Extracto
La evidencia acumulada indica que los macrófagos activan las células madre mesenquimales (MSC) para adquirir el fenotipo proinflamatorio. Sin embargo, sigue siendo desconocida la función de MSCs activado por los macrófagos en el cáncer gástrico. En este estudio, se encontró que las MSC se activaron por los macrófagos para producir mayores niveles de citoquinas inflamatorias. la formación de colonias de células y ensayos de migración transwell revelaron que los sobrenadantes de las MSC activados podrían promover tanto las células epiteliales gástricas y la proliferación de células de cáncer gástrico y la migración. Además, la expresión de transición epitelial-mesenquimal (EMT), la angiogénesis, y los genes relacionados con stemness-se incrementó en MSCs activados. Las formas fosforiladas de NF-kappa B, ERK y STAT3 en células gástricas se incrementaron en un MSC activos. La inhibición de la activación de NF-kB por PDTC bloqueó el efecto de MSCs activadas en células de cáncer gástrico. Co-inyección de MSCs activados con células de cáncer gástrico podría acelerar el crecimiento del cáncer gástrico. Por otra parte macrófagos, monocitos de sangre periférica humana derivan también activan las MSC para provocar la proliferación de células de cáncer gástrico y la migración. Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren que las MSC activados por los macrófagos adquieren el fenotipo proinflamatorio y el crecimiento símbolo del cáncer gástrico de una manera NF-kappa B-dependiente, lo cual ofrece nuevas pruebas para la modulación de las MSC por microambiente tumoral y una mayor comprensión de la función del estroma Las células en la carcinogénesis gástrica y la progresión del cáncer
Visto: T. Yang, Zhang X, Wang M, Zhang J, Huang M, Cai J, et al. (2014) La activación de las células madre mesenquimales de crecimiento del cáncer gástrico Avisos Los macrófagos humanos a través de NF-kB Camino. PLoS ONE 9 (5): e97569. doi: 10.1371 /journal.pone.0097569
Editor: Hiromu Suzuki, de la Universidad Médica de Sapporo, Japón
Recibido: 18 de febrero, 2014; Aceptado: April 21, 2014; Publicado: 13 de mayo de 2014
Derechos de Autor © 2014 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el plan de Investigación Mayor de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención Nº 91.129.718), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (concesión no. 81302119, 81201660, 81071421), la provincia de Jiangsu para el equipo de innovación excepcional Sci-tecnología en Los colegios y las universidades (Grant. no SJK2013-10), el Proyecto de la provincia de Jiangsu de transformación científica e innovación tecnológica y Logros (Grant no.BL2012055), de la provincia de Jiangsu excepcional Líder Académico Programa Médico y equipo de innovación científico-técnica (Grant no.LJ201117), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Jiangsu (Grant no.BK2012709, BK20130540), Fundación Programa de Doctorado del Ministerio de Educación del Estado (concesión no. 20113227110011), la provincia de Jiangsu para Natural Scicence Investigación en Universidades (13KJB320001). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico es una de las enfermedades malignas más frecuentes y mantiene una causa principal de mortalidad por cáncer en todo el mundo [1], [2]. En China, hay cerca de 360.000 personas mueren de cáncer gástrico cada año [3]. Aunque la incidencia ha disminuido en los últimos años en Occidente, la supervivencia es aún peor [4]. En las últimas décadas, gran esfuerzo ha sido ejercida para dilucidar la patogénesis del cáncer gástrico. Sin embargo, el complejo mecanismo de la carcinogénesis gástrica aún no está cubierta. La acumulación de pruebas indica que la inflamación crónica a largo plazo es una de las principales causas de la tumorigénesis. La liberación de mediadores pro-inflamatorios y aumento de los niveles locales de especies de oxígeno y nitrógeno puede contribuir a la carcinogénesis [5]. La producción desregulada de citoquinas en microambiente inflamatoria estimula la expresión de genes asociados con el desarrollo del cáncer y modifica las características estructurales de microambiente para acelerar la iniciación y progresión del cáncer [6] - [9].
microambiente tumoral se compone de varias células del estroma , incluyendo la infiltración de células inmunes, fibroblastos de carcinoma asociado (CAF), células madre mesenquimales (MSC), y la sangre y redes vasculares linfáticos. Estas células interactúan entre sí y constituyen microambiente inflamatorio y contribuyen a la tumorigénesis [10], [11]. Entre las células del estroma, macrófagos, como células reguladoras inmunes importantes, juegan un papel dominante en la gestión de la inflamación en microambiente tumoral. Por ejemplo, los macrófagos aislados de microambiente tumoral de pacientes con cáncer de mama citocinas quimiotácticas secretos para aumentar la metástasis de células de carcinoma de [12]. Los macrófagos también se han demostrado para promover la respuesta inflamatoria y la tumorigénesis a través de un impacto sobre la expresión de citoquinas inflamatorias y la modificación de los programas oncogénicos moleculares dentro de las células epiteliales [13].
Las células madre mesenquimales (MSCs) son otro componente importante del tumor microambiente y se consideran como las células precursoras de cáncer asociado células mesenquimales y las células endoteliales [14]. Los estudios anteriores han indicado que los factores solubles secretas MSCs para promover la proliferación de células cancerosas y la metástasis [10]. En un modelo de cáncer gástrico asociado con la inflamación, las MSC podrían ser activados hacia CAF para aumentar la inflamación crónica y la progresión del cáncer [15]. Además, se ha informado de MSCs de reclutar monocitos /macrófagos para promover el crecimiento del tumor de una manera CCR2-depedent [16]. Las interacciones entre los macrófagos y las MSC producen un fenotipo proinflamatorio activado con alta CXCL10 y la secreción de IL-6, lo que puede influir en el microambiente inflamatorio [17].
El cáncer gástrico es un modelo clásico de la inflamación crónica con el cáncer. Sin embargo, el papel de las MSC activados por los macrófagos en el cáncer gástrico y el mecanismo subyacente aún no se conocen. En este estudio, se encontró que las MSC fueron fuertemente activados por los macrófagos bajo condición inflamatoria, que producen citocinas inflamatorias y los factores promotores de tumores, que conduce a la mejora de la proliferación gástrica epitelial celular y el cáncer celular y la migración a través de la activación de la vía NF-kB. Nuestros resultados indican que los macrófagos activados por MSC promueven el crecimiento y la progresión del cáncer gástrico en condiciones inflamatorias.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
línea celular de cáncer gástrico humano HGC-27, línea humana de células epiteliales gástricas GES-1, y la línea celular monocítica humana THP leucemia aguda-1 se adquirieron en el Instituto de Bioquímica y Biología celular de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china). GES-1 y células THP-1 se cultivaron en medio RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) con suero bovino fetal al 10% (FBS, Invitrogen), y las células HGC-27 se mantuvieron en-alta glucosa DMEM (H -DMEM, Invitrogen) con 10% de FBS. MSCs se derivaron de cordón umbilical y se cultivaron en DMEM bajo en glucosa (L-DMEM, Invitrogen) con 10% de FBS. Las células fueron todos incubaron a 37 ° C en una incubadora de cultivo de células humidificado con 5% de CO
2. Los tejidos del cordón umbilical frescas se obtuvieron de las madres puérperas sanas después se obtuvo el consentimiento informado por escrito. MSCs se aislaron y caracterizaron como se ha descrito anteriormente [18]. Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Jiangsu. Se seleccionaron las MSC en el paso 3 para los experimentos.
sobrenadante Preparación
Para la preparación de los macrófagos asociados sobrenadante MSC, MSC (3 × 10
5) Se sembró a adherirse. Se añadieron células THP-1 (relación 1:01) con medio fresco en presencia o ausencia de LPS (1 mg /ml). Después de co-cultivo durante 48 h, el medio se desechó y las células se lavaron suavemente con PBS para eliminar las células THP-1. Los sobrenadantes de las MSC activados Se recogieron 24 horas más tarde, se filtró con un filtro-0,22 um y se almacena a -80 ° C hasta su uso. Cuando se utiliza para los análisis de la función celular, los sobrenadantes de las MSC activados se mezclaron con un volumen igual de 10% de FBS que contiene H-DMEM o medio RPMI-1640. Por vía de análisis de señalización, las células se trataron con los sobrenadantes de las MSC activados durante 1 h
Luminex Ensayo
citoquina humana & amp.; quimiocina perlas magnéticas juego de paneles (# HCYTOMAG-60K) (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) fue diseñado para detectar el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor-BB (PDGF-BB) de crecimiento derivado de plaquetas, de monocitos en proteínas 1 (MCP-1), factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), IL-10, IL-1β, IL-4, IL-6 y IL-8 en el sobrenadante de activado MSC. Todos los procedimientos fueron procesados de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las señales se detectaron y se analizaron mediante el Sistema de Luminex200 (Millipore).
Transwell migración Ensayo
Después del tratamiento con los sobrenadantes de las MSC activados durante 48 h, GES-1 y las células HGC-27 ( 1 × 10
5 /pocillo) se pusieron en la cámara superior (8 micras) (Corning, NY, EE.UU.) en medio libre de suero. El medio completo se colocó en la cámara inferior. Después de la incubación durante 12 h, las células restantes en la parte inferior de la membrana de policarbonato fueron borradas con hisopos de algodón. Las células que migran a la superficie inferior de la membrana se fijaron con metanol durante 30 min. Las células migradas se tiñeron con cristal violeta durante 15 minutos y se contaron en seis campos aleatorios bajo el microscopio (100 aumentos).
Formación de colonias de células de ensayo
Las células se recogieron después del tratamiento con los sobrenadantes de MSC durante 48 h y se sembraron en placas de 6 pocillos (1000 células /pocillo) y se cultivaron durante 10 días. El medio se cambió cada tres días. Al final del período de crecimiento, las células se fijaron con metanol durante 30 min y se tiñeron con cristal violeta durante 15 minutos. Las colonias de células se fotografiaron y se contó el número de colonias para el análisis estadístico.
Extracción de ARN y PCR en tiempo real
El ARN total se extrajo usando el reactivo Trizol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante . Cinco microgramos de RNA se utilizó para el análisis de PCR cuantitativa en tiempo real. β-actina se utilizó como control interno. Las secuencias de los primers específicos fueron listadas en la Tabla S1.
Western Blot
Las células se lisaron y se homogeneizaron en tampón RIPA suplementado con inhibidores de la proteasa completos. La misma cantidad de proteínas (200 mg) se resolvió en 12% SDS-PAGE. Las proteínas después se transfirieron a membranas de PVDF después de la electroforesis. Después bloqueado en 5% (w /v) de leche no grasa durante 1 h a temperatura ambiente, las membranas se incubaron a continuación a sus respectivas diluciones apropiadas de anticuerpos primarios específicos durante la noche a 4 ° C. Las fuentes de anticuerpos primarios fueron: anti-Oct4, Sox2 anti, anti-vimentina y anti-fosfo-STAT3 (Signalway de anticuerpos, EE.UU.), anti-GAPDH (Kangcheng, Shanghai, China), anti-E-cadherina, anti- ERK1 /2, anti-fosfo-ERK1 /2 y anti-N-cadherina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), anti-PCNA, anti-STAT3, anti-NF-kappa B, anti-fosfo-NF kappa B, anti-CyclinD1, anti-VEGF y anti-c-Jun (Bioworld Tecnología, Louis Park, MN, EE.UU.), anti-c-myc (Proteintech Group, Chicago, IL, EE.UU.).
Animal modelo
de tres a cinco semanas de edad /c ratones desnudos BALB fueron adquiridos de Slac Laboratory Animal Center (Shanghai, china). Los animales fueron mantenidos de acuerdo con las políticas institucionales, y se realizaron todos los estudios con la aprobación del Comité Universitario de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Jiangsu. HGC-27 células (1 × 10
6) y MSCs (5 × 10
5) se tripsinizaron, se lavaron y se resuspendieron en 200 l de PBS, respectivamente. A continuación, se mezclaron las células y se co-inyectaron en el costado izquierdo de ratones desnudos. Los tumores se extirpan quirúrgicamente 20 días después de la inyección, fotografiados y ponderados. El tamaño del tumor se evaluó mediante la medición del calibre y se calculó en base a la fórmula del elipsoide modificado (L x W x W /2), donde L representa la longitud y la anchura W representa.
La inmunohistoquímica
formalina secciones de tejidos tumorales de ratón fijado embebido en parafina fueron desparafinados por primera vez en xileno, rehidratada a través etanol clasificado. Las secciones se hirvieron durante 10 min en tampón de citrato (pH 6,0, 10 mM) para la recuperación de antígeno. La actividad peroxidasa endógena fue inhibida con la exposición al peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 min. A continuación, las secciones se bloquearon con 5% de BSA (Boster Bioingeniería, Wuhan, China) y se incubaron con PCNA diluida adecuada o anticuerpo primario VEGF a 37 ° C durante 1 h. Después de lavado con PBS, las secciones se incubaron con anticuerpo secundario diluido durante 20 min. Por último, las secciones se visualizaron con 3,3 'diaminobencidina (DAB) y luego contraste con hematoxilina para su examen al microscopio óptico (200 aumentos).
Los monocitos humanos primarios Aislamiento
Se obtuvieron monocitos humanos de la capa leucocitaria de muestras de sangre periférica donados por donante sano utilizando Ficoll (Histopaque-1077) (Sigma, EE.UU.). Fresh RPMI 1640 suplementado con 10% FBS se cambiaron cada 2 días, y se eliminaron las células no adherentes y se purifica. Los monocitos se incubaron durante 7 días y 50 ng /ml se añadió M-CSF para obtener macrófagos (M). A continuación, se recogió y se filtró a 24 h sobrenadante secretada por los macrófagos. MSCs adherentes se trataron con el sobrenadante de macrófagos en ausencia o presencia de LPS (1 mg /ml) durante 48 h y se lavaron. Los sobrenadantes de MSC activadas se recogieron 24 horas más tarde y se utilizan para el seguimiento de los estudios.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el software SPSS 16.0. Los datos se presentan como media ± desviación estándar. Las diferencias en los diferentes grupos se analizaron mediante ANOVA de una vía. Las diferencias entre tratamientos fueron probados por PDTC
t
prueba. Estadística
P
valor & lt; 0,05 se consideró significativo
Resultados
Co-cultivo con macrófagos Bajo inflamatoria Condición regulado hasta la expresión de citoquinas inflamatorias y stemness genes en. MSCs
para investigar el efecto de los macrófagos en MSCs bajo condición inflamatoria, co-cultivadas con MSC células THP-1 en ausencia o presencia de LPS (1 mg /ml) durante 48 h. THP-1 células se eliminaron por PBS de lavado y los MSCs adherentes se cultivaron en medio fresco durante 24 h adicionales (Figura S1). Se llevó a cabo el ensayo Luminex para determinar los niveles de varios factores inflamatorios en los sobrenadantes de las MSC. Los resultados mostraron que la producción de IL-6, IL-8, TNF-α, MCP-1, VEGF y G-CSF aumentó de forma significativa en el sobrenadante de MSC co-cultivadas con células THP-1 en presencia de LPS. Se observaron niveles bajos o indetectables de estas citoquinas en MSCs que no eran co-cultivadas con células THP-1 (Figura 1A). Para confirmar el aumento de la expresión de estas citoquinas inflamatorias, preformamos PCR en tiempo real para detectar los niveles de mRNA de estas citoquinas. Se encontró que en consonancia con los resultados del ensayo Luminex (Figura 1B), co-cultivo con células THP-1 regulados hasta los niveles de mRNA de IL-6, IL-8 y TNF-α en las MSC. Para determinar si el co-cultivo con células THP-1 afecta a la troncalidad de las MSC, se detectó la expresión de Oct4 y Sox2 en el MSC mediante el uso de Western blot. Los resultados mostraron que tanto Oct4 y Sox2 los niveles de proteína se incrementaron en MSCs que eran co-cultivadas con células THP-1 (Figura 1C). Para confirmar aún más este fenómeno, que también examinó los niveles de mRNA de Oct4 y Sox2 en el MSC. Los resultados de PCR en tiempo real demostraron que co-cultivo con células THP-1 regula up-la expresión de genes Oct4 y Sox2 en MSCs (Figura 1D). En general, estos resultados sugieren que las MSC se activaron de manera significativa a producir mayores niveles de citoquinas inflamatorias por las células co-cultivaron células THP-1 bajo condición inflamatoria.
(A) ensayo de Luminex para IL-6, IL-8, TNFa, MCP-1, VEGF y G-CSF niveles en los sobrenadantes de las MSC. análisis (B) PCR en tiempo real de IL-6, IL-8, TNF, MCP-1, VEGF y la expresión de ARNm de TGF-β en las MSC. ***
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P Hotel & lt; 0,01, *
P Hotel & lt; 0,05. análisis (C) Western blot de Oct4 y Sox2 niveles de proteína en las MSC. análisis (D) PCR en tiempo real de la expresión de Oct4 y Sox2 ARNm en las MSC. ***
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Macrophages- MSC activados mejorado la proliferación y migración de células epiteliales gástricas
los macrófagos y las MSC son componentes importantes del microambiente tumoral. Para demostrar el papel funcional de MSCs macrófagos activados, se recogieron los sobrenadantes de las MSC activados y se incubaron con línea de células epiteliales gástricas GES-1 durante 48 h. A continuación realizó ensayo de formación de colonias de células para evaluar la proliferación de las células GES-1. Como se muestra en la Figura 2A, las células incubadas con el sobrenadante de MSC activados crecieron más rápidamente y forman más y más grandes colonias que los de otros grupos. Además, la incubación con el sobrenadante de MSC activados también aumentó los niveles de proteína de PCNA y VEGF en GES-1 en las células (Figura 2B). Los resultados de ensayo de migración transwell mostraron que el número de migrado GES-1 en las células en las MSC activados más grupo LPS era más que eso en otros grupos (Figura 2C). Los resultados de los análisis Western blot demostraron que las MSC macrófagos activados aumentan la expresión de marcadores de células mesenquimales (N-cadherina y vimentina) y la disminución de la expresión de marcador de células epiteliales (E-cadherina) en GES-1 en las células (Figura 2D). A continuación se determinó la expresión de VEGF, MMP9 y TGF-β mediante el uso de PCR en tiempo real. Como se muestra en la Figura 2E, la incubación con el sobrenadante de MSC Activar más grupo LPS hasta reguladas la expresión de VEGF, MMP9 y TGF-β en células GES-1. Por lo tanto, las MSC activados por los macrófagos en ambiente inflamatorio promueven significativamente la proliferación de células epitelio gástrico y la migración.
(A) Imágenes representativas de ensayo de formación de colonias de células y el histograma del número de colonias. Los datos se muestran como media ± desviación estándar de tres pozos. **
P Hotel & lt; 0,01, *
P Hotel & lt; 0,05. (B) ensayos de Western blot para PCNA y los niveles de proteína VEGF. (C) Imágenes representativas de ensayo de migración transwell y el histograma del número de células migradas GES-1. Magnificación, × 100, barra de escala = 50 micras. ***
P Hotel & lt; 0,001, **
P Hotel & lt; 0,01, *
P Hotel & lt; 0,05. (D) ensayos de Western blot para la E-cadherina, N-cadherina y los niveles de proteína Vimentina. análisis (E) PCR en tiempo real de VEGF, MMP9 y la expresión de ARNm de TGF-β. **
P Hotel & lt; 0,01, *
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Los macrófagos activados por las MSC promovido el crecimiento y la migración de células de cáncer gástrico
Dado que los macrófagos activados por MSC afectan a la proliferación de células epiteliales gástricas y la migración, se determinó el efecto de la próxima MSC macrófagos activados por sobre el cáncer gástrico humano HGC-27 células. Los resultados de ensayo de formación de colonias de células mostraron que HGC-27 células incubadas con el sobrenadante de MSC macrófagos activados crecieron más rápidamente y formaron clones más grandes que los otros grupos (Figura 3A). análisis de los pernos Western mostraron que los niveles de proteína de PCNA y VEGF en HGC-27 células fueron significativamente hasta reguladas por el sobrenadante de MSC macrófagos activados (Figura 3B). ensayo de migración Transwell reveló que el número de células HGC-27 migrado se aumentó notablemente por el sobrenadante de MSC macrófagos activados (Figura 3C). Los análisis de transferencia Western mostró que las MSC macrófagos activados induce la expresión de marcadores de células mesenquimales (N-cadherina y vimentina) y inhibieron la expresión de marcador de células epiteliales (E-cadherina) en HGC-27 células (Figura 3D). Los niveles de mRNA de VEGF, MMP9 y TGF-β también se incrementaron en HGC-27 células después del tratamiento con el sobrenadante de MSC macrófagos activados (Figura 3E). Teniendo en cuenta que stemness célula cancerosa está fuertemente ligada a su migración, se detectó la expresión de genes de troncalidad en HGC-27 células. La expresión de Oct4 y Sox2 fue notablemente hasta reguladas por el sobrenadante de MSC-macrófagos activados (Figura 3F). En consonancia con el tiempo real de los resultados de PCR, los niveles de proteína de Oct4 y Sox2 también se incrementaron en HGC-27 células por el sobrenadante de MSC macrófagos activados (Figura 3G). En resumen, estos resultados sugieren que los macrófagos activados-MSCs también promueven el crecimiento de células de cáncer gástrico, la migración a través de la inducción de EMT y stemness célula bajo condición inflamatoria.
(A) Imágenes representativas de ensayo de formación de colonias de células y el histograma de número de colonias. Los datos se muestran como media ± desviación estándar de tres pozos. *
P Hotel & lt; 0,05. (B) ensayos de Western blot para PCNA y los niveles de proteína VEGF. (C) Imágenes representativas de transwell ensayo de migración y el histograma del número de células HGC-27 migrados. Ampliación, × 100; barra de escala = 50 micras. ***
P Hotel & lt; 0,001, **
P Hotel & lt; 0,01. (D) ensayos de Western blot para la E-cadherina, N-cadherina y los niveles de proteína Vimentina. análisis (E) PCR en tiempo real de VEGF, MMP9 y la expresión de ARNm de TGF-β. ***
P Hotel & lt; 0,001, *
P Hotel & lt; 0,05. (F) Ensayo de Western blot para los niveles de proteína Oct4 y Sox2 en HGC-27 células. análisis (G) PCR en tiempo real de la expresión de Oct4 y Sox2 mRNA. **
P Hotel & lt; 0,01, *
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Los macrófagos activados por las MSC Promovido proliferación de células gástricas y migración a través de NF-kB Camino
con el fin de explorar el mecanismo responsable de la función de promoción de las MSC macrófagos activados en la proliferación celular y la migración, se determinó la expresión de varios transductores de señalización clave para la inflamación y el cáncer, incluyendo STAT3, ERK y NF-kB, en las células epiteliales gástricas y células de cáncer gástrico. Los resultados de los análisis Western blot mostraron que los niveles de p-STAT3, p-ERK y p-NF-kappa B fueron significativamente mayores en las células GES-1 tratados con los sobrenadantes de las MSC activados que los de otros grupos. El nivel de proteína NF-kB tenía ningún cambio, mientras que la de ERK y STAT3 disminuyó ligeramente (Figura 4A). Los aumentos en p-STAT3, p-ERK y los niveles de proteína p-NF-kB se observaron también en HGC-27 células después del tratamiento con los sobrenadantes de las MSC activados (Figura 4B). Se confirmó la regulación de p-STAT3, p-ERK y los niveles de proteína p-NF-kB por los sobrenadantes de las MSC activados en otra línea celular de cáncer gástrico SGC7901 (Figura S2). Para determinar si los genes diana aguas abajo también se activaron en HGC-27 células, se analizó la expresión de ciclina D1, C-myc y c-Jun proteínas. Como se muestra en la Figura 4C, los niveles de proteína de la ciclina D1 y C-Jun fueron elevados después del tratamiento con los sobrenadantes de las MSC activados
.
(A) GES-1 y (B) células HGC-27 tratadas con los sobrenadantes de las MSC activados. La expresión de p-STAT3, STAT3, p-ERK, ERK, p-NF-kB, y NF-kB proteínas se determinaron mediante el uso de transferencia Western. (C) ensayos de Western blot para la ciclina D1, C-myc, y los niveles de proteína c-Jun en HGC-27 células. (D) los ensayos de Western blot para p-NF-kappa B y los niveles de proteína NF-kB en HGC-27 células que se trataron con los sobrenadantes de las MSC activado en presencia o ausencia de PDTC (100 nM). El número de colonias de células (E) y células migradas (F) para las células HGC-27 tratadas con diferentes sobrenadantes de MSC en la presencia o ausencia de PDTC (100 nM). análisis (G) PCR en tiempo real de VEGF, MMP9, y la expresión de ARNm de TGF-β en células HGC-27 tratadas con diferentes sobrenadantes de MSC en la presencia o ausencia de PDTC (100 nM). **
P Hotel & lt; 0,01, *
P
. & Lt; 0,05
Para determinar si el futuro NF-kB juega un papel importante en las funciones de activado MSCs, HGC-27 células fueron pre-tratados con PDTC para inhibir la fosforilación de NF-kappa B y luego incubadas con los sobrenadantes de las MSC activados. Hemos encontrado que la inducción de la fosforilación de NF-kB por MSCs activados en HGC-27 células fue marcadamente inhibida por PDTC (Figura 4D). Los resultados de la formación de colonias de células y ensayos de migración transwell mostraron que la mayor proliferación y migración de HGC-27 células por las MSC activados se redujeron significativamente en los grupos tratados con PDTC (Figuras 4E y 4F). Además, el tratamiento PDTC también inhibió la sobre regulación de VEGF, MMP9 y TGF-β por las MSC activados en HGC-27 células (Figura 4G). Tomados en conjunto, estos resultados indican que las MSC activados rápida de células epiteliales gástricas y proliferación celular de cáncer gástrico y de migración a través de NF-kB.
Los macrófagos activados por las MSC promovió el crecimiento del cáncer gástrico in vivo
Dado el evidencia de que las MSC macrófagos activados-podrían aumentar la proliferación de las células gástricas
in vitro
, nos preguntamos si estos MSC ejercieron la promoción de papel en el crecimiento del cáncer gástrico
in vivo
. Por lo tanto, coinyecta HGC-27 celdas con las MSC activadas en ratones desnudos. Veinte días más tarde, los tejidos tumorales se retiraron, medidos y ponderados. Como se muestra en las Figuras 5A y 5B, los tumores de xenoinjerto en el grupo de MSCs co inyectado activadas eran más grandes que las de otros grupos. Se realizaron análisis inmunohistoquímicos para determinar la expresión de proteínas relacionadas con el crecimiento y factores pro-angiogénicos en los tejidos tumorales. Se observó la tinción positiva más fuerte de PCNA y VEGF en el grupo activado MSC co-inyectados (Figura 5C). Análisis en tiempo real de PCR se llevaron a cabo para detectar la expresión de VEGF, MMP9 y TGF-β en los tejidos tumorales. Hemos encontrado que la expresión de todos estos genes en los grupos co-inyectados se mayor que en HGC-27 células grupo sola (Figura 5D). Los resultados del análisis en tiempo real PCR mostraron que los niveles de mRNA de Oct4, Sox2 y Sall4 fueron los más altos en el grupo activado MSC co-inyectados (Figura 5E). En resumen, estos datos indican que las MSC macrófagos activados símbolo del crecimiento del cáncer gástrico
in vivo
.
(A) Imágenes representativas de los tejidos tumorales de xenoinjerto y (B) el volumen y el peso del tumor tejidos extraídos de los ratones inyectados con HGC-27 células solas o junto con MSCs. análisis (C) inmunohistoquímico de los niveles de PCNA y proteína VEGF en los tejidos tumorales. Ampliación, × 200; barra de escala = 50 micras. (D) en tiempo real los análisis PCR de VEGF, MMP9, y la expresión de ARNm de TGF-β en los tejidos tumorales. ***
P Hotel & lt; 0,001, **
P Hotel & lt; 0,01, *
P Hotel & lt; 0,05. análisis (E) PCR en tiempo real de la expresión de Oct4, Sox2, y Sall4 mRNA en tejidos tumorales. *** P
Restaurant & lt; 0,001, ** P
Hotel & lt; 0,01, * P
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Los monocitos primarios MSC activados para impulsar al proliferación celular de cáncer gástrico y la migración a través de NF-kappa B
para confirmar aún más la activación de las MSC por los macrófagos para provocar la proliferación de células de cáncer gástrico y la migración, se aislaron los monocitos de sangre periférica humana y se recoge el sobrenadante de monocitos diferenciados macrófagos. Después de la incubación con el sobrenadante a partir de monocitos macrófagos diferenciados, las MSC se recogieron y el ARN total se extrajo de análisis en tiempo real PCR. Como se muestra en la Figura 6B, el tratamiento con el sobrenadante de monocitos macrófagos diferenciados hasta reguladas los niveles de ARNm de IL-6, IL-8, MCP-1 y VEGF en MSCs. a continuación, se incubaron células de cáncer gástrico con el sobrenadante de las MSCs activados. Los resultados de la formación de colonias de células y ensayos de migración transwell mostraron que el sobrenadante de las MSC activados mejorar la proliferación y migración de HGC-27 células (Figuras 6C y 6D). Además, demostró que la incubación con sobrenadantes de las MSC activados aumentó la expresión de p-STAT3, p-ERK y p-NF-kB en HGC-27 células (Figura 6E). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que, en consonancia con las células THP-1, macrófagos primarios humanos también activan MSCs para provocar la proliferación de células de cáncer gástrico y la migración a través de NF-kB.
análisis (A) PCR en tiempo real de la expresión de IL-6, IL-8, MCP-1, y el ARNm de VEGF en las MSC. ***
P Hotel & lt; 0,001, **
P Hotel & lt; 0,01, *
P Hotel & lt; 0,05. (B) Imágenes representativas de las colonias de células y el histograma del número de colonias. Los datos se muestran como media ± desviación estándar de tres pozos. **
P Hotel & lt; 0,01, *
P Hotel & lt; 0,05. (C) Imágenes representativas de transwell ensayo de migración y el histograma del número de células HGC-27 migrados. Ampliación, × 100; barra de escala = 50 micras. **
P Hotel & lt; 0,01. (D) ensayos de Western blot para p-STAT3, STAT3, p-ERK, ERK, p-NF-kB, y NF-kB niveles de proteína en HGC-27 células.
Discusión
Durante las últimas décadas, el enlace de la inflamación con el cáncer ha atraído mucha atención [5], [6]. La exposición a largo plazo de las células epiteliales a microambiente inflamatorio conduce a la transformación maligna [9], [19]. Las células del estroma se ha demostrado estar implicado críticamente en la progresión de la inflamación con el cáncer mediante la modulación del microentorno inflamatoria [7], [8]. Los macrófagos y MSCs son dos componentes principales del estroma tumoral y participan en la regulación de la extensión de la reacción inflamatoria durante la carcinogénesis [16]. Sin embargo, la interacción entre los macrófagos y las MSC en el cáncer gástrico no ha sido bien caracterizado.
El cáncer gástrico se evolucionó a partir de la gastritis crónica a largo plazo y es un modelo clásico de cáncer relacionado con la inflamación. Hemos aislado previamente MSC residentes de tejidos de cáncer gástrico humano y ha demostrado que las MSC derivados de tejido de cáncer gástrico secretan gran cantidad de citoquinas inflamatorias y promueve la progresión del cáncer gástrico. Durante el proceso de la inflamación, los monocitos /macrófagos podrían ser reclutados para dotar MSCs con características de promotores de tumores [16]. Además,
Helicobacter pylori
inducen inflamación crónica en las células epiteliales gástricas a través de la liberación de LPS existentes en sus paredes celulares. En este estudio, las MSC tratadas previamente con los macrófagos en presencia de LPS para imitar microambiente del cáncer gástrico y para determinar si las MSC macrófagos activados por contribuyen a la progresión del cáncer gástrico. Hemos demostrado que las MSC incubadas con LPS macrófagos y secretan niveles más altos de citoquinas inflamatorias. Un estudio reciente informó que la estimulación continua con MSCs inducida por macrófagos medio acondicionado para adquirir un fenotipo pro-inflamatoria [17]. En consonancia con su estudio, se encontró que el tiempo de incubación corta con macrófagos también activó MSC para producir mayores niveles de citoquinas inflamatorias.
epitelio-mesenquimal transición (EMT) es un proceso importante durante la metástasis del cáncer [20]. A través de los años, las propiedades relacionadas con la reprogramación de EMT se han atribuido a mejorar la plasticidad celular en las células cancerosas. cáncer de células madre se ha introducido y demostrado que contribuyen a la tumorigénesis y metástasis del tumor [21] - [24]. Estudios recientes sugieren que una subpoblación de células madre mesenquimales-como-y como está representada una mayor tumorigenicidad en las células epiteliales gástricas
in vitro e in vivo
[25]. En este estudio, se encontró que las MSC activados, que eran co-cultivadas con los macrófagos en presencia de LPS, podrían mejorar notablemente la migración de células epiteliales gástricas, así como células de cáncer gástrico.