Extracto
receptor de hormona tiroidea (TR) media los efectos cruciales de la hormona tiroidea (T3) sobre el crecimiento celular, el desarrollo, y la diferenciación. expresión o inactivación de las mutaciones somáticas de TRs Disminución se han encontrado en cánceres humanos de hígado, mama, pulmón y tiroides. Los mecanismos de la carcinogénesis TR-asociado todavía no están claras. Para establecer la función de TRβ en la proliferación celular del cáncer de tiroides, se construyó un vector de adenovirus recombinante, AdTRβ, que expresa TRβ1 cDNA humano. líneas celulares de cáncer de la tiroides en el que los niveles de proteína TRβ se redujo significativamente en comparación con los tejidos de la tiroides intactas fueron infectadas con AdTRβ y la función de TRβ sobre la proliferación celular y se analizó la migración. Unido a ligando TRβ inducida HDAC1 y HDAC3 disociación de, y la acetilación de la histona asociada con el promotor RhoB y mejorado la expresión de RhoB mRNA y proteína. En las células infectadas por el AdTRβ, inhibidor de T3 y la farnesil transferasa (FTI) -Tratamiento indujo la distribución de RhoB en la membrana celular y un aumento de la abundancia de activo RhoB unida a GTP. Esta proteína RhoB condujo a la detención del ciclo celular p21 asociada en la fase G0 /G1, después de la inhibición de la proliferación celular y la invasión. Por el contrario, la reducción de RhoB celular mediante pequeños ARN de interferencia desmontables en las células infectadas por el AdTRβ condujo a la regulación negativa de p21 y la detención del ciclo celular inhibida. El crecimiento de xenoinjertos de tumores BHP18-21v
en
vivo
fue inhibida significativamente por inyección AdTRβ con FTIs-tratamiento, en comparación con el control de tumores inyectados con virus. Esta nueva vía de señalización desencadenada por TRβ unido a ligando da una idea de los posibles mecanismos de proliferación y la invasión del cáncer de tiroides y puede proporcionar nuevas dianas terapéuticas para el cáncer de tiroides
Visto:. Ichijo S, Furuya F, H Shimura, Hayashi Y, Takahashi K, Ohta K, et al. (2014) La activación de la vía de señalización por RhoB β hormona tiroidea receptor en células del cáncer de tiroides. PLoS ONE 9 (12): e116252. doi: 10.1371 /journal.pone.0116252
Editor: Makoto Makishima, Escuela de Medicina de la Universidad de Nihon, Japón
Recibido: 12 Agosto, 2014; Aceptado: 5 de diciembre de 2014; Publicado: December 30, 2014
Derechos de Autor © 2014 Ichijo y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la JSPS KAKENHI (Grant número 24591359). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
receptores de la hormona tiroidea (TR) son dependientes de ligando factores de transcripción que median las acciones de la hormona tiroidea (T3) en el desarrollo celular, el crecimiento y la diferenciación. Dos genes humanos, TR Thra y thrB que se encuentra en cromosomas diferentes, codifican isoformas de unión de T3-(TRα1, β1, β2, y beta 3) que se expresan de una manera tejido- y el desarrollo dependiente [1]. Durante las últimas décadas, los avances significativos se han hecho en la comprensión de las acciones de TR en el mantenimiento de la función celular normal. Sin embargo, las funciones de los TRs en el cáncer humano no se comprenden bien. La expresión reducida de TRs debido a la hipermetilación o supresión de genes TR en los cánceres humanos sugiere que TRs podrían funcionar como supresores de tumores [2]. Una estrecha asociación de mutaciones somáticas de TR con los cánceres de tiroides apoya la idea de que la pérdida de las funciones normales de TR podría conducir a un crecimiento incontrolado y la pérdida de la diferenciación celular [3].
Para entender las consecuencias funcionales de ligando -bound efectos TRβ sobre las vías de señalización corriente abajo en las células del cáncer de tiroides, que se centraron en RhoB que es un miembro de la superfamilia Ras de GTPasas pequeñas isoprenylated, que regulan las fibras de estrés de actina y el transporte de vesículas [4]. Otros RhoGTPases, que incluyen RhoA y RhoC, promover la oncogénesis, invasión y metástasis [5]. Por el contrario, RhoB tiene efectos antiproliferativos y proapoptóticos en células de cáncer, y la sobreexpresión de RhoB puede inhibir la migración celular, invasión y metástasis [6]. Asociación a la membrana de la proteína RhoB se produce a través de cualquiera geranylgeranylated (RhoB-GG) o modificaciones farnesylated. RhoB responde a inhibidor de la farnesil transferasa -tratamiento (FTI) por un mecanismo de ganancia de función que se caracteriza por la elevación de la forma RhoB-GG que inhibe la proliferación o la apoptosis de las células del cáncer [7]. Por lo tanto, la expresión alterada y la actividad de RhoB pueden ser cruciales para la progresión del cáncer y las respuestas terapéuticas.
En el presente estudio, hemos explorado la función de TRβ unido a ligando en células de cáncer de tiroides. Unido a ligando TRβ inducida por la expresión de proteínas RhoB, lo que lleva a una mayor expresión de p21 seguido de disminución de la proliferación celular y la motilidad. FTI-tratamiento mejorado estas funciones antiproliferativos de TRβ unido al ligando. Nuestros resultados identifican RhoB regulación al alza como un paso clave para la orientación proliferación de las células del cáncer de tiroides y la progresión tumoral. Esta nueva vía de señalización desencadenada por TRβ unido a ligando da una idea de los posibles mecanismos de proliferación e invasión de cáncer de tiroides.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
BHP18-21 células, que fueron reportados por Ohta
et al.
[8], fueron siempre como un regalo por el Dr. Jerome Hershman, UCLA. células BHP18-21v, que expresan Pax-8, pero no expresan ya sea la tiroglobulina o la transcripción de tiroides gen del factor-1, se aislaron a partir de células BHP18-21v [9]. FRO y células WRO, que fueron publicados en la cita [10], [11] fueron amablemente proporcionados por el Dr. Shunichi Yamashita, Universidad de Nagasaki. Estas líneas celulares no son
de
novo
líneas celulares, pero ya se han reportado [8], [10], [11] y fueron amablemente proporcionados como presentes por nuestros colaboradores. Todas las células se cultivaron en medio RPMI 1640 con 10% (v /v) de suero bovino fetal (FBS) en una incubadora humidificada bajo un CO 5%
2 atmósfera. los perfiles de ADN de líneas celulares de cáncer se analizó por Promega Japón (Tokio, Japón) y se muestra en la Tabla 1. La hormona tiroidea, triyodotironina (T3) y el inhibidor de la farnesil transferasa (FTI), IFA-277, fueron adquiridos de Sigma Aldrich (St. . Louis, MO). Las células se incubaron con despojado-resina (T
3-agotado) FBS [12] y luego se infectaron con 30 MOI de AdTRβ o AdLacZ control. Las células se incubaron en medio con o sin 30 nM de T3 o 5 M de la IVR.
Construcción de los vectores adenovirales recombinantes
AdTRβ es un adenovirus recombinante ΔE1-ΔE3 que expresa el gen humano TRβ [13] bajo el control del promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV). La construcción del virus AdTRβ se ha descrito anteriormente [13]. AdLacZ, que contiene el promotor controlado por CMV
lacZ
gen, se adquirió de Quantum Biotecnologías (Montreal, Canadá) y se utilizó como control. AdTRβPV es un vector adenoviral recombinante que expresa TRβPV humana, que es un mutante dominante negativo de TRβ [14], bajo el control del promotor de citomegalovirus temprano inmediato. El plásmido FLAG-TRβPV [15] se utilizó como molde para la clonación de
TRβPV
en pShuttle2 (Clontech, Mountain View, CA) utilizando la reacción en cadena de la polimerasa. Los cebadores de PCR fueron: FLAG-ApaI-5 '(AAGGGCCCGCCGCCATGGACTACAAAGACGATGACGAC), y TRβPV-3' KpnI (AATGGTACCTTCAGTCTAATCCTCGAACACTTCC) en el que los subrayados indican los sitios de restricción. a continuación, un vector de adenovirus se construyó usando el Sistema de Expresión de Adeno X (Clontech) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los adenovirus recombinantes eran purificado en placa, se recogieron 48 h después de la infección de células 293, y se purificaron por doble ultracentrifugación en gradiente de cloruro de cesio [16]. Los títulos virales se determinaron mediante ensayos de placas con 293 células cultivadas [16] y un kit de titulación de adenovirus (Clontech).
Construcción de plásmidos y ensayos de luciferasa
El reportero plásmido RhoB -726 /+ 86 RhoB -luc plásmido fue proporcionado amablemente por el Dr. Dimitris Kardassis (Universidad de la Escuela de Medicina Creta) [17]. Transitorios co-transfecciones se llevaron a cabo por triplicado. El plásmido de luciferasa de Renilla se co-transfectadas para la normalización. transfecciones de plásmidos se realizaron en AdTRβ o controlar las células del cáncer de tiroides infectadas por virus utilizando Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Grand Island, NY). Veinticuatro horas después de la transfección, las células fueron tratadas con o sin T3 para una 24 h adicionales. ensayos de luciferasa duales se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega, Madison, WI).
chip de ensayo
Chip ensayos se realizaron utilizando un kit de inmunoprecipitación de la cromatina chip enzimática sencilla (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). células infectadas con AdTRβ (5 × 10
7) que se trataron con o sin T3 se fijaron con formaldehído al 1% y se digirió la cromatina se inmunoprecipitó con anticuerpos anti-histona 3 (control positivo), IgG de conejo normal (control negativo), anti histona acetil 3 (Lys 9), desacetilasa anti-histona (HDAC) 1 o anticuerpos anti-HDAC3. Quinientos l de cromatina diluida se inmunoprecipitaron con 5 g de cada anticuerpo y proteína G perlas magnéticas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuantitativa en tiempo real (RT) -PCR se realizó con un verde en tiempo real PCR kit SYBR (Life Technologies). Las secuencias de los cebadores utilizados para la RT-PCR fueron: adelante 5'-GCAGCAGCAGCGCAGACT-3 'y revertir 5'-ACTCGGCCTAGCTCTCTC-3'
Cuantitativo en tiempo real PCR transcriptasa inversa
El ARN total se. extraído de las células usando un RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante. Después de la cuantificación por espectrofotometría, 5 g de ARN total se transcribió de forma inversa para obtener cDNA mediante el uso de 160 mM de trifosfato de desoxinucleótido, 50 ng de cebadores hexámeros aleatorios y 200 unidades de superíndice II de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Life Technologies). sondas TaqMan para RhoB humana, TRβ y 18S rRNA se adquirieron de Life Technologies. los niveles de mRNA se determinaron por tiempo real de RT-PCR como se describe anteriormente por Furuya
et al.
[18].
Análisis de transferencia Western
Este estudio fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Yamanashi. tejidos normales de la tiroides desde el lóbulo opuesto de los carcinomas fueron obtenidos por la cirugía después de que los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito. Los documentos relacionados con el consentimiento informado, que fueron aprobados por el comité de ética, se mantuvieron en el armario de almacenamiento hospital universitario. El tejido normal del 4 de los pacientes se agruparon para el experimento de Western Blot. Los tejidos se congelaron en nitrógeno líquido inmediatamente después de la resección. Proteína lisados de tejido tiroideo normal y de líneas celulares de cáncer se prepararon mediante el uso de tampón de lisis celular (Cell Signaling Technology) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. proteína de membrana se purificó a partir de células infectadas por el BHP18-21v AdTRβ mediante el uso de un kit de purificación de proteínas de membrana (GE Healthcare Life Science, Pittsburgh, PA) según las instrucciones del fabricante. Determinación de la abundancia de proteínas por análisis de transferencia Western se realizó como se describe [19] utilizando los siguientes anticuerpos primarios (dilución 1:500): anti-RhoB y Rb anti-fosforilado (Cell Signaling Technology); anti- PPAR, anti-p21, anti-tubulina, y anti-GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX). Control negativo siRNA y siRNA contra RhoB se adquirieron de Dharmacon (Thermo Fisher, Leicestershire, Reino Unido). El análisis de transferencia Western de las células siRNA transfectadas se realizó como sigue: las líneas celulares de cáncer (1,0 a 1,3 × 10
5) infectada con adenovirus (MOI 30) se incubaron con T3 para 12 h y luego 50 nm de siRNA se transfectó en las células mediante el uso de Lipofectamine 2000 (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante. Después de 48 h, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (Ca
2 + /Mg
2 + exento) y se analizaron como se ha descrito anteriormente.
El análisis de inmunoprecipitación
para analizar la expresión de la proteína de TRβ en las células, 500 g de lisado de proteína a partir de tejido de la tiroides, HepG2 o líneas celulares de cáncer de tiroides transfectadas con virus se inmunoprecipitó con 5 g de anticuerpo monoclonal C3 de ratón contra el extremo C terminal de TRβ (Santa Cruz Biotechnology) o con 5 mg de IgG de ratón como se indica en el texto utilizando el kit G inmunoprecipitación de proteínas Dynabeads (Life Technologies) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El análisis de transferencia Western se realizó utilizando un anticuerpo anti-TRβ (Santa Cruz Biotechnology) contra un péptido TRβ N-terminal o un anticuerpo anti-TRα (Santa Cruz Biotechnology) contra un péptido TRα N-terminal. Los lisados celulares de células infectadas por el AdTRβ se inmunoprecipitaron con Rhotekin RBD etiquetado perlas de agarosa y la abundancia de RhoB unida a GTP se analizó por el ensayo de pull-down, mediante el uso de kit de ensayo de activación de RhoB (célula Biolabs, Inc. San Diego, CA).
Cell-ciclo de análisis
Las células se tiñeron con 20 mg /ml de yoduro de propidio (Life Technologies) y se analizaron mediante un flujo FACS Calibur BD Biosciences citómetro (Franklin Lakes, NJ) y Cell Quest software versión 3.0. El porcentaje de células en el G
1, S o G
2 /M fase se calculó mediante el uso de ModFitLT versión 3.1.
proliferación celular y la invasión ensayos
El número de las células se midió usando un ensayo de proliferación celular no radiactivo (Cell Counting Kit-8; Dojindo, Kumamoto, Japón) como se describe anteriormente por Furuya
et al
[19]. la invasión celular se midió usando el kit de ensayo de invasión Cytoselect Cell (Cell Biolabs, Inc.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Medio de cultivo celular con 10% de FBS se utilizó como un quimioatrayente en el pozo inferior de la cámara. Después de la rehidratación de la membrana basal, las líneas celulares de cáncer de tiroides se sembraron en el compartimiento superior de la cámara en medio libre de suero (1 × 10
4 células por pocillo) con T3 o FTI-tratamiento. Después de incubación a 37 ° C en 5% de CO
2 durante 24 h, las células no invasoras se eliminaron de la superficie superior, y las células que habían invadido la membrana (8 micras de tamaño de poro) para llegar a la superficie inferior eran teñido con colorante fluorescente CyQuant GR. Su fluorescencia se analizó a 480 nm usando un lector de placas de fluorescencia.
Los xenoinjertos de células BHP18-21v y
inyección vector
BHP18-21v células (1 × 10
7) se trasplantaron en el tejido subcutáneo del abdomen de ratones desnudos macho de 8 semanas de edad (BALB /C
nu /nu
). Tres semanas más tarde, cuando los tumores habían alcanzado aproximadamente 1 cm de diámetro, los ratones se asignaron al azar al grupo experimental o de control (6 ratones por grupo). Cinco × 10
8 unidades formadoras de placas de AdTRβ o AdLacZ en 100 l de PBS se inyectaron en los tumores. administración Adenovirus se repitió cada 7 días. En cada momento, todos los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal también con un peso de 100 mg /kg /cuerpo de la FTI-277. El día 30, los ratones fueron sacrificados por CO
2 inhalación. Los tumores que se retiraron de los ratones fueron fijadas en 10% formalina tamponada y embebidos en parafina. Las secciones se permeabilizaron con 0,2% Triton X-100 en PBS durante 10 min a temperatura ambiente. El suero T3 libre y TSH se determinaron mediante el uso de la T3 libre kit ELISA (Phoenix Pharmaceuticals, Inc, CA) y un kit de ensayo de TSH (Uscn Life Science Inc, Wuhan, China), respectivamente, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El Comité Institucional de Bioseguridad de la Universidad de Yamanashi aprobó los procedimientos con animales y el uso de ADN recombinante.
Estadísticas
Los datos se expresan como medias ± S. D. El análisis estadístico se realizó mediante análisis de varianza de una sola vía o la no apareado de Student de 2 colas
t
alltests, y los valores de probabilidad de menos de 0,05 se consideró estadísticamente significativa.
Resultados
Para explorar la función TRβ en la proliferación celular del cáncer de tiroides, nos centramos en el análisis de RhoB, que es un objetivo de TRβ y que se expresa en niveles muy bajos en 130 líneas celulares de cáncer humano [20]. Para el presente estudio, hemos utilizado las líneas celulares de cáncer de tiroides, 3 BHP18-21v, FRO y WRO, que fueron infectadas con 30 MOI de AdTRβ o AdLacZ. Se analizaron primera expresión de la proteína TRβ en estas células. Quinientos g de toda proteína lisado celular se inmunoprecipitó con un anticuerpo monoclonal que reconoce la región C-terminal TR, seguido por análisis de transferencia Western con un anticuerpo contra un péptido TRβ N-terminal. Como se muestra en la Fig. 1A, la expresión TRβ se observó claramente en los controles positivos; tejido intacto de la tiroides (carril 1) y HepG2 células que expresan TR funcional [21] (carril 2), y también en BHP18-21v infectada por AdTRβ, FRO y células WRO (carriles 6-8). No se observó expresión de la proteína en TRβ BHP18-21v infectada con AdLacZ, FRO o células WRO (carriles 3-5) o en las células HepG2 que se inmunoprecipitaron con un anticuerpo IgG monoclonal de ratón como control negativo (carril 9). expresión de tubulina en el lisado de proteínas (10 mg) también se analizó como control de carga (Fig. 1B). También se analizó la expresión TRα en estos lisados celulares por Western blot de las proteínas inmunoprecipitadas con un anticuerpo contra un péptido TRα N-terminal. expresión TRα se observó en los controles positivos; tejido tiroideo y HepG2 (carriles 1 y 2, respectivamente). No se observó expresión de la proteína en las células TRα BHP18-21v, FRO o WRO que fueron infectados con AdLacZ (carriles 3-5) o AdTRβ (carriles 6-8). El descenso de regulación de la expresión de PPAR y su actividad se considera que es uno de los mecanismos de la carcinogénesis de tiroides [22]. por lo tanto, también se analizó la expresión de la proteína PPAR en BHP18-21v, FRO o células WRO (Fig. 1C). expresión de PPAR se redujo en estas células de cáncer en comparación con el de tejido de la tiroides intacta, pero la infección con AdTRβ no tuvo ningún efecto sobre la expresión de PPAR en células de cáncer de tiroides. Estos datos indican que los tres AdTRβ o AdLacZ infectaron líneas celulares ensayadas son un buen modelo para el análisis de la función TRβ.
A. transferencia de Western de lisados celulares (500 g) preparadas a partir de tejido normal de la tiroides, a partir de células HepG2 de control positivo, o de las líneas celulares de cáncer de tiroides BHP18-21v, FRO y WRO que fueron infectados con AdTRβ o controlan AdLacZ virus. Los lisados se inmunoprecipitaron (IP) con 5 g de anticuerpo anti-TRβ monoclonal de ratón (C3) que reconoce el TRβ C-terminal, o con 5 g de IgG normal de ratón (IgG) como se indica. Las transferencias se sondearon con un anticuerpo contra un péptido TRβ N-terminal (TRβ) o con un anticuerpo contra un péptido TRα N-terminal (TRα). B. expresión de tubulina en los lisados de células totales se utilizó como control de carga. análisis de transferencia de Western C. del nivel de expresión de la proteína PPAR (panel superior) en extractos de células (20 g de lisado de proteínas). Tubulina también se borró como control de carga (panel inferior).
A continuación analizaron el efecto del tratamiento T3 de AdTRβ- o líneas celulares de cáncer de tiroides infectados por AdLacZ sobre la expresión RhoB (Fig. 2A-C ). T3-tratamiento (30 nM) de AdTRβ infectadas (carriles 1-4), pero no de infectados con AdLacZ (carriles 5-7) BHP18-21v, las células FRO y WRO de 6, 12 o 24 h aumentó significativamente la expresión de RhoB mRNA de una manera dependiente del tiempo en comparación con células no tratadas no infectadas por virus. Además, el análisis de transferencia Western indicó que T3-tratamiento durante 12 o 24 h indujo la expresión de proteínas en RhoB BHP18-21v infectada por AdTRβ, FRO y células WRO pero no en células infectadas por el AdLacZ (Fig. 2D-F, carriles 2-4 y carriles 5-7, respectivamente). Por lo tanto, la inducción de RhoB ARNm y la expresión de proteínas son T3 /AdTRβ-dependiente en líneas celulares de cáncer de tiroides.
Los niveles de expresión de ARNm RhoB (A-C) o proteína (D-F) en AdTRβ infectados, el control AdLacZ-infectado, o líneas celulares de cáncer no infectados tiroides expuesto a 30 nM de T3 durante 0, 6, 12 o 24 h como se indica. (A-C) La expresión de ARNm RhoB y 18S se determinó utilizando en tiempo real de RT-PCR con 100 ng de cDNA. los niveles de expresión de mRNA relativa se determinaron por ajuste arbitrariamente el valor para las células infectadas por el virus de control se incubaron en medio libre de T3 a 1. Los datos se expresan como medias ± S.D. (
n
= 6). *,
p Hotel & lt; 0,05. (D-F) Análisis de transferencia Western de 20 g de lisados de proteína de las células se realizó utilizando anticuerpos contra RhoB (panel superior) o la tubulina (panel inferior), que se utilizó como control de carga.
Para aclarar los mecanismos mediante los cuales unido a ligando TRβ mejorado la expresión de RhoB en las células BHP18-21v, FRO y WRO infectados por AdTRβ, analizamos el efecto del tratamiento T3 de estas líneas celulares en la actividad transcripcional del promotor RhoB. células infectadas con AdLacZ AdTRβ- o de control fueron por lo tanto transfectadas transitoriamente con el constructo informador promotor-luciferasa RhoB, -726 /+ 86 RhoB-Luc. La actividad de luciferasa dirigido por el promotor RhoB fue significativamente mayor en las células infectadas por el AdTRβ, pero no en las células infectadas con AdLacZ siguientes T3-tratamiento (Fig. 3A-C).
(A-C) RhoB promotor-Luciferase los ensayos de reportero. Infectadas con adenovirus BHP18-211v (A), FRO (B), o WRO células (C) se transfectaron con 1 g de un plásmido reportero RhoB promotor de luciferasa y se incubaron durante 24 h adicionales en la ausencia o presencia de 30 nM T3. actividades promotoras relativa (actividad luciferasa) se determinaron por ajuste arbitrariamente el valor para las células infectadas por el virus de control se incubaron en medio libre de T3 a 1. Los datos se expresan como medias ± S.D. (
n
= 6). *,
p Hotel & lt; 0,05. (D-F) chip de ensayo usando infectada por AdTRβ BHP18-211v (D), FRO (E), o WRO (F) células tratadas con o sin 30 nM T3. Los anticuerpos que reconocen histone3 (H3), acetilados H3, HDAC1, HDAC3 o normal de conejo IgG se utilizaron para la inmunoprecipitación de la cromatina. Entrada indica 10% de la cromatina. Los productos de PCR fueron separados en un 2% de gel de agarosa.
La transcripción del promotor RhoB es inhibida por represores transcripcionales que reclutan las histona desacetilasas (HDACs) para eliminar la acetilación de residuos de lisina en histones3 (H3) colas [23]. Está bien establecido que el estado de acetilación de los dominios de la cola de histones3 (H3) cambio durante la activación transcripcional del promotor RhoB [24]. Para determinar si la inducción de la expresión génica por RhoB TRβ ligando determinada se correlaciona con cambios en el estado de acetilación de H3 en la región promotora del gen RhoB, se llevaron a cabo de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) ensayos. infectada por AdTRβ BHP18-21v, FRO o células WRO se incubaron con o sin T3 durante 24 h y Chip ensayos se realizaron utilizando anticuerpos a H3, acetilado H3, HDAC1 y HDAC3. Como se muestra en la Fig. 3D-F, H3 se encontró en fragmentos del promotor RhoB (carril 3) en las células infectadas por el AdTRβ con o sin T3-tratamiento. Sin embargo, HDAC1 y HDAC3 se asociaron con fragmentos del promotor RhoB sólo cuando las células se incubaron sin T3, y no cuando las células se incubaron con T3 (HDAC1 /3; carriles 5 y 6, respectivamente). De acuerdo con estos resultados, no H3 acetilado se asoció con el promotor en ausencia de tratamiento T3, mientras que en presencia de T3, la H3 que se asoció con el promotor fue altamente acetilado (carril 4). Estos resultados indicaron que TRβ unido a ligando induce la transcripción RhoB a través de la alteración del estado de acetilación de histonas de las células del cáncer de tiroides.
A continuación analizaron el efecto de TRβ unida al ligando en la localización celular y función de RhoB. Para ello se han utilizado el agente FTI. IFA tratamiento de las células induce la asociación de membrana de RhoB por modificación de RhoB a través de la adición de restos lipídicos [4]. asociación de membrana de RhoB es importante para su actividad. Se determinó primero el efecto de 5 M de tratamiento FTI en la expresión de proteínas en células RhoB BHP18-21v infectados por AdTRβ que fueron tratadas con o sin T3 (30 nM). Western Blot de lisados de células enteras de células tratado /sin tratar AdTRβ infectadas con anticuerpos BHP18-21v RhoB (Fig. 4A) indicó que la FTI-tratamiento no alteró la inducción de la expresión T3 RhoB (calles 2 y 4) y no aumentó la proteína RhoB la expresión en células infectadas por el BHP18-21v AdTRβ en ausencia de T3-tratamiento (carril 3)
. células BHP18-211v
AdTRβ infectados fueron expuestos to30 T3 nM y /o 5 M del inhibidor de la farnesil transferasa ( FTI) durante 24 h y se analizó entonces como sigue. A. análisis de transferencia de Western del nivel de expresión de la proteína RhoB (panel superior) en extractos de células (20 g de lisado de proteínas). Tubulina también se transfirió como control de carga (panel inferior). B. Los lisados celulares se inmunoprecipitaron con perlas de agarosa-etiquetados RBD Rhotekin. RhoB unida a GTP en los precipitados se analizó mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo contra RhoB. análisis de transferencia de Western de la proteína C. RhoB en la fracción de proteína de membrana. GAPDH se borró como un control de marcador de la carga de proteínas de membrana (panel inferior).
A continuación, se analizó el efecto del tratamiento T3 con /sin FTI co-tratamiento sobre la actividad RhoB. Al igual que otras pequeñas GTPasas, RhoB regula eventos moleculares por ciclo entre una forma inactiva unida a GDP y una forma activa unida a GTP. En la forma activa unida a GTP, RhoB se une específicamente al dominio de unión a Rho (RBD) de Rhotekin para regular las cascadas de señalización corriente abajo. por lo tanto, se analizó la abundancia de RhoB unida a GTP en lisados celulares de células infectadas por el BHP18-21v AdTRβ que fueron tratadas con o sin T3 y /o FTI por inmunoprecipitación de lisados de células con perlas de agarosa Rhotekin RBD-etiquetados seguido de inmunotransferencia para RhoB ( la Fig. 4B). Estos pull-down ensayos indicaron que no sólo la abundancia de RhoB sino también la abundancia de la forma activa unida a GTP de RhoB en las células infectadas por el BHP18-21v AdTRβ fue reforzada por T3-tratamiento (carril 2) y fuertemente reforzadas por FTI y T3 co-tratamiento (carril 4). No se detectó unida a GTP RhoB en las células tratadas con FTI sin T3-tratamiento (carril 3). Estos resultados indicaron que la proteína RhoB AdTRβ inducida por ligando determinada en células BHP18-21v era una quinasa activa cuya actividad fue mejorada por co-tratamiento con FTI.
Para determinar si T3 y FTI podrían inducir asociación a la membrana de RhoB en las células infectadas por el BHP18-21v AdTRβ, se biotina proteínas de la superficie celular. proteínas biotiniladas en lisados celulares se retiraron abajo con perlas de estreptavidina y se analizaron por inmunotransferencia con un anticuerpo anti-RhoB (Fig. 4C). T3-tratamiento indujo la expresión de RhoB en la membrana celular (carril 2), que fue enormemente mejorada por co-tratamiento con FTI (carril 4). FTI-tratamiento no aumentó la expresión de proteínas RhoB en la membrana celular de las células infectadas por el BHP18-21v AdTRβ en ausencia de T3-tratamiento (carril 3). Estos resultados indican que T3 inducida por asociación a la membrana de RhoB que se ve reforzada por la IVR co-tratamiento y fueron consistentes con la inducción de la actividad T3 RhoB en las células infectadas por el BHP18-21v AdTRβ.
La quinasa dependiente de ciclina (CDK ) inhibidor, p21, es un regulador negativo de la progresión del ciclo celular y es uno de los objetivos de abajo de RhoB. Para confirmar la actividad de RhoB en las células infectadas por el BHP18-21v AdTRβ tratados con T3 y /o FTI, se analizó la expresión de la proteína de p21 mediante análisis de transferencia Western (Fig. 5A-C). expresión de p21 se analizó en células transfectadas con RhoB orientada o siRNA de control para confirmar la dependencia RhoB de p21changes. Tres células de cáncer de tiroides se pre-cultivaron en medio libre de T3 con suero despojado, como se describe en "Materiales y Métodos". FTI-tratamiento no aumentó la expresión de proteína p21 en las células AdTRβ infectadas de control de siRNA sin T3-tratamiento (carril 2). En las células infectadas por el AdTRβ, el nivel de expresión de p21 se incrementó en las células tratadas con T3 (carril 3) y se ha mejorado en gran medida por co-tratamiento con FTI (carril 4) en comparación con células no tratadas (carril 1). Sin embargo, p21 no fue inducida por T3, más el tratamiento de las células infectadas FTI-AdTRβ 24 h después de la transfección con siRNA dirigidos-RhoB (carril 5). p21 inhibe la actividad de las CDK, que conduce a hipo-fosforilación de la proteína retinoblastoma (Rb), que a su vez provoca la detención del ciclo celular en la fase G0 /G1 [25]. Se analizó la fosforilación de Rb (p-Rb) en las células del cáncer de tiroides infectados por AdTRβ tratados con T3 y /o FTI [(Fig. 5 (A-C)). Rb se fosforiló en BHP18-21v infectada por AdTRβ, FRO o WRO células con o sin T3-tratamiento (carriles 1 y 3). FTI-tratamiento solo no inhibió la fosforilación de Rb en las células infectadas por el AdTRβ (carril 2). fosforilación de Rb se redujo significativamente en las células infectadas por el AdTRβ por co-tratamiento con T3 y FTI (carril 4). Por otro lado, la inhibición de la fosforilación de Rb no se observó por T3 más el tratamiento FTI de células infectadas por el AdTRβ después de la transfección con siRNA dirigidos-RhoB (carril 5).
(A-C) Análisis de transferencia Western de la nivel de expresión de p21 o de la proteína Rb fosforilada en BHP18-21v infectada por AdTRβ (a), FRO (B), o células WRO (C) que fueron expuestos a 30 nM de T3 solo durante 12 h o 30 nM T3 plus 5 M de FTI durante 12 h, con o sin siRNA desmontables de RhoB como se indica. Tubulina se transfirió como control de carga (paneles inferiores). (D-F) El porcentaje de células en el G
0 /G
1, S o G
2 /M fase se calcula utilizando ModFitLT versión 3.1. Los datos se expresan como medias ± S.D. (
n
= 6). *,
p
. & Lt; 0,05
A continuación, estudiamos las fases del ciclo celular de estas células usando citometría de flujo (Figura 5D-F.). En las células AdTRβ infectadas de control si, el tratamiento con T3 más FTI indujo un aumento significativo en la población de fase G0 /G1 en comparación con células no tratadas o tratadas T3-, mientras que en RhoB-dirigida de células siRNA-transfectadas, T3 + tratamiento FTI tenido ningún efecto sobre la población de células en la fase G0 /G1. Además, el tratamiento con T3 más FTI redujo el número de células en la fase G2 /M en si-control- pero no en células infectadas por el siRNA-AdTRβ orientados RhoB. Estos resultados indican que la expresión RhoB mejorado en las células cancerosas infectadas con AdTRβ que fueron tratados con T3 y FTI, fue acompañado por un aumento de la expresión de p21 y la inhibición de la progresión del ciclo celular.
Para confirmar que los cambios observados en expresión p21 refleja cambios en la proliferación celular, se analizaron los efectos de la siguiente TRβ sobre la proliferación de células de cáncer usando el ensayo de MTT. Para este ensayo, las células BHP18-21v, FRO o WRO se infectaron con 30 MOI de AdTRβ y, después de 12 h de incubación en medio que contiene adenovirus-, las células se cultivaron con o sin T3 (30 nM) y 5 M de FTI para 24 o 72 h. Después de 24 y 72 h de incubación del número de células había aumentado en ausencia de T3-tratamiento, pero se redujo en presencia de T3 y disminuyó significativamente en presencia de T3 más FTI (Fig. 6A-C).
(A-C) ensayo de proliferación celular. BHP18-21v (A), las células FRO (B) o WRO (C) se incubaron en medio T3-agotado para 24 h y luego se infectaron con 30 MOI de AdTRβ. Las células fueron incubadas en medio con T3 y /o FTI para un adicional de 24 o 72 h. el número de células relativas se determinaron mediante el establecimiento de manera arbitraria el valor de los cultivos de control se incubaron en medio libre de T3 a 1. Los datos se expresan como medias ± S. D. (
n
= 6). *,
p Hotel & lt; 0,05. Como se muestra en la Fig. *,
p Hotel & lt; 0,05. *,
p Hotel & lt; 0,05.