistentes a prueba, nos preguntamos si la inhibición de la actividad de Akt podría aumentar su sensibilidad TRAIL en células resistentes. Con este fin, se trataron T47D células con el inhibidor de PI3K LY294002 y examinó el efecto de la inhibición de Akt en la apoptosis inducida por TRAIL. Como se muestra en la Fig. 3, el tratamiento TRAIL aumento de la fosforilación de Akt en las células T47D, que fue abolida por LY294002, lo que demuestra que la activación de Akt depende de PI3K. Del mismo modo, también mostramos que la activación de Akt es bloqueado por LY294002 en OVCA432 células (Fig. 3C). Es importante destacar que, la inhibición de la fosforilación de Akt por LY294002 aumentó significativamente la escisión de PARP inducida por TRAIL en comparación con las células tratadas con TRAIL, o LY294002 solo (Fig. 3A y C). Además, hemos demostrado que el tratamiento combinado de TRAIL y LY294002 inhibe significativamente la proliferación celular en comparación con cualquier agente solo (Fig. 3B y D). Estos resultados sugieren fuertemente que la activación de Akt juega un papel importante en la resistencia TRAIL en células de cáncer.
A y C, el efecto del inhibidor de PI3K LY294002 en la apoptosis inducida por TRAIL. de células de cáncer de mama T47D (
A
) y OVCA432 de células de cáncer de ovario (
C
) se dejaron sin tratar o pretratadas con 10 M LY294002 (
LY)
de 30 min, y después se trata con o sin 100 TRAIL ng /ml durante 6 h. La proteína total se extrajo, y PARP y Akt total y fosforilada escindido se determinó por transferencia de Western.
B y D
, efecto de LY294002 en la inhibición del crecimiento inducida por TRAIL. T47D (
B
) y OVCA432 células (
D
) se dejaron sin tratar o pretratadas con 10 M LY294002 durante 30 min y, a continuación, tratados con o sin 100 TRAIL ng /ml durante 24 h. La proliferación celular se determinó por ensayos de MTT y se expresaron como porcentaje de células no tratadas. Representativos de tres experimentos independientes. **,
P Hotel & lt; 0,001, la significación estadística; *,
P
. & Lt; 0,01, la significación estadística
Desmontables de Akt sensibiliza a las células T47D de cáncer de mama en Trail
Aunque el tratamiento con el inhibidor de PI3K LY294002 aumentó TRAIL la apoptosis inducida, los resultados pueden no reflejar completamente el papel exclusivo de Akt en RUTA resistencia debido LY294002 puede inhibir otras quinasas. Para investigar el papel directo de la activación de Akt en la resistencia a TRAIL, hemos utilizado siRNA desmontables expresión de Akt y luego determinar el efecto de la caída en la sensibilidad Akt TRAIL. Estamos transfectadas T47D células con siRNA contra Akt (Akt 1, 2 y 3) o ARNsi de control y demostramos que Akt eficiente fue golpe de la derribado por Akt siRNA en células con o sin tratamiento TRAIL, en comparación con las células transfectadas con ARNsi de control (Fig. 4B ). Es importante destacar, puso de manifiesto que desmontables de Akt inducida por TRAIL sensibilizado PARP división en comparación con las mismas células transfectadas con siRNA control (Fig. 4B). Además, desmontables de Akt aumentó la inhibición del crecimiento inducida por TRAIL, mientras que tales cambios eran mínimas en células transfectadas con ARNsi de control (Fig. 4A). Por lo tanto, nuestros resultados indican que mientras TRAIL puede provocar la apoptosis, también activa la vía de supervivencia Akt para contrarrestar la apoptosis inducida por TRAIL.
Un
, efecto de la caída de Akt en la proliferación celular. Las células T47D se sembraron a 6 × 10
5 por pocillo en placas de seis pocillos. El día siguiente, las células fueron transfectadas con Akt o de control siRNAs utilizando Oligofectamine. Después de 2 d, las células se dejaron sin tratar o se trataron con TRAIL (100 ng /ml) durante 24 h, y la proliferación celular se determinó por ensayos de MTT. los datos de proliferación celular se expresan como porcentaje de las células no tratadas. Representativos de tres experimentos independientes. *,
P Hotel & lt; 0,01, la significación estadística.
B Opiniones, efecto de la caída de Akt en la apoptosis inducida por TRAIL. células T47D se transfectaron con Akt o siRNAs de control y luego tratados con o sin TRAIL (100 ng /ml) durante 24 h como se describe en (
A
). La proteína total se extrae para el ensayo de Akt total y fosforilada (
p-AKT
) y PARP mediante análisis de transferencia Western. β-actina se utilizó como control de carga.
La pérdida de PTEN confiere resistencia TRAIL
Se ha sabido que PTEN es un regulador negativo de Akt y que el aumento de la actividad de Akt ha sido asociado con la inactivación de PTEN en varios tipos de cáncer. Para entender el mecanismo de Akt RUTA resistencia activación mediada, se trataron PTEN
+ /+, PTEN
+/- y PTEN
- /- ratones células epiteliales de próstata con TRAIL durante 48 horas y la proliferación celular medido por ensayos de MTT. Higo. 5A muestra que la inhibición del crecimiento de alrededor del 32% inducida por TRAIL en PTEN
+ /+ células, mientras que TRAIL no afectó a la proliferación celular en PTEN
- /- las células, mientras que el PTEN
+/- células mostró alrededor del 13% inhibición del crecimiento después del tratamiento TRAIL. Por otra parte, hemos demostrado que Akt se activa en PTEN
- /- las células, pero no en PTEN
+ /+, mientras que la activación mínima en PTEN
+/- células. Es importante destacar que el tratamiento TRAIL provocó la escisión de PARP significativa en PTEN
células + /+, Escote moderado en PTEN
+/- células y completa ausencia de escisión en PTEN
- /- las células (Fig. 5B). Estos resultados sugieren que el PTEN es necesaria para la apoptosis inducida por TRAIL en las células epiteliales de la próstata del ratón.
células epiteliales de la próstata de ratón con el tipo salvaje PTEN (PTEN
+ /+), nocaut PTEN (PTEN
+/-
) y heterocigotos (PTEN
- /-
) en placas de 96 pocillos, y después se trata con 100 TRAIL ng /ml durante 48 h. Las células de proliferación se determinó mediante ensayos de MTT y se expresaron como porcentaje de células no tratadas. Representativos de tres experimentos independientes. *,
P Hotel & lt; 0,01, la significación estadística.
B Opiniones, efecto de la pérdida de PTEN en la apoptosis inducida por TRAIL. PTEN
+ /+, PTEN
+/-, y PTEN
- /- células fueron tratadas con 100 TRAIL ng /ml durante 48 h como se describe en (
A
). La proteína total se extrae para el ensayo de Akt total y fosforilada (
p-AKT
), PTEN y PARP mediante análisis de transferencia Western. β-actina se utilizó como control de carga.
C
, la expresión de PTEN restaurado sensibiliza PTEN
- células para TRAIL - /. PTEN
- /- las células (5 × 10
5) estaban infectados con adenovirus que expresan de tipo salvaje PTEN (
Ad-PTEN en peso
) o que expresan LacZ (
Ad-lacZ
). A las 72 h después de la infección, las células se trataron con tripsina y se sembraron en placa de 60 mm a 5 x 10
5 células. El día siguiente, las células se dejaron sin tratar o tratados con TRAIL (100 ng /ml) durante 48 h. Las células se recogieron para ensayos de MTT (
Panel superior
) y Western blot se empleó para detectar los niveles de proteínas PARP y PTEN (
panel inferior
), respectivamente. datos de proliferación celular se expresaron como porcentaje de células no tratadas. Representativos de tres experimentos independientes. **,
P Hotel & lt; 0,001, la significación estadística.
D, España inhibición de la función de PTEN por una forma dominante negativa de PTEN confiere resistencia a TRAIL. PTEN
+ /+ y PTEN
+/- células se infectaron con adenovirus que expresa una forma dominante negativa de PTEN durante 72 h y después se trató con TRAIL (100 ng /ml) durante 48 h. Las células se utilizaron ya sea para la inhibición del crecimiento por ensayos de MTT (
panel superior
) o cosechados para detectar los niveles de PARP, PTEN, y Akt total y fosforilada por Western blot (panel inferior). datos de proliferación celular se expresaron como porcentaje de células no tratadas. Representativos de tres experimentos independientes. *,
P Hotel & lt; 0,01, la significación estadística. **,
P Hotel & lt; 0,001, la significación estadística
Desde PTEN
- /- células son resistentes a TRAIL, nos preguntamos si la restauración de la expresión de PTEN afecta a la sensibilidad TRAIL. en PTEN
- - /células. PTEN
- /- células fueron infectadas con adenovirus que expresan de tipo salvaje PTEN o LacZ. Como se muestra en la Fig. 5C, la expresión de PTEN se restauró en células infectadas con adenovirus que expresa PTEN, pero no en células infectadas con adenovirus que expresan LacZ. Es importante destacar que hemos sido capaces de demostrar que la restauración de la expresión de PTEN renders PTEN
- /- (Fig. 5C) las células sensibles a la inhibición de la apoptosis inducida por TRAIL y el crecimiento y que este efecto no se observó en las células infectadas con el virus de control. Desde PTEN
+ células /+ son sensibles a TRAIL, nos preguntamos si la inhibición de la función de PTEN afecta a la apoptosis inducida por TRAIL en PTEN
+ células /+. Con este fin, se infectaron PTEN
+ /+ y PTEN
+/- células con adenovirus que expresa una forma dominante negativa de PTEN o LacZ, y las células infectadas y tratadas con TRAIL durante 48 h. Higo. 5D muestra que la introducción de la forma dominante negativa de PTEN se incrementó el nivel de p-Akt en PTEN
+ células /+. Es importante destacar que la introducción de una forma negativa dominativa de PTEN hace PTEN
+ /+ y PTEN
+/- células más resistentes a TRAIL (Fig. 5D). En consonancia con el papel de Akt en la inhibición de la apoptosis, PARP división inducida por TRAIL se redujo drásticamente en PTEN
+ /+ y PTEN
+/- células después de que fueron infectadas con el virus que expresa una forma dominante negativa de PTEN. Por otra parte, hemos demostrado que la inhibición del crecimiento inducida por TRAIL en PTEN células
+ /+ infectadas con un adenovirus que expresa una forma dominante negativa de PTEN fue de aproximadamente 5%, pero alrededor del 27% en las mismas células infectadas con adenovirus de control (Fig. 5D ). También demostramos que en PTEN
+/- células infectadas con forma dominante negativa de PTEN, la proliferación celular fue de aproximadamente 102% en comparación con las mismas células infectadas con el virus de control en las que la proliferación celular fue aproximadamente un 81% tras el tratamiento TRAIL (Fig . 5D, panel superior).
El papel de PTEN en la sensibilidad a TRAIL en células de cáncer de mama T47D
Dado que las células T47D de cáncer de mama con una de tipo salvaje PTEN fueron resistentes a TRAIL (Fig. 1 ), nos preguntamos si la modulación de la función de PTEN podría afectar a la sensibilidad TRAIL en células T47D. Con este fin, se infectaron células T47D con adenovirus que expresa una forma dominante negativa de PTEN o virus de control y luego las células infectadas y tratadas con TRAIL (100 ng /ml) durante 48 h, y el efecto de tal tratamiento sobre la sensibilidad a TRAIL se determinó. Higo. 6 muestra que las células infectadas con adenovirus que expresan una forma dominante negativa de PTEN expresan un mayor nivel de p-Akt, mientras que un aumento no se observó en las células infectadas con adenovirus que expresan LacZ, lo que sugiere que la función de PTEN se inhibió por una forma dominante negativa de PTEN (Fig. 6B). En concordancia con el papel de Akt en la inhibición de la apoptosis, PARP escindida se redujo significativamente en las células que expresan una forma dominante negativa de PTEN en comparación con las células que expresan los virus de control (Fig. 6B). Además, la sobreexpresión de una forma negativa dominante de PTEN hace que las células T47D más resistentes a TRAIL en comparación con las mismas células infectadas con virus que expresan LacZ (Fig. 6). Por lo tanto, estos datos sugieren que el aumento de la activación de Akt debido a la inactivación de PTEN podría conferir resistencia TRAIL en células de cáncer.
A
, efecto de inhibición de la función PTEN sobre la proliferación celular. células T47D (8 × 10
5) fueron infectadas con adenovirus que expresa una forma dominante negativa de PTEN o adenovirus que expresa LacZ durante 72 h y después se trató con TRAIL (100 ng /ml) durante 48 h. La proliferación celular se determinó por ensayos de MTT. los datos de proliferación celular se expresan como porcentaje de las células no tratadas. Representativos de tres experimentos independientes. *,
P Hotel & lt; 0,01, la significación estadística.
B Opiniones, efecto de la inhibición de la función de PTEN en la apoptosis. células T47D infectados con adenovirus como se describe en A se trataron con TRAIL (100 ng /ml) durante 48 h y después se recogieron para el análisis de los niveles de PARP, PTEN, las proteínas Akt total y fosforilada por análisis de transferencia Western (
panel inferior
). β-actina se utilizó como control de carga.
Discusión
En este estudio, mostramos que TRAIL activa la vía de supervivencia Akt en líneas celulares de cáncer resistente a TRAIL. También se muestra que el mecanismo subyacente puede ser debido a la pérdida de PTEN funcional porque las células epiteliales de la próstata del ratón knockout PTEN son resistentes a TRAIL mientras que las células intactas con PTEN son sensibles a TRAIL. La restauración de la expresión de PTEN rindió PTEN
- /- células sensibles a TRAIL. Además, la inactivación de PTEN aumenta el nivel de resistencia TRAIL en células T47D. Estos hallazgos sugieren que la activación de la vía de supervivencia Akt desempeña un papel fundamental en la resistencia a TRAIL y que la vía de Akt es una diana terapéutica potencial para mejorar la terapia basada en TRAIL
.
La activación de la vía Akt se ha implicado en protección de las células por muchos estímulos de muerte, confiriendo de este modo la supervivencia celular [10], [13]. Estudios previos han sugerido que la sobreexpresión de Akt y su regulador de aguas arriba PI3K aumento de la resistencia a TRAIL en cáncer de mama y de ovario células [23], [24]. Sin embargo, el mecanismo subyacente de su resistencia no se entiende completamente. En este estudio, hemos demostrado que, si bien TRAIL induce apoptosis en las células cancerosas, sino que también activa varias vías de supervivencia, lo que puede contrarrestar la apoptosis inducida por TRAIL, lo que lleva a la resistencia. En muchos de mama resistente a TRAIL y líneas celulares de cáncer de ovario, pero no las líneas celulares sensibles, la vía de Akt se activa (Fig. 2), lo que sugiere que la activación de la vía Akt puede ser un evento común en las células resistentes a TRAIL. Consistente con esta noción, se encontró que la inhibición de la activación de Akt por su inhibidor farmacológico LY294002 o desmontables de su expresión de siRNA sensibiliza a las células TRAIL-resistentes a TRAIL. En conjunto, estos datos sugieren fuertemente que la activación de la vía de supervivencia Akt desempeña un papel fundamental en la resistencia a TRAIL en células de ovario y de cáncer de mama y implica que la inhibición de esta vía de supervivencia podría superar la resistencia TRAIL.
También demostramos que la inhibición de PI3K actividad bloquea la activación de Akt en líneas celulares resistentes a TRAIL. Desde PI3K puede servir como un regulador positivo de aguas arriba de Akt, estos resultados sugieren que el aumento de la activación de Akt es al menos en parte a través del aumento de la activación de la actividad de PI3K. En el nivel aguas abajo, es bien sabido que Akt ejerce sus funciones biológicas mediante la fosforilación de sus sustratos aguas abajo incluyendo mTOR. La activación de mTOR puede aumentar la traducción de proteínas, lo que resulta en la supervivencia celular [13]. Consistente con esto, encontramos que el tratamiento TRAIL puede causar la fosforilación de mTOR y la posterior activación. Nuestros datos sugieren que TRAIL puede activar vía de la PI3K /Akt /mTOR para contrarrestar la apoptosis inducida por TRAIL, lo que conduce a la resistencia a TRAIL.
En las células cancerosas, la vía de supervivencia Akt puede ser activado por los varios mecanismos que incluyen la inactivación de su aguas arriba regulador negativo PTEN. Por dephosphorylating y conversar PIP3 al PIP2, PTEN inhibe la activación de Akt y posteriormente se sensibiliza a las células a la muerte [10], [13]. En concordancia con el papel de la vía PI3K /Akt en la resistencia a TRAIL, se encontró que la pérdida de PTEN en las células epiteliales de la próstata del ratón confiere resistencia TRAIL mientras que las mismas células con PTEN intacta son sensibles a TRAIL mientras PTEN
+/- células muestran intermedio resistencia. Estos datos sugieren que de hecho PTEN desempeña un papel importante en la sensibilidad a TRAIL. Por otra parte, hemos demostrado que la reintroducción de una forma mutante de PTEN en las células T47D resistentes a TRAIL aumenta aún más la resistencia a TRAIL. En conjunto, estos datos indican que en las células resistentes a TRAIL, la pérdida de PTEN contribuye a TRAIL resistencia. Se ha sabido que la disminución o pérdida de la expresión de PTEN se produce en al menos 50% de los cánceres de mama y de ovario [25]. Es posible que mama resistentes a TRAIL y las células de cáncer de ovario han disminuido los niveles de PTEN, que necesitan una mayor investigación. Además, un estudio reciente mostró que la sobreexpresión de miR-221 & amp; 222 abajo regula PTEN, lo que lleva a un aumento de la activación de Akt y posterior RUTA resistencia [26]. Además, las células de leucemia resistentes a TRAIL expresaron un nivel superior de forma inactiva fosforilada de PTEN, que resultó en un aumento en la activación de Akt y resistencia TRAIL [27].