Extracto
El Embelin producto natural se ha demostrado poseer una amplia gama de propiedades terapéuticas, sin embargo, los mecanismos por los cuales ejerce efectos contra el cáncer aún no están claras. Mediante la supervisión de los cambios moleculares asociados durante la fase temprana de apoptosis, se ha identificado el papel crucial de la tensión inducida por la señalización de la MAP quinasa oxidativo como un mecanismo predominante por sus efectos contra el cáncer. El tratamiento de las células A549 de cáncer de pulmón con Embelin resultó en la mejora de la fosfo-p38 y los niveles de fosfo-JNK tan pronto como 4 horas. El pretratamiento de las células con inhibidores específicos de p38 (PD169316) y JNK (SP600125) abrogadas Embelin inducida por la activación de caspasa-3. Los estudios que emplean Embelin en presencia o ausencia de inhibidores específicos de MAP quinasa indicaron que los cambios observados en los niveles de fosforilación de p38, JNK y ERK 1/2 son únicamente debido a Embelin y no debido a la diafonía entre las MAP quinasas. Especies reactivas de oxígeno (ROS) desempeñan un papel crucial en las alteraciones inducidas Embelin en la fosforilación de MAP quinasa y la apoptosis como pretratamiento de las células con FeTMPyP mitigado este efecto. Los cambios observados no se deben al efecto inhibidor de Embelin en XIAP como las células tratadas con el péptido SMAC-N7-Ant, un inhibidor específico de dominio BIR3 de XIAP no lo hizo Embelin imitador inducida efectos apoptóticos. Los resultados del presente estudio indican claramente el papel crucial de p38 y JNK vías de la apoptosis inducida por Embelin y nos proporcionan nuevas pistas para la mejora de su eficacia terapéutica
Visto:. Avisetti DR, Babu KS, Kalivendi SV (2014 ) La activación de p38 /JNK Camino es responsable de Embelin apoptosis inducida en células de cáncer de pulmón: papel de transición de especies reactivas del oxígeno. PLoS ONE 9 (1): e87050. doi: 10.1371 /journal.pone.0087050
Editor: Shrikant Anant, Universidad de Kansas Facultad de Medicina de los Estados Unidos de América
Recibido: 24 Septiembre, 2013; Aceptado: 17 de diciembre de 2013; Publicado: 22 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Avisetti et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo contó con el apoyo del proyecto sonrisa de CSIR, India. Superiores de becas de investigación a partir de DRA UGC, India, se agradece. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Embelin, un componente activo de frutos de
Embelia Ribes, España se ha demostrado que poseen un amplio espectro de propiedades terapéuticas, tales como el cáncer, anti-inflamación, anti-diabetes, anti-obesidad, analgésico, anti-fertilidad y antihelmíntico [1] - [5]. El descubrimiento inicial de Embelin como un inhibidor de XIAP en virtud de su interacción con el dominio BIR3 y su selectividad observada hacia las células de cáncer en comparación con las células normales nos inspiró para considerarlo como un compuesto de plomo para estudios adicionales contra el cáncer [6]. Como muchos de los cánceres expresan niveles elevados de XIAP y se vuelven refractarios a la apoptosis, el tratamiento con Embelin o en combinación con otros medicamentos contra el cáncer conocido fue encontrado para sensibilizarlos sobre la apoptosis [6], [7]. estudios basados Mecanismo indican que Embelin inactiva NF-kB mediante la inhibición del transporte nuclear de p65 y también se muestra para inhibir la fosforilación de STAT3 mediante la inducción de la expresión de PTEN [8], [9].
esfuerzos específicos para identificar la precisión molecular blanco de Embelin como resultado la identificación de Embelin como inhibidor contra dominio BIR3 de XIAP [6]. Además, Embelin también demostró ser un inhibidor de la 5-lipoxigenasa y microsomal prostaglandina E2 sintasa-1 (mPGES) -1; inhibidor del activador del plasminógeno-1 (PAI-1) y P300 /CBP factor asociado (PCAF) [10] - [12]. Por otra parte, Embelin se ha demostrado que interfiere con la fosforilación oxidativa de la mitocondria y puede someterse a ambos redox y no redox mediada por mecanismos [13], [14].
Aunque la afinidad de Embelin contra algunas de las dianas moleculares y los mecanismos de señalización celular han sido identificados, la diana intracelular principal responsable de su propiedad anti-cáncer aún no está claro ya que muchos de los estudios anteriores se han llevado a cabo en puntos de tiempo posteriores en la cascada de transducción de señales se hace compleja debido a la diafonía entre múltiples mecanismos de señalización celular [8], [15], [16], [17]. Por lo tanto, en el presente estudio, hemos tratado de identificar las alteraciones en las vías responsables de la propiedad contra el cáncer de Embelin durante la fase temprana de apoptosis de señalización. El presente estudio identificó por primera vez el papel fundamental de la vía de la MAP quinasa, especialmente p38 y JNK, en la apoptosis inducida Embelin.
Materiales y Métodos
Materiales
Embelin era purificada a partir de los frutos de
Embelia Ribes
como se describe anteriormente [18], [19]. medio esencial mínimo (MEM), medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), tampón fosfato salino de Dulbecco (DPBS), penicilina, estreptomicina, sulforodamina B (SRB), Ac-DEVD-7-AFC, Ac-LEHD-7-AFC, PD169316 , SP600125, N-acetil-L-cisteína (NAC), tampón de precipitación radioinmune de ensayo (RIPA) y cóctel inhibidor de la proteasa se adquirieron de Sigma-Aldrich, Alemania. U0126 y FeTMPyP se adquirieron de Calbiochem. SMAC-N7-Ant péptido (AVPIAQK-P-RQIKIWFQNRRMKWKK) fue sintetizado por GenPro Biotech, Noida, India. kit de ensayo de Anexina-V se adquirió de Clontech Inc, EE.UU.. Todos los productos químicos para las preparaciones de amortiguación y productos químicos finos se adquirieron de Sigma-Aldrich, Alemania.
Cultivo de células y las condiciones experimentales
Todas las líneas celulares se obtuvieron de ATCC, EE.UU.. A549, DU145, se cultivaron células MCF-7 y WPMY-1 en las células en MEM (complementado con 10% de FBS, 100 unidades /ml de penicilina y 100 unidades /ml de estreptomicina), mientras que H9c2 y MRC 5 células se cultivaron en DMEM (suplementado con 10 % de FBS, 100 unidades /ml de penicilina y 100 unidades /ml de estreptomicina). Las células se mantuvieron en atmósfera humidificada con 5% de CO2 a 37 ° C. Doce horas antes de los tratamientos, los medios de cultivo de células se reemplazó con respectivos medios de comunicación que contiene 2% de FBS, a menos que se indique lo contrario. En estudios de intervención, las células fueron pretratadas con los inhibidores de la MAP quinasa respectivos o antioxidantes durante 1 h antes de la adición de Embelin (15 M). Para los experimentos que implican péptido SMAC-N7-Ant, las células fueron tratadas con 100 mM del péptido durante un periodo de 8 h.
Ensayo de citotoxicidad
El efecto de Embelin sobre la viabilidad celular se determinó por sulforodamina B ( SRB) ensayo como se describe anteriormente [20]. SRB es un tinte aminoxanthene que se une a los residuos básicos de aminoácidos de las células (fijados a placas de cultivo de tejido por el ácido tricloroacético) en condiciones ácidas suaves [20]. Brevemente, las células (en placas de 24 pocillos, ~ 80% de confluencia) se trataron con diferentes concentraciones de Embelin para 48h en medios suplementados con suero bovino fetal 10%. Después de la terminación de la incubación, las células fueron fijadas mediante la adición de ácido tricloroacético al 30% al medio a 4 ° C durante 1 h. Más tarde, las células se lavaron con agua desionizada y se secó al aire. SRB (0,04%, w /v) se añadió a las células y se incubó adicionalmente durante 30 min a temperatura ambiente. Finalmente, las células se lavaron con ácido acético al 1% (tres veces) y se secó al aire. SRB unido a las células se solubilizó en mM Tris-base 10 y la absorbancia se midió a 565 nm utilizando un lector de placa multimodo Enspire (Perkin Elmer).
caspasa 3 y 9 Ensayo
Después de la terminación de incubación, la caspasa-3 celular y -9- actividades se midieron usando AFC sustratos de tetrapéptidos conjugado como se describe anteriormente [21]. Brevemente, las células se lavaron con DPBS enfriado con hielo y se lisaron en tampón de lisis enfriado en hielo (mM HEPES de pH 7,4, CHAPS 50 mM y DTT 5 mM 5) [22]. Los lisados se sedimentaron hacia abajo a 12.000 g durante 10 min a 4 ° C y se recogieron los sobrenadantes. Para los lisados volúmenes iguales de tampón de ensayo (40 mM HEPES pH 7,4, 0,2% CHAPS, DTT 10 mM, EDTA 4 mM) que contiene o bien la caspasa-3 sustrato (Ac-DEVD-7- AFC, 40 M) o caspasa-9 se añadió sustrato (Ac-LEHD-7-AFC, 40 mM) y se incubó a 37 ° C. Aumento de las lecturas de fluorescencia debido a la liberación de AFC se controló durante cada intervalo de 5 min a? Ex 400 nm y 505 nm λem durante 1 hora usando un lector de placas multimodo Enspire (Perkin Elmer). estimación de proteínas se realizó por el método de Bradford y las unidades de fluorescencia se normalizaron a la proteína total en la mezcla de incubación.
Anexina-V /Análisis FITC para la apoptosis
células A549 cultivadas en cubreobjetos en 6- así placas se trataron con Embelin durante 4 h. Después del tratamiento, los cubreobjetos se lavaron dos veces con PBS seguido de tampón de unión 1X. Las células fueron teñidas con el anticuerpo /FITC anexina-V mediante la incubación en la oscuridad durante 30 min y se lavaron con tampón de unión 1X para eliminar cualquier anticuerpo no unido de acuerdo con el protocolo del fabricante (Clontech Inc, EE.UU.). Se añadió formaldehído (2%) para fijar las células al final de la incubación. La fluorescencia se vigila por medio de un microscopio Olympus IX71inverted-equipado con ajustes de filtro FITC y rodamina. Expresión
genes de perfiles utilizando microarrays
A549 células fueron tratadas con Embelin durante 4 h. Después de los tratamientos, el ARN se aisló utilizando el kit de Qiagen según las instrucciones del fabricante. La concentración y pureza del ARN extraído se calculan utilizando el espectrofotómetro Nanodrop (Thermo Scientific). La integridad del ARN extraído se analizó en el Bioanalyzer (Agilent). El ARN se considera que es de buena calidad sobre la base de los valores de 260/280, rRNA 28S /18S y proporciones numéricas integridad del ARN (RIN). Las muestras se marcaron usando el kit Agilent rápido AMP. 500 ng de ARN total fue transcrito invertir utilizando oligo-dT cebador marcado a la secuencia del promotor T7. así cDNA obtenido se convirtió en ADNc de doble cadena en la misma reacción. Aún más el cDNA se convierte en ARNc en el
in vitro
se añadió etapa de transcripción usando ARN polimerasa de T7 enzima y el tinte Cy3 en la mezcla de reacción. cRNA obtenido se limpió usando columnas RNeasy (Qiagen Inc) y la concentración y la cantidad de tinte incorporado se determinó usando Nanodrop. La actividad específica para todas las muestras de más de 8 pmol de colorante /g cRNA se considera ideal para la hibridación. CRNA marcado (600 ng) se hibrida en la matriz (Whole Genoma Humano personalizada 8 × 60k diseñada por genotípica Tecnología Private Limited AMADID: 027114) utilizando el kit de Expresión Génica Hibridación en las cámaras de hibridación Sure (Agilent) a 65 ° C durante 16 h. hibridizada diapositivas se lavaron usando tampones de lavado de expresión génica. Los hibridadas microarrays diapositivas, lavadas se escanearon en un escáner de microarrays (G2505C, Agilent Technologies). Extracción de datos de imágenes se realizó utilizando el software de extracción de características y las imágenes fueron cuantificados (Versión 10.7 de Agilent). Característica extrajeron los datos en bruto se analizó usando el software GeneSpring GX versión 11.5 de Agilent. La normalización de los datos se realiza en GeneSpring GX utilizando la 75
º percentil turno. Importantes genes regulados hacia arriba y abajo que muestra de dos veces y por encima de dentro de las muestras con respecto al control de la muestra fueron identificados. Estadística
t-test
p-valor se calculó sobre la base de Student
t-test
algoritmo. Los genes se clasifican en función de la categoría funcional y vías usando GeneSpring GX y software de análisis genotípico Biointerpreter-Biológica. Los datos de microarrays se ha presentado a la base de datos GEO con el número de acceso GSE50545.
intracelular de ROS Medición
generación de especies reactivas del oxígeno en las células se determinó mediante carboxi-H2-DCFDA (Molecular Probes) como se ha descrito anteriormente [23]. Después de la terminación de los tratamientos, se aspiró el medio y las células en placas de 12 pocillos se lavaron dos veces con DPBS. Se añadió medio libre de suero que contiene 10 mM carboxi-H2-DCFDA a las células y se incubaron adicionalmente a 37 ° C durante 20 min. Finalmente, las células se lavaron dos veces con DPBS antes de añadir medio de cultivo. fluorescencia intracelular se monitorizó usando un microscopio Olympus IX71inverted-equipado con ajuste de filtro FITC.
análisis de transferencia Western
tratamientos siguiente, las células se lavaron con DPBS, suavemente raspó y se recoge por breve centrifugación (300 g por 3 min) y se resuspendieron en 100 l RIPA que contiene cóctel inhibidor de la proteasa y de sodio orto-vanadato, 10 mM (Sigma). La suspensión de células resultante se pasó a través de una aguja de calibre 26 10 veces para asegurar la lisis completa. El lisado se centrifugó a 12.000 g durante 15 min a 4 ° C y los sobrenadantes claros se recogieron en tubos separados. Dado que todos los anticuerpos empleados son anticuerpos monoclonales, en lugar de extracción y reprobing las inmunotransferencias de proteínas totales y fosfo-específicos, hemos realizado inmunotransferencia por separado con el fin de evitar cualquier señales de fondo. Después de la estimación de la proteína por el método de Bradford, proteínas (25 mg) se resolvieron en 10% SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las transferencias se sondearon con anticuerpos monoclonales dirigidos contra anticuerpos específicos totales y fosfato de ERK 1/2, p38, JNK (Cell Signaling Technology); y la tubulina (Sigma-Aldrich). Anti-conejo Ig-G conjugado con HRP (GE Life Sciences) y anti-IgG de ratón conjugado con fosfatasa alcalina (Sigma-Aldrich) se emplearon como los anticuerpos secundarios para la MAP quinasa y los anticuerpos de tubulina respectivamente. Las bandas se desarrollaron usando ECL Prime Western Blot reactivo (GE, Ciencias de la Vida) o reactivo BCIP /NBT para tubulina (Sigma-Aldrich) y las intensidades de las bandas se calcularon utilizando el software GeneTools (Syngene sistema de documentación de gel).
Estadística análisis
Todos los experimentos se realizaron por triplicado y los resultados se expresaron como media ± SD La significación estadística se determinó por el estudiante de
t
prueba utilizando el software SIGMAPLOT.
Resultados
Embelin Exposiciones aumento de la citotoxicidad en células de cáncer en comparación con células normales
La actividades anti-proliferativos de Embelin se compararon por el ensayo de SRB en el cáncer seleccionado y líneas de células normales (Fig. 1). Las células se sometieron a concentraciones crecientes de Embelin (2,5, 5, 10 y 25 mM) durante 48 h. Entre las células cancerosas, se encontró Embelin a ser más tóxico para las células A549 con una CI
50 valor de 4,4 M seguido de DU145 y MCF7 con 6,31 y 10,66 mM respectivamente. Sin embargo, el IC observado
50 valores eran comparativamente menor que las líneas de células normales a saber., MRC5, WPMY-1 y H9c2 que demostraron una CI
50 valor de 24,4, 10,9 y 23,4 mM, respectivamente. La diferencia entre el IC observado
50 valores de cáncer de pulmón y las células normales (4,44 ± 0,76 y 24,44 ± 5,32 M) pareció ser más significativa. Como las células A549 exhiben una mayor sensibilidad hacia Embelin, todos los estudios adicionales se han llevado a cabo usando esta línea celular para la comprensión del modo de acción de Embelin para obtener nuevos conocimientos para atacar selectivamente las células de cáncer de pulmón en comparación con su homólogo celular normal. Por lo tanto, con el fin de identificar la fase temprana de apoptosis, se ha analizado el efecto dependiente del tiempo de Embelin sobre la actividad de la caspasa-3 celular en células A549 (Fig. 2A). Embelin (15 M) indujo aumento de casi 2 veces en la actividad de la caspasa-3 tan pronto como período de tiempo 4h que aumentó aún más hasta 6 veces por 8h (Fig. 2A). Anexina-V /FITC tinción de las células tratadas con Embelin (4h) indica claramente la etapa de apoptosis temprana de las células, ya que solamente se tiñeron con anexina-V, pero no con yoduro de propidio (Fig. 2B). Sin embargo, en puntos de tiempo posteriores, es decir, 18 y 24 horas, la caspasa-3 actividades disminuyeron casi a 4 y 2 veces, respectivamente, lo que indica que las células apoptóticas pueden haber completamente muerto a finales de 18 o 24 horas, o también podría ser una posibilidad de múltiples mecanismos de muerte celular debido a la diafonía entre diferentes mecanismos de señalización.
(a) Estructura de Embelin células (B) fueron tratados con Embelin durante 48 horas y después de la terminación de la incubación, la viabilidad celular se midió por sulforodamina B ensayo e IC
50 valores se calculan como se menciona en la sección "Materiales y Métodos". Los datos mostrados son la media ± SD de tres experimentos separados. * Indica p & lt; 0.01as compararon con controles
células A549
(A) fueron tratados con 15 Embelin M durante diferentes intervalos de tiempo.. Después de la terminación de los tratamientos, se midió la actividad de caspasa-3, como se indica en la sección "Materiales y Métodos". (B) las células A549 se trataron con 15 Embelin mu M durante 4 h y se tiñeron con FITC y yoduro de propidio Anexina-V /como se describe en la sección "Materiales y Métodos". Las imágenes de fluorescencia fueron capturados utilizando un microscopio de fluorescencia invertido Olympus IX71-equipado con ajustes de filtro FITC y rodamina. se muestran imágenes representativas de tres campos de vista diferentes. (C) Las células fueron tratadas con un inhibidor de XIAP, péptido SMAC-N7-Ant (100 mM) durante 8 h. Posteriormente, la caspasa-3 y -9- actividades se midieron utilizando los sustratos tetra-péptido como se describe en la sección "Materiales y Métodos". Para ambos (A) y los datos (C) presentados están la media ± SD de tres experimentos separados. ** Indica p & lt; 0,01 y * indica p & lt; 0,05 en comparación con los controles
Como se conoce Embelin para inhibir XIAP mediante la unión al dominio BIR3 similar a la de SMAC, el próximo examinó si la. observado efectos de Embelin sobre la apoptosis celular se pudo demostrar por una célula péptido SMAC-N7-Ant permeable (compuesto por amino terminal del péptido de 7 aminoácidos de SMAC madura - AVPIAQK unido a Ant péptido -RQIKIWFQNRRMKWKK, por la permeabilidad celular por un enlazador prolina), que es sabe que interactúan específicamente con BIR3 dominio de XIAP [24], [25]. Los resultados demuestran que el tratamiento de células A549 con SMAC-N7-Ant péptido (100 mM durante 8 h) aumentó celular actividad de la caspasa-9 a cerca de dos veces con respecto al control sin tratar, sin embargo, no se observó ningún aumento significativo en la actividad de caspasa-3 ( Fig. 2C). A pesar de los efectos observados de péptido SMAC-N7-Ant están en conformidad con el informe anterior [24], la falta de activación de la caspasa-3 con el péptido-Ant SMAC-N7, pero no con Embelin, nos llevó a investigar las vías responsables mediar Embelin inducido apoptosis para obtener nuevos conocimientos sobre su mecanismo de acción.
la alteración en la expresión génica perfil por Embelin
con el fin de identificar las vías responsables de la apoptosis inducida Embelin, hemos analizado el perfil de expresión de genes alterados en las células A549 tratadas con Embelin (15 micras para 4H). Un total de 215 upregulated y 80 genes regulados negativamente fueron identificados que mostraron diferencia, al menos, dos veces más que los controles con una significación de p. & Lt; 0,05
La clasificación de estos genes sobre la base de la categoría funcional y vías usando GeneSpring GX y genotípica software de análisis de Biointerpreter-Biológica indicó que los genes upregulated mayormente pertenecen a cinco vías diferentes (con al menos 4 genes alterados en cada vía) y el número de genes alterados están en el orden de Wnt (4 genes) & lt; adhesión focal (5 genes ) & lt; p53 (8 genes) & lt; interacción de citoquinas-citoquina receptor (11 genes) & lt; ruta de MAP quinasa (16 genes) (Fig 3 A-C).. Entre los genes regulados negativamente con al menos tres genes en cada vía que posee un cambio de 2 veces con una significancia de p & lt;. 0.05 pertenecían a receptor de citoquina-citoquina y vía de la MAP quinasa (Fig. 3A y B)
A549 las células fueron tratadas con Embelin (15 mM) durante 4 h. Se realizó el análisis de microarrays como se describe en el apartado "Materiales y Métodos". Los genes que mostraron regulación diferencial de al menos 2 veces con p & lt; 0,05 se clasifican en función de la categoría funcional y vías usando GeneSpring GX y software de análisis genotípico Biointerpreter-Biológica. Rutas que predominantemente mostraron expresión diferencial fueron vía (A) MAP quinasa, (B) la interacción del receptor de citoquina-citoquina y p53 (C) y la vía. Los datos se han presentado a la base de datos GEO con el número de acceso GSE50545.
A primera vista, los resultados obtenidos indican que entre las vías alteradas, vía de señalización MAP quinasa parece ser más predominante y ha afectado de forma significativa con casi 16 genes alterados y muchos de los genes son o bien aguas arriba o aguas abajo de p38 /JNK /ERK vía tales como p53 o reguladores de estos vía (Fig. 3A). Desde el punto de vista funcional, el estado de fosforilación de las proteínas identificadas (tales como, DUSPs, GADD45A /B, p53, etc) pero no simplemente sus niveles de transcripción dictan el destino celular. Sin embargo, los resultados obtenidos indican el papel sustancial de señalización MAP quinasa y nos inspiraron a centrarse en la participación de la vía de la MAP quinasa en la apoptosis inducida Embelin.
Embelin inducida por la activación de p38 y JNK Camino
sobre la base de las pistas iniciales obtenidos a partir de estudios de microarrays en el papel potencial de la vía de la MAP quinasa en Embelin inducida por la apoptosis, hemos tratado de investigar más a fondo sobre la implicación de la señalización de MAPK y monitoreados alteraciones Embelin inducida en el estado de fosforilación de ERK, las proteínas p38 y JNK ( Fig. 4). Resultados como se muestra en la figura-3 indican que Embelin (15 M) indujo la fosforilación de p38 a cerca de 2,5 y 3 veces por 4 y 8h respectivamente. Fosfo-JNK 1/2 niveles también se aumentaron a 1,2 y 1,9 veces, respectivamente, por 8h. Sin embargo, bajo condiciones de tratamiento similares hubo una disminución significativa en el estado de fosforilación de ERK 1/2 (p42 y p44) y no se encontraron los valores a ser 0,3 y 0,2 veces menor que la de los controles (Fig. 4A y B). Con el fin de comprender si los cambios en el estado de fosforilación de estas proteínas MAP quinasa tiene alguna relevancia para la apoptosis observada, hemos tratado previamente las células durante 1 h individualmente con inhibidores específicos para p38 (PD169316), JNK (SP600125) y MEK (U0126) en 5 concentración mu M seguido de Embelin (15 mM) durante 4 h. inducida por Embelin actividad de la caspasa-3 fue significativamente inhibido por tanto p38 y inhibidores de JNK a los valores de control casi (Fig. 4C). Sin embargo, bajo condiciones experimentales similares inhibidor de MEK (U0126) no mostró ningún efecto protector contra la apoptosis inducida por Embelin y también hay un aumento significativo en la actividad de la caspasa-3 se observó en las células tratadas con inhibidores de solo (Fig. 4C). Los cambios observados indican claramente que las alteraciones en el estado de fosforilación de p38 y JNK tanto parece ser crucial en la apoptosis inducida Embelin.
Células A549
(A) fueron tratados con Embelin 15 M durante 4 y 8 horas. Total, así como ERK fosforilada media, p38, JNK media y tubulina (control de carga) se midieron los niveles por Western blot como se describe en los "Materiales y Métodos" sección. (B) valores normalizados de las intensidades de las bandas obtenidas por análisis densitométrico de los datos a partir de (A). (C) Actividad de la caspasa-3 en células pre-tratados con o sin U0126 (5 M), PD169316 (5 M), SP600125 (5 M) durante 1 h seguido de Embelin (15 mM) durante 4 h. Los valores de control se normalizan a 1 y los datos indicados son la media ± desviación estándar de tres experimentos separados. * Indica p & lt; 0,05 en comparación con el control y#indica p. & Lt; 0,05 en comparación con las células tratadas Embelin
Con el fin de determinar si las alteraciones observadas en la fosforilación de MAPK son debido a un tratamiento Embelin solo o debido al efecto reglamentario de una MAP quinasa sobre la otra MAPK de, hemos tratado a las células de forma individual con Embelin (15 M) en presencia y ausencia de inhibidor de MEK (U0126, 5 mM) o un inhibidor de p38 (PD169316, 5 M) o inhibidor de JNK (SP600125, 5 M) durante 4 horas y se analizaron los niveles de fosforilación de todos los tres MAP quinasas (Fig. 5). El inhibidor de MEK U0126 inhibe su ERK blanco de abajo. inhibidor de p38, PD169316 y el inhibidor de JNK, SP600125 inhibe específicamente la actividad de JNK y p38, respectivamente, por unión competitiva a los bolsillos de unión de ATP que impiden la fosforilación de proteínas aguas abajo, pero, como tal, no da lugar a los niveles de fosforilación disminuidos de cualquiera de p38 o JNK [26 ], [27]. Los resultados indican que el tratamiento de las células con el inhibidor de MEK (U0126) inhibió la fosfo-ERK 1/2, pero no alteraron los niveles de Embelin inducida fosfo-p38 y los niveles de fosfato JNK. Del mismo modo, el tratamiento de células con el inhibidor de p38 (PD169316) no afectó a los niveles de fosfo-JNK y fosfo-ERK causadas por Embelin. Además, el tratamiento de las células con el inhibidor de JNK (SP600125) no afectó a los niveles de fosfo-p38 y fosfo-ERK en la presencia o ausencia de Embelin (Fig. 5). Los resultados anteriores indican que los cambios observados en los niveles de fosforilación de p38, JNK y ERK parece estar mediada directamente por tratamiento Embelin, pero no debido a la diafonía entre las MAP quinasas.
A549 células fueron pre tratadas con o sin U0126 (5 M), PD169316 (5 M), SP600125 (5 M) durante 1 h seguido de Embelin (15 mM) durante 4 h. Los niveles totales de ERK fosforilada y 1/2, p38, JNK media y tubulina (control de carga) fueron detectados por Western Blot como se describe en los "Materiales y Métodos" sección.
ROS media la MAP Reglamento quinasa por Embelin
proteínas MAPK se sabe que están regulados por el estrés oxidativo [28]. Además, la estructura de benzoquinona Embelin se ha demostrado para formar radical semiquinona por el mecanismo redox que finalmente conduce a la generación de especies reactivas de oxígeno [13], [29]. Estas observaciones sugieren un papel importante para ROS en Embelin inducida por apoptosis. Para evaluar las propiedades pro-oxidantes de Embelin, hemos estudiado sus efectos sobre la generación de estrés oxidativo en las células A549. Los ROS intracelulares generadas por Embelin se detectó por una mejora en la fluorescencia intracelular de DCF (Fig. 6). Embelin (15 M) indujo la generación de ROS en una manera dependiente del tiempo con casi 5 y 10 veces más de incremento controles no tratados a finales de 2 y 4 horas, respectivamente (Fig. 6). El pretratamiento de las células con el antioxidante, FeTMPyP (10 M) o N-acetil-L-cisteína (NAC) (10 mM) inhibió significativamente Embelin inducida DCF tinción a la de los valores de control (Fig. 6).
células A549 (a) se trataron previamente con o sin FeTMPyP (10 M) o NAC (10 mM) durante 1 h seguido de Embelin (15 mM) durante 4 h y la generación de ROS se detectó por tinción con DCF como se describe en "Materiales y Métodos" sección. fluorescencia celular fue capturado utilizando un microscopio de fluorescencia invertido Olympus IX71-equipado con ajustes de filtro FITC. (B) La media de intensidad de fluorescencia a partir de tres campos de vista diferentes se obtuvieron utilizando el software ImageJ. * Indica p & lt; 0,05 en comparación con el control y#indica p & lt;. 0.05 en comparación con las células tratadas Embelin
Se evaluó adicionalmente el efecto de Embelin inducida por ROS en la señalización de MAPK en presencia y ausencia de el antioxidante, FeTMPyP (Fig. 7). Los resultados indican que Embelin inducida por ROS es responsable de las alteraciones observadas en los niveles de fosfo-proteína de p38, JNK y ERK 1/2 como pretratamiento de las células con FeTMPyP anulados este efecto (Fig. 7A). De acuerdo con los resultados anteriores, el tratamiento previo de las células con FeTMPyP (10 M) también inhibió los efectos apoptóticos de Embelin que indica que las alteraciones en la MAP quinasa de señalización debido a una mayor ROS juega un papel fundamental en la apoptosis Embelin inducida (Fig. 7B).
células A549 se trataron previamente con o sin el antioxidante FeTMPyP (10 M) durante 1 h seguido de Embelin (15 mM) de tratamiento durante 4 h. (A) los niveles celulares de ERK fosforilada total y 1/2, p38, JNK media y tubulina fueron detectados por Western blot seguido de detección por quimioluminiscencia como se describe en la sección "Materiales y Métodos". (B) En condiciones experimentales similares a los de (A), se midió la actividad celular de la caspasa-3 como se describe en la sección "Materiales y Métodos". Los datos presentados son la media ± desviación estándar de tres experimentos separados. * Indica p & lt; 0,01 en comparación con el control y#indica p & lt; 0,05 en comparación con las células tratadas Embelin
Discusión
En el presente estudio, mostramos que el estrés oxidativo inducido MAPK. señalización juega un papel importante en la apoptosis inducida por Embelin. El análisis de perfiles de expresión génica mediante microarrays estudios indicaron la posible implicación de la vía MAP cinasa en las células A549 tratadas con Embelin durante 4 h. El pretratamiento de las células con inhibidores específicos de o bien p38 o JNK Embelin inhibió significativamente inducida por la activación de caspasa-3, así como anulado alteraciones inducidas Embelin-en los niveles de fosforilación de p38, JNK y ERK 1/2 quinasas MAP. Especies reactivas de oxígeno (ROS) parece jugar un papel fundamental entre Embelin y MAP quinasa vía. Todos los efectos observados de Embelin no se deben a la inhibición de XIAP como tratamiento de las células con células permeable péptido SMAC-N7-Ant, que se une al dominio BIR3 de XIAP no afectó a la activación celular de la caspasa-3.
El producto natural, Embelin, se ha prestado más atención en los últimos tiempos por sus propiedades contra el cáncer. Más importante aún, se ha demostrado tener más selectividad hacia las células de cáncer en comparación con las células normales (6). Incluso en el presente trabajo, se observó una tendencia similar y una diferencia significativa en el CI
50 valores de Embelin fue evidente entre el cáncer de pulmón y líneas de células normales (Fig. 1). Aunque Embelin se identificó inicialmente para ser un inhibidor de XIAP por medio de su interacción en dominio BIR3, estudios posteriores demostraron los
in vitro
efectos directos de Embelin en la fosforilación oxidativa de la mitocondria, la inhibición de la 5-lipoxigenasa (5 -LO) y microsomal prostaglandina E2 sintasa-1 (mPGES) -1 y la inactivación de activador de plasminógeno inhibidor-1 (PAI-1) [10], [11]. Sin embargo, la identificación de la diana intracelular primaria que es responsable de la propiedad anticancerígena de Embelin eventualmente podría ayudar en el refinamiento estructural de Embelin para mejorar su eficacia y selectividad.
Recientemente, varios estudios se han llevado a cabo para entender la modo de acción de Embelin y se ha demostrado que tiene un papel en la inactivación de NF-kB, la inhibición de STAT3 señalización a través de la proteína tirosina fosfatasa PTEN, la desestabilización lisosomales y AKT y mTOR [8], [9], [15] , [30], [31]. Sin embargo, si todos los efectos observados son interdependientes o independientes entre sí no está claro ya que muchos de los experimentos descritos se llevaron a cabo a una duración fija de 24 o 48 h [8], [10], [16], [17 ].
los datos de los estudios de microarrays durante las primeras etapas de la apoptosis inducida Embelin nos indicó a los cambios en la regulación de factores de transcripción aguas abajo de las proteínas MAPK (Fig. 3). En el presente estudio, hemos identificado un papel prominente de la vía de la MAP quinasa, (aumento de los niveles de fosfo-p38 y fosfato JNK) en la apoptosis inducida por Embelin.