Extracto
Antecedentes
Las células tumorales se vuelven adictas a las dos oncogenes activados y para proliferativa y señales pro-supervivencia proporcionados por el microambiente del tumor anormal. Aunque numerosos factores solubles se han identificado que dan forma a la diafonía entre las células tumorales y el estroma, que no se ha establecido cómo las mutaciones oncogénicas en las células tumorales alteran su interacción con las células normales en el microambiente tumoral.
Principales conclusiones
Hemos demostrado que el HCT116 células isogénicas y hke-3, que se diferencian sólo por la presencia del alelo mutante del gen KRAS, tanto estimulan los macrófagos para producir IL1β. A su vez, los macrófagos mejorado la señalización de Wnt, la proliferación y la supervivencia en tanto HCT116 y células hke-3, lo que demuestra que la señalización por Kras oncogénicas en las células tumorales no tiene impacto en su interacción con los macrófagos. HCT116 células son heterocigóticos para β-catenina (HCT116
WT /MT), que alberga uno de tipo salvaje (WT) y un alelo mutante (MT), pero las líneas isogénicas que transportan sólo el WT (HCT116
WT) o MT β-catenina alelo (HCT116
TM) se han generado. Hemos demostrado que los macrófagos promueven la señalización Wnt en las células que llevan el alelo MT β-catenina, pero no en las células HCT116
WT. En consonancia con esta observación, macrófagos y IL1β no lograron estabilizar Snail en HCT116
células WT, y para proteger a estas células de la apoptosis inducida por TRAIL. Por último, hemos demostrado que las células HCT116 que expresan TCF4 dominante negativo (dnTCF4) o células HCT116 con el caracol silenciado fallaron en estimular la producción de IL1β en los macrófagos, lo que demuestra que las células tumorales activan los macrófagos a través de un factor de Wnt-dependiente.
Importancia
Nuestros datos demuestran que las mutaciones oncogénicas β-catenina en las células tumorales, y la posterior activación de la señalización de Wnt, no alteraciones de células intrínseca sólo gatillo, pero también tienen un impacto significativo en la diafonía de las células tumorales con los macrófagos asociados a tumores.
Visto: Kaler P, L Augenlicht, Klampfer L (2012) la activación de mutaciones en β-catenina en las células del cáncer de colon alterar su interacción con los macrófagos; el papel de caracol. PLoS ONE 7 (9): e45462. doi: 10.1371 /journal.pone.0045462
Editor: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, Japón
Recibido: 18 Junio, 2012; Aceptado: August 22, 2012; De publicación: septiembre 21 de, 2012
Copyright: © Kaler et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por CA 111361 (LK), U54 CA 100926 (a Los Ángeles) y P30-13330 del Instituto Nacional del cáncer (National Cancer Institute (EE.UU.)). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Beta catenina (β-catenina) es una proteína de unión de cadherina e y por lo tanto juega un papel importante en la adhesión célula-célula [1]. Además, actúa como un efector de la señalización de Wnt [2]. En ausencia de señalización Wnt β-catenina es fosforilada por GSK3, lo que resulta en su ubiquitinación y la posterior degradación en el proteasoma [3]. La actividad de β-catenina es controlado por el supresor de tumor poliposis adenomatosa coli (APC) y las mutaciones inactivantes en el gen Apc, que previenen la degradación de β-catenina, se encuentran en la gran mayoría de los cánceres colorrectales esporádicos [4], [5] . Además, aproximadamente el 10% de los cánceres colorrectales llevar a mutaciones en el sitio de fosforilación de GSK3 se encuentra en el N-terminal de β-catenina [6]. mutaciones APC y mutaciones de β-catenina se excluyen mutuamente en el cáncer de colon, ya que ambos conducen a la estabilización de β-catenina y en constitutiva β-catenina /TCF transcripcional actividad.
células HCT116 son heterocigóticos para β-catenina, albergar un alelo de tipo salvaje (WT) y un mutante (MT) alelo con la inactivación de Ser45, uno de los residuos fosforilados por GSK3 que está mutado frecuencia en los tumores [6], [7]. líneas celulares HCT116 isogénicas que transportan sólo WT o MT alelo se han generado para estudiar el papel de la señalización de β-catenina oncogénica en el cáncer de colon [8], [9]. Como era de esperar, la deleción de la MT alelo β-catenina en las células HCT116 redujo significativamente β-catenina /TCF actividad transcripcional mediada en estas células. Mientras que los niveles totales de β-catenina fueron similares en células con interrumpido WT o MT alelo β-catenina, la inactivación del alelo MT resultó en la redistribución de la β-catenina a las membranas celulares asociados con uniones de las células [8], [9]. Sorprendentemente, la expresión de los genes diana de Wnt típicos, tales como c-myc, no se redujo debido a la supresión del mutante alelo β-catenina, y características de crecimiento de estas células en condiciones estándar no se vieron afectados significativamente
in vitro
[ ,,,0],8]. Estos resultados sugieren que las mutaciones en β-catenina, además de iniciar una plétora de alteraciones intrínsecas de células, pueden también afectar a la interacción de las células tumorales con los componentes del microambiente del tumor y por lo tanto contribuir al desarrollo de tumores
in vivo
.
Nos informó recientemente de que el factor (s) de origen de las células tumorales activa los macrófagos para producir IL1β, que a su vez inactiva GSK3, el aumento de los niveles de β-catenina no fosforilada y estimuló la señalización Wnt en las células HCT116 [10]. Hemos demostrado que los factores derivados de macrófagos estimulados señalización Wnt de una manera NF-KB dependiente de [11]. Consistente con esto, la activación constitutiva de IKK2 en células epiteliales intestinales, que es suficiente para inducir tumores intestinales en ratones, desencadena la movilización de los macrófagos y la expresión de una variedad de citocinas proinflamatorias, incluyendo TNF y IL1β [12], y las células con la activación constitutiva de IKK2 representada activada la señalización de Wnt
a:. se compararon las células HCT116 y hke-3 por su capacidad para inducir IL1β en monocitos de sangre periférica (Mo). La capacidad de los macrófagos y THP1 IL1β para inducir la señalización Wnt en HCT116 y hke-3 células (B), para promover el crecimiento clonogénico (C) y para proteger frente a la apoptosis inducida por TRAIL (D) se midió.
mostró que los factores derivados de macrófagos estabilizan Snail en células de cáncer de colon [13], un factor de transcripción que promueve el fenotipo invasivo y metastásico través de la inducción de una transición epitelial mesenquimal (EMT) [14]. Snail es un gen diana de Wnt [15], [16], pero también se ha demostrado que interactúan con β-catenina y para co-estimular Wnt genes diana [15] - [17], lo que indica una intrincada interacción entre la señalización Wnt y Caracol. Además, Snail regula el crecimiento y la supervivencia de las células tumorales, y se ha relacionado con la formación de células madre del cáncer [18]. El aumento de la señalización de Wnt y la estabilización de Snail por lo tanto, sugieren fuertemente que los factores derivados de macrófagos aumentan las propiedades de células madre de las células cancerosas, que contribuyen a la metástasis y muestran resistencia a la terapia. En consonancia con esto, hemos demostrado que los factores derivados de macrófagos protegidos células tumorales de la apoptosis inducida por TRAIL [13]
A:. HCT116 líneas celulares isogénicas con el WT borrado (HCT116
MT) o MT β- catenina alelo (HCT116
WT) se transfectaron con el gen reportero de TOP-LUC y se trataron con concentraciones crecientes de IL1β o se cultivaron con THP1 macrófagos como se indica. B: células HCT116 fueron transfectadas con el gen NF-KB-reportero y se trataron con TNF y IL1β como se indica
Aquí nos muestran que la capacidad de las células HCT116 para estimular los macrófagos es completamente dependiente de la. presencia de la endógeno mutante β-catenina y la posterior estabilización de Snail en células epiteliales, lo que corrobora la hipótesis de que la adquisición de mutaciones oncogénicas en las células epiteliales intestinales altera su interacción con su microambiente. Hemos demostrado que las células de cáncer de colon estimulan los macrófagos a través del producto de un gen diana de Wnt. Nuestros datos sugieren que Snail regula la expresión de este gen y por lo tanto juega un papel crucial en la diafonía entre las células de cáncer de colon y macrófagos
A:. Células HCT116 los padres o HCT116 con borrada WT o MT alelo β-catenina eran tratados con TRAIL en ausencia de THP1 macrófagos o IL1 como se indica. B: Se determinó el grado de apoptosis en 4 experimentos independientes. C:. HCT116
WT y HCT116
células MT se trataron con TRAIL en la ausencia o la presencia de TNF y la extensión de la apoptosis se determinó por tinción PI
Resultados
Las mutaciones en β-catenina, pero no kras, alterar la interacción de células de cáncer de colon con macrófagos
hemos informado de que las células del cáncer de colon, a través de un factor soluble, activan los macrófagos a secretar IL1β, que a su vez promueve la β- catenina /actividad transcripcional TCF4 en las células cancerosas y estimula su crecimiento [10]. Para establecer si la adquisición de la mutación KRAS oncogénicas en las células tumorales altera su interacción con los macrófagos, hemos realizado experimentos en HCT116 y células hke-3, líneas celulares isogénicas que se diferencian sólo por la presencia de la Kras alelo mutante [19]. Hemos demostrado que tanto HCT116 y hke-3 células inducidas IL1β en monocitos de sangre periférica, precursores de los macrófagos asociados al tumor (fig. 1A). En consecuencia, los macrófagos y IL1β estimulan la señalización Wnt (fig. 1B), promovido el crecimiento (Fig. 1C) y HCT116 protegido y células hke-3 frente a la apoptosis inducida por TRAIL (Fig. 1D). Estos estudios demostraron que la presencia de Kras oncogénicas en las células tumorales no tiene un impacto significativo en su interacción con los macrófagos asociados a tumores
A:. Se trataron HCT116
WT y HCT116
células MT: B con TRAIL en la ausencia o la presencia de IL1β como se indica y la localización de β-catenina se determinó por inmunofluorescencia en células tratadas con TRAIL en la ausencia o la presencia de IL-1β o TNF como se indica. B:. La extensión de la activación de la caspasa 8 y la escisión de PARP y β-catenina se determinó por inmunotransferencia
células HCT116 también son heterocigotos para β-catenina, que contiene un alelo de tipo salvaje (WT) y un mutante (MT) alelo con una deleción de 3 pares de bases que elimina el residuo de serina en el codón 45 [7], lo que resulta en la estabilización de β-catenina y la activación de la señalización de Wnt. Para determinar si la presencia de la activado, MT β-catenina en las células tumorales modula su interacción con los macrófagos hemos realizado experimentos en células HCT116 con una deleción de cualquiera de los WT (HCT116
MT) o MT alelo β-catenina (HCT116
WT) [8]. Las líneas celulares isogénicas se trataron con IL1β o se cultivaron con THP1 macrófagos. Al igual que en los padres HCT116 células, los macrófagos y IL1β inducidos señalización Wnt en HCT116
células MT (Fig. 2A). Por el contrario, HCT116
células WT, que mostraron la señalización de Wnt inferior, no respondieron a IL1β o a los macrófagos con un aumento de la señalización de Wnt (Fig. 2A). La capacidad de IL1β y TNF para activar NF-kappa B, la vía de señalización importante activado por estas citoquinas, no se vio afectada por el estado de la β-catenina (Fig. 2B), lo que demuestra la especificidad vía, y es consistente con nuestra anterior conclusión de que NFkB señalización es aguas arriba de señalización Wnt [11]. Estos resultados demostraron que la presencia del alelo MT β-catenina en las células tumorales, lo que resulta en la actividad de β-catenina /TCF4 constitutivo, altera su interacción con los macrófagos
A:. Los macrófagos y IL1β inactivar la actividad GSK3 en HCT116 y hke-3 células. B: Los niveles de Snail se determinaron en células HCT116 que se cultivaron con THP1 macrófagos o se estimularon con IL1β en la ausencia o la presencia de LY294002 como se indica. C: HCT116
WT y HCT116
células MT se cultivaron con THP1 macrófagos o se trataron con IL1β o TNF tal como se indica durante 24 horas. D: La capacidad de los macrófagos y THP1 IL1β recombinante para inducir la señalización de Wnt se comparó en células transfectadas con inespecífica (NSP) o caracol siRNA
Los macrófagos no protegen a las células HCT116 que carecen de la β- MT. catenina alelo de TRAIL la apoptosis inducida por
Hemos demostrado que los factores derivados de macrófagos protegen las células de cáncer de colon de la apoptosis inducida por TRAIL a través de un mecanismo dependiente de la señalización de Wnt [13], lo que sugiere que las células HCT116
WT (que carecen de la alelo mutante β-catenina), que no respondió a los macrófagos con la señalización de Wnt mejorado (Fig. 1), puede aparecer una respuesta alterada a TRAIL. Se han tratado las células HCT116 los padres, HCT116
WT y HCT116
células MT con TRAIL en la ausencia o la presencia de macrófagos o THP1 IL1β. Como se muestra en la Fig. 3, las células HCT116 que carecen del alelo β-catenina mutante (HCT116
WT) mostraron una mayor sensibilidad a la apoptosis inducida por TRAIL, lo cual es consistente con el hecho de que la señalización de Wnt protege las células de la apoptosis inducida por TRAIL [20]. En contraste con los padres células HCT116 y células HCT116 con eliminado WT alelo β-catenina (HCT116
MT), las células HCT116
WT no fueron protegidos de la apoptosis inducida por TRAIL por macrófagos, IL1β (Fig. 3A, B) o por TNF (Fig 3C.)
A:. HCT116 transfectadas con un vector vacío o dnTCF4 fueron co-cultivadas con monocitos primarios de sangre periférica (MO) durante 24 horas y la cantidad de IL1β se determinó por ELISA. B: células HCT116 o hke-3 transfectadas con NSP (no específica) o RNAi específicas del caracol fueron cultivadas con monocitos THP1 y la cantidad de IL1β se determinó por ELISA
A pesar de que albergan células HCT116 mutante β-catenina. mostrar la localización de membrana predominantemente plasma de β-catenina [8]. El tratamiento de células con TRAIL provocó la pérdida de tinción de membrana distinta en tanto HCT116
MT y HCT116
células WT (Fig. 4A), en consonancia con la escisión de β-catenina en células TRAIL-tratado (Fig. 4B) . Sin embargo, mientras que el TNF y IL1β restaurados localización de la membrana de β-catenina en HCT116
células MT, no pudieron contrarrestar el efecto de TRAIL en HCT116
WT células (Fig. 4A). En consecuencia, los macrófagos y IL1β fallaron para inhibir la escisión inducida por TRAIL de β-catenina, la activación de la caspasa-8, y posterior tratamiento de PARP en HCT116
células WT (Fig. 4B).
IL1β a su vez se une IL1R en las células tumorales y estimula la señalización de Wnt. Hemos demostrado que el factor de macrófagos derivados de estabilizar Snail en las células tumorales, que fomenta aún más la señalización de Wnt y se requiere para la capacidad de las células tumorales para activar los macrófagos para producir IL1β.
Estos datos confirmaron que las células con activo la señalización de Wnt mostrar una respuesta alterada a factores derivados de macrófagos, que puedan afectar a su susceptibilidad a los agentes terapéuticos.
la falta de estabilización de Snail en células HCT116 con MT inactivada alelo β-catenina
señalización Wnt ha sido
demostrado para promover la transcripción, la estabilidad y la localización nuclear de caracol [15], [16]. De hecho, hemos demostrado que la inactivación de GSK3 por LiCl o por un inhibidor de GSK3 específica, AR-A014418, era suficiente para aumentar los niveles de Snail en células HCT116 [13]. Hemos demostrado que la sobreexpresión de Snail promueve la transcripción TCF4-β-catenina-conducido, y que el silenciamiento de Snail interfiere con la señalización Wnt en las células HCT116 [13], en consonancia con la capacidad de Snail asociar con β-catenina y para co-regular la la expresión de los genes diana de Wnt [17], [21].
los macrófagos y IL1β inactivan GSK3 en tanto HCT116 y células hke-3 (Fig. 5A) y, consecuentemente, estabilizar Caracol independientemente de las mutaciones del gen KRAS en presencia las células tumorales [13]. La activación de GSK3 por un inhibidor de PI3K específica, YL294002, impide la estabilización y macrófagos inducida IL1β- de Snail en células HCT116, lo que confirma que los factores derivados de macrófagos estabilizan Snail a través de su capacidad para inactivar GSK3 (Fig. 5B).
Hemos demostrado anteriormente que los factores derivados de macrófagos no lograron estabilizar Snail en las células HCT116 que expresan dnTCF4, consistente con la noción de que se requiere la señalización de Wnt activo para la estabilización de Snail [13]. Aquí se comparó la capacidad de los factores derivados de macrófagos para estabilizar Snail en células HCT116 que tenían una supresión de cualquiera de los WT o el MT alelo β-catenina. Al igual que en las células HCT116 los padres, los macrófagos, IL1β y TNF estabilizados Caracol en HCT116
células MT (Fig. 5C). Por el contrario, los factores derivados de macrófago no lograron estabilizar Snail en HCT116
células WT (Fig. 5C), consistente con la incapacidad de los macrófagos para mejorar Wnt de señalización en estas células (Fig. 1). Silenciamos Snail en células HCT116 y confirmamos que, en consonancia con nuestros datos publicados [13], los macrófagos y IL1β logrado estimular la señalización Wnt en ausencia de caracol (Fig. 5D).
Las células tumorales activan los macrófagos a través de una factor de Wnt-dependiente
hemos demostrado que los factores (s) derivado de tumor estimular los macrófagos para secretar una variedad de factores solubles, incluyendo IL1β, una citoquina que se estableció que se requería para la diafonía entre las células tumorales y los macrófagos [10 ]. Hemos demostrado que las células HCT116 que expresan dnTCF4 fallaron en estimular monocitos de sangre periférica para secretar IL1β (Fig. 6A), lo que confirma que se requiere la señalización de Wnt para la expresión del factor derivado del tumor que estimula los macrófagos.
Del mismo modo, el silenciamiento de Snail, un gen diana de Wnt, en HCT116 o células hke-3 dio como resultado la incapacidad de estas células para desencadenar IL1β producción en monocitos THP1 transformadas (Fig. 6B). En conjunto, estos datos confirman que las células de cáncer de colon activan los macrófagos a través de un factor regulado Snail Wnt /, que se requiere para la producción de IL1β.
Discusión
Aunque los macrófagos estimulados apropiadamente tienen la capacidad inherente para matar las células tumorales, se ha hecho evidente que los macrófagos reclutados en el microambiente tumoral y en forma de por factores derivados del tumor pierden la capacidad de destruir las células tumorales. Por otra parte, se ha establecido que los macrófagos asociados a tumores (TAM) proporcionan factores solubles que promueven el crecimiento, la supervivencia y la diseminación metastásica de las células de cáncer de colon [22] - [24]. Varios factores derivados de macrófagos han sido identificados que regulan el crecimiento de las células tumorales. Demostramos que IL1β macrófagos derivados promueve la señalización Wnt en células de cáncer de colon y por lo tanto regula su crecimiento y la supervivencia [10], [13]. A su vez, las células cancerosas secretan factores que atraen y activan las células mieloides, y por lo tanto se propagan a un bucle de auto-amplificación que sustenta el crecimiento del tumor. Sin embargo, se sabe mucho menos acerca de la naturaleza de los factores derivados del tumor que bloquean la capacidad citotóxica de los macrófagos y estimulan sus propiedades promotores de tumores. CCL2 Tumor derivado promueve el reclutamiento de monocitos inflamatorios y [25], y versican derivado de tumor se ha demostrado que activa las células mieloides a través de TLR2 dependiente de señalización [26].
Hemos demostrado que la activación de macrófagos inducida de señalización Wnt en las células de cáncer de colon promueve su crecimiento y supervivencia, consistente con un papel destacado de la señalización de Wnt en cáncer de colon, y las mutaciones recurrentes de APC o β-catenina en la mayoría de los cánceres de colon esporádicos [27]. En este estudio hemos demostrado que la activación de la señalización de Wnt en células de cáncer de colon no sólo inicia una gran cantidad de alteraciones de células intrínseca en las células epiteliales, sino también impactos cómo las células epiteliales se comunican con los macrófagos. La inactivación del alelo MT β-catenina en las células HCT116 altera significativamente su interacción con los macrófagos. Hemos demostrado que los macrófagos no ha promovido la señalización de Wnt y para proteger
WT células HCT116 de la apoptosis inducida por TRAIL. Esto es consistente con nuestro informe anterior que la expresión de dnTCF4 en las células tumorales impidió la señalización entre macrófagos y células tumorales [11], [13] y confirma que la adquisición de mutaciones oncogénicas altera la interacción de las células epiteliales con el estroma adyacente.
Como IL1β, FGF19 se ha demostrado que modulan la señalización Wnt en las células HCT116 [28]. Sin embargo, en contraste con nuestro hallazgo, FGF19 aumento de la actividad β-catenina /TCF transcripción sólo en las células HCT116 los padres y en las células HCT116 que retuvieron el WT β-catenina alelo [28]. En conjunto, estos datos ponen de relieve la importancia de las mutaciones β-catenina para la respuesta de las células tumorales a autocrinos y paracrinos señales y por lo tanto para su interacción con las células en el microambiente tumoral. Nuestros datos confirmaron que la activación de vías oncogénicas, tales como Wnt, no sólo provoca cambios de células intrínseca, sino que también induce alteraciones del estroma que son necesarios para la progresión del tumor. En contraste con ß-catenina mutaciones, la activación oncogénica de Kras en las células epiteliales intestinales no impactó la diafonía entre las células epiteliales y estroma.
Hemos demostrado que los factores derivados de macrófagos estabilizan Snail en células de cáncer de colon [13], el que se regula la transición epitelio mesenquimales y por lo tanto promueve la troncalidad de las células cancerosas y su capacidad para la siembra metastásica [29], [30]. Snail es un gen diana de Wnt [15], [16], que, a su vez, interactúa con β-catenina, y por lo tanto co-regula la expresión de Wnt genes diana [17]. En contraste con las células HCT116 los padres, los factores derivados de macrófago no lograron estabilizar Snail en células HCT116 con suprimido alelo MT β-catenina (Fig. 5C). Hemos demostrado que la capacidad de los macrófagos y IL1β para inhibir la apoptosis inducida por TRAIL y para promover el crecimiento clonogénico de las células tumorales también se inhibió en las células tumorales con expresión de Snail silenciado [13], lo que demuestra que Snail regula varios pasos en la progresión del cáncer de colon y señalando un papel crucial de Snail en la diafonía entre las células tumorales y los macrófagos. Aquí nos muestran que activa la señalización Wnt en las células de cáncer de colon, y la estabilización de Wnt-dependiente de Snail en concreto, son necesarios para las células tumorales para estimular los macrófagos para producir IL1β (Fig. 6). Del mismo modo, los hallazgos recientes demostraron que Snail regula al alza la expresión de mediadores proinflamatorios en los queratinocitos orales, incluyendo IL6, IL8, CXCL1 y IL1β [31]. Esto es consistente con nuestro hallazgo de que los factores derivados de macrófagos protegen las células de cáncer de colon de la apoptosis inducida por TRAIL mediante la estabilización de Snail [13]. Por lo tanto, la falta de estabilización del caracol en las células HCT116 con MT inactivada alelo β-catenina subyace a la incapacidad de los macrófagos para proteger estas células de la apoptosis inducida por TRAIL. Estos datos confirman que la activación de la señalización de Wnt y posterior estabilización de Snail en células de cáncer de colon que afecta considerablemente a su interacción con los macrófagos, y sugiere un papel fundamental de Snail en la diafonía entre las células de cáncer de colon y macrófagos.
En conjunto, nuestra datos sugieren fuertemente que las células tumorales estimulan los macrófagos a través de un factor de Wnt-dependiente. Esto es consistente con nuestro hallazgo de que las células HCT116 que expresan dnTCF4 fallaron en estimular IL1β en los macrófagos (Fig. 6) y por lo tanto exhibir diafonía perturbado con macrófagos [13]. De hecho, hemos demostrado que las células HCT116 que expresan dnTCF4 han aumentado respuesta a TRAIL, y que los macrófagos no proteger a estas células de la apoptosis inducida por TRAIL [13]. Se están realizando experimentos para identificar los factores derivados del tumor que estimulan los macrófagos, y para determinar si se requiere la expresión de receptores toll-like (TLR) en los macrófagos para la diafonía entre las células de cáncer de colon y macrófagos (Figura 7).
tumores de colon humano se vea niveles heterogéneos de actividad Wnt [32] y se ha demostrado que sólo las células con altos niveles de células madre de cáncer de colon pantalla de señalización Wnt (CSC) propiedades [33], [34]. De hecho, el silenciamiento de β-catenina en las células HCT116 se ha demostrado que disminuye el número de colonospheres, que están altamente enriquecidas en células madre cancerosas [35]. Consistente con esto, HCT116
células WT no lograron formar esferoides cuando se siembran en condiciones de poca suero [9]. Hemos demostrado que los macrófagos y IL1β mejorado la señalización de Wnt y estabilizado Snail en células tumorales [13], que se ha demostrado para dotar a las células con propiedades de células madre [18], lo que sugiere que los factores de macrófagos derivados contribuyen a la heterogeneidad de los tumores de colon mediante la expansión la fracción de células tumorales que tienen propiedades de células madre de cáncer. Del mismo modo, los factores de miofibroblastos derivados se han demostrado para imponer el fenotipo CSC mediante la promoción de la señalización Wnt en las células tumorales [34] y periostina, un componente de la matriz extracelular, promueve la stemness de células de cáncer y aumenta su capacidad de formar metástasis upregulating Wnt señalización [36].
Debido a que una señalización de Wnt activo es una firma de las células madre de cáncer de colon, es posible que las células madre de cáncer tienen una capacidad exclusiva para interactuar con las células en el microambiente tumoral. En consonancia con esto, el cáncer asociado fibroblastos promover la invasividad de CD133
+ células madre del cáncer de colon de manera más eficiente que el de CD133
- células [37]. Esto es probable que contribuya a la capacidad única de las células madre del cáncer de propagar el crecimiento del tumor y para conferir resistencia a los enfoques terapéuticos.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y de co-cultivo experimentos
el HCT116 y hke-3 líneas celulares de carcinoma colorrectal, que difieren solamente por la presencia del mutante k-Ras alelo [19], se cultivaron en MEM, suplementado con 10% FCS. HCT116 con WT interrumpido o MT alelo β-catenina fueron proporcionados por Kenneth Kinzler [8]. La línea celular de monocitos humanos, THP1, se cultivó en RPMI. monocitos humanos normales, & gt; 90% CD14 y CD11c positivo y receptor de células T contra menos de 1% positivo, se adquirieron de
Astarte Biológicos
(Redmond, WA). Las células tumorales y los monocitos /macrófagos fueron co-cultivadas separados por transwell insertos de una membrana de policarbonato con tamaño de poro 0,4 m, que impiden el contacto directo célula-célula, pero permiten el intercambio de factores solubles (Corning Incorporated, Lowell, MA).
para los ensayos clonogénicos, HCT116 y células hke-3 se sembraron a una densidad de 200 células por pocillo de una placa de seis solo o junto con monocitos de sangre periférica durante 7 días como se describe anteriormente [10], [11]. Las colonias se fijaron y tiñeron con 6% de glutaraldehído y 0,5% de cristal violeta y se contaron usando total software Lab 1.1 (Dinámica no lineal, Durham, NC, EE.UU.).
Apoptosis ensayo
Las células fueron tratadas con TRAIL recombinante (50 ng /ml, la concentración óptima para la inducción de la apoptosis en las células HCT116) solo o en presencia de macrófagos, IL1β (5 ng /ml) o TNF (10 ng /ml) durante 7 horas. Las células se resuspendieron en tampón hipotónico (0,1% Triton X-100, 0,1% de citrato de sodio) y se tiñeron con yoduro de propidio (50 g /ml) durante 4 horas a 4 ° C como se describe [38]. Las muestras se analizaron por citometría de flujo y la distribución del ciclo celular y la extensión de la apoptosis (células con un contenido de ADN subG1) se analizaron por el
Modfit
software. Las células fueron tratadas con RUTA, durante unos 7 horas y se recogieron para la evaluación basada en criterios morfológicos. Se confirmó la naturaleza apoptótica de las células por análisis bioquímico de lisados celulares. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student para datos independientes, con valores & lt; 0,05 considerado estadísticamente significativo
células
Transfección transitoria y ensayo de gen reportero
HCT116 y hke-3 fueron transfectadas transitoriamente con las láminas superior. plásmido FLASH (que lleva un promotor específico de TCF) o el plásmido TOP-FOP (un plásmido de control que lleva un promotor mutado) utilizando el método de fosfato de calcio. La eficacia de transfección se normalizó por la co-transfección con la actividad de la luciferasa de Renilla PTK-y se determinó de acuerdo con el protocolo del proveedor (ensayo indicador de luciferasa dual, Promega, Madison, WI).
inmunofluorescencia
Para el detección subcelular de β-catenina por inmunofluorescencia, las células fueron fijadas en paraformaldehído al 4% durante 30 minutos. Las células se incubaron con anticuerpo anti-β-catenina (BD Biosciences, San Jose, CA, 1:100) durante 1 hora a 37 ° C y con anticuerpo anti-conejo secundario conjugado con FITC durante 45 min a 37 ° C. Las imágenes fueron adquiridas con una cámara SPOT CCD y se analizaron por software SPOT.
Western Blot
transferencias de Western se realizaron utilizando procedimientos estándar. Las membranas se bloquearon con 5% de leche en TBS que contiene 0,1% de Tween 20 y se incubaron con anticuerpos específicos para la caspasa 8 (Abcam), caspasa 9, PARP y Snail (Cell Signaling Technology), pGSK3 (Millipore, Billerica, MA), beta total de catenina (BD Biosciences, San Jose, CA), y β-actina (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Las bandas inmunorreactivas se visualizaron mediante quimioluminiscencia (Amersham ECL
TM western blotting kit de detección, Piscataway, NJ).