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PLOS ONE: La alta ingesta de fosfato inorgánico Promueve Tumorigénesis en las primeras etapas en un modelo de ratón de pulmón Cancer


Extracto

fosfato inorgánico (Pi) es requerido por todos los organismos vivos para el desarrollo de órganos como el hueso, músculo , cerebro y los pulmones, la regulación de la expresión de varios genes críticos, así como la transducción de señales. Sin embargo, se sabe poco sobre los efectos del consumo prolongado Pi dietética en la progresión del cáncer de pulmón. Este estudio investigó los efectos de una dieta alta en fosfato (HPD) en un modelo de ratón de adenocarcinoma. K-ras ratones
LA1 fueron alimentados con una dieta normal (0,3% Pi) o un HPD (1% Pi) para 1, 2, o 4 meses. Los ratones se sacrificaron y se sometieron a acoplamiento inductivo ablación de masas de plasma /espectrometría de emisión óptica y el láser de análisis acoplado inductivamente espectrometría de masas de plasma, análisis de transferencia Western, histopatológico, inmunohistoquímico, y inmunocitoquímica análisis para evaluar la formación de tumores y la progresión (incluyendo la proliferación celular, la angiogénesis, y apoptosis), los cambios en los niveles de iones y el metabolismo, la autofagia, la transición epitelio-mesenquimal, y la traducción de proteínas en los pulmones. Un HPD aceleró la tumorigénesis, como se evidencia por el aumento de las tasas de adenoma y adenocarcinoma, así como el tamaño del tumor. Sin embargo, después de 4 meses del HPD, la proliferación celular fue detenido, y el aumento de los niveles hepáticos y de iones de pulmón y en la producción de energía a través de se observó el ciclo del ácido tricarboxílico en el hígado, que fueron acompañados por un aumento de la autofagia y la disminución de la angiogénesis y apoptosis marcado. Estos resultados indican que una HPD promueve inicialmente pero más tarde inhibe la progresión del cáncer de pulmón a causa de la adaptación metabólica que conduce a la quiescencia de las células tumorales. Por otra parte, los resultados sugieren que el consumo de Pi cuidadosamente regulado son eficaces en la prevención del cáncer de pulmón

Visto:. Lee S, Kim J-E, Hong S-H, Lee A-Y, Parque E-J, Seo HW, et al. (2015) La alta ingesta de fosfato inorgánico Promueve Tumorigénesis en las primeras etapas en un modelo de ratón de cáncer de pulmón. PLoS ONE 10 (8): e0135582. doi: 10.1371 /journal.pone.0135582

Editor: Libing Song, Sun Yat-sen Universidad del Centro del Cáncer, CHINA

Recibido: 16 de febrero de 2014; Aceptado: July 24, 2015; Publicado: 18 Agosto 2015

Copyright: © 2015 Lee et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación: Parte de este trabajo con el apoyo de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Ciencia, ICT & amp; Planificación futura (2012M3A9C4048819). M. H. Cho también fue apoyado en parte por el Instituto de Investigación de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional de Seúl. experimentos LA-IPC-MS se llevaron a cabo con el apoyo del Consejo de Investigación Australiano, Agilent Technologies, y Kenelec científica como parte del programa de proyectos de vinculación (LP100200254). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

fosfato inorgánico (Pi) es requerido por todos los organismos vivos para diversas funciones celulares, incluyendo el metabolismo mineral y la producción de energía a partir de los fosfolípidos de membrana y nucleótidos y como sustrato para los intermediarios fosforilados en la señalización celular [1]. Pi puede ser adquirido de forma pasiva a través de la ingesta de alimentos o de forma activa a través del metabolismo celular. A menudo se utiliza como aditivo alimentario no por razones de salud, pero para funciones tales como el mantenimiento de los alimentos de color y sabor, zonas de separación de ácido, levadura, la estabilización de la textura, y la prolongación de la vida útil. Una gama de productos alimenticios contienen Pi, incluyendo anacardos, almendras, tocino, pescado en conserva, leche evaporada, quesos procesados, el polvo de hornear, la levadura del pan, huevos, lentejas, y las bebidas isotónicas y de cola [2]. consumo humano Pi está aumentando debido a la disponibilidad de estos alimentos; Los estudios indican que el uso de Pi en aditivos alimentarios ha aumentado de forma constante, mientras que la ingesta de Pi se ha incrementado en casi un 17% en las últimas décadas [3].

Los últimos informes sugieren que la ingesta anormal Pi está estrechamente correlacionada con la aparición de varios tipos de cáncer [4]. Pi también juega un papel crucial en la regulación de genes durante el ciclo celular, así como en la transducción de señales y el control de la transcripción in vitro [5]. Además, se demostró que una dieta alta en fosfato (HPD) para promover la tumorigénesis de pulmón a través de Akt alteraciones en la señalización [6]. Sin embargo, no ha habido estudios hasta la fecha que evalúan mantenimiento homeostático en los pulmones en relación con un HPD o el papel de Pi en la adaptación metabólica y la progresión del cáncer, que implica la autofagia, la apoptosis, la regulación del nivel de iones, y el trifosfato de adenosina síntesis (ATP) a través de el ácido tricarboxílico (TCA) del ciclo. El presente estudio investigó los efectos de la alta ingesta pi en la progresión del cáncer de pulmón y los mecanismos que subyacen en K-ras
ratones LA1, en el que la activación constitutiva de las oncogén K-ras conduce al desarrollo de adenocarcinoma de pulmón. Los resultados indican que un HPD promueve inicialmente pero más tarde inhibe la progresión del cáncer de pulmón como consecuencia de la adaptación metabólica que conduce a la quiescencia de las células tumorales.

Materiales y Métodos

Animales y dieta

los métodos utilizados en este estudio fueron aprobados por el Comité de Cuidado y uso de Animales de la Universidad Nacional de Seúl (SNU-120904-3-2). Los experimentos se llevaron a cabo en 5 semanas de edad K-ras masculinas
ratones LA1 obtenidos del Consorcio Humana del Cáncer del Instituto Nacional del Cáncer (Frederick, MD, EE.UU.). Los animales se mantuvieron en una instalación de laboratorio a una temperatura estándar de 23 ° C ± 2 ° C y una humedad relativa de 50% ± 10% bajo un ciclo de 12:12 h luz /oscuridad. Un total de 36 ratones fueron asignados aleatoriamente a seis grupos de seis ratones cada uno; medio de los ratones (1, 2, y 4 grupos mes) fueron alimentados con dieta a base de 93 un Instituto Americano estándar de Nutrición (AIN) que contiene 0,3% Pi (dieta normal, ND), mientras que la otra mitad (1, 2, y grupos 4 mes) se les dio la misma dieta suplementada con 1,0% Pi (HPD). La composición de la AIN-93G dieta de roedores purificada modificado [7] se muestra en la Tabla 1. El peso corporal, así como la cantidad de pellet y el volumen de agua consumida, se midió una vez a la semana. Al cabo de 1, 2, o 4 meses en la dieta, los ratones fueron anestesiados con /kg Zoletil (Laboratorios Virbac, Carros, Francia) se llevó a cabo 15 mg y 3 mg /kg de xilazina (Laboratorios Calier, Barcelona, ​​España), y la perfusión transcardial . Durante la autopsia, se retiraron el cerebro, timo, corazón, pulmón, hígado, bazo, riñón y testículo. Los tumores en toda la superficie del pulmón se contaron, y los diámetros de las lesiones se midieron con calibradores digitales bajo el microscopio como se describe anteriormente [8].

El examen histopatológico, la inmunohistoquímica, inmunocitoquímica y

Tejido Las muestras fueron fijadas en formalina al 10%, embebidos en parafina y se cortaron con un espesor de 5 micras, con secciones recogidas en portaobjetos de vidrio cargadas (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE.UU.). Para el análisis histopatológico, las secciones se deparaffinized en xileno y rehidratada a través de una serie graduada de alcohol, después se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.). Para la inmunohistoquímica, las secciones se desparafinaron en xileno y se rehidratan a través de una serie graduada de alcohol, se lavaron y después se incubaron en 3% de peróxido de hidrógeno (AppliChem, Darmstadt, Alemania) durante 30 min para inactivar la actividad de peroxidasa endógena y después se lavaron en tampón fosfato- de solución salina (PBS) y se incubaron con 3% de albúmina de suero bovino en solución salina Tris /Tween-tamponada durante 1 h a temperatura ambiente para bloquear la unión no específica. Los anticuerpos primarios contra el antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA) (PC10; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.) y la caspasa-3 (# 9662S; Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.) se aplicaron a secciones a escala 1: 200 y 1 : 1000 diluciones, respectivamente, durante la noche a 4 ° C. El día siguiente, las secciones se lavaron y se incubaron con anticuerpos secundarios de rábano picante y conjugado con peroxidasa (1:50) durante 1 h a temperatura ambiente. Después del lavado, las secciones se contratiñeron con hematoxilina de Mayer (DakoCytomation, Carpinteria, CA, EE.UU.) y se lavó con xileno, y se montaron usando Permount (Fisher Scientific). Los portaobjetos se observan bajo un microscopio de luz (Carl Zeiss, Thornwood, NY, EE.UU.). Para la inmunocitoquímica, los núcleos se tiñeron con 1 mg /ml DAPI después de bloquear y lavar tres veces con PBS. Un anticuerpo contra la proteína de cadena ligera 1A /1B asociada a microtúbulos (LC) 3 se aplicó a una dilución 1: 400 durante la noche a 4 ° C. Las secciones fueron lavadas, incubadas con el anticuerpo secundario conjugado con isotiocianato de fluoresceína, y luego montadas en portaobjetos de vidrio usando medio de montaje acuoso Faramount (DakoCytomation). intensidad de la tinción se evaluó mediante el recuento del número de células positivas en campos seleccionados al azar utilizando el software Studio En la versión 3.01 (Pixera, San Jose, CA, EE.UU.).

Western blot

La concentración total de proteínas en muestras de pulmón homogeneizados se determinó utilizando el reactivo de ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). Western Blot se realizó de acuerdo con un procedimiento descrito anteriormente [9] utilizando anticuerpos contra las siguientes proteínas: acetil coenzima (Co) A (# 3676), fosforilada (p) acetil CoA (# 3661), LC3 (# 2275), la autofagia proteína (ATG) 5 (# 2630), fosforilada (p) -p70 S6 quinasa
Thr389 (# 9205), 4EBP1 (# 9644S), y p-Akt
Thr308 (# 2965) (todos de Cell Signaling tecnología, Danvers, MA, EE.UU.); succinato deshidrogenasa, subunidad A (SDHA) (ab14715) y citocromo c oxidasa subunidad (COX) -IV (ab33985) (ambos de Abcam); citocromo c (A-8), Rieske (A-5), linfoma de células B (Bcl) -2 promotor muerte asociado-Bcl-2 (C-2), (Bad) (C-7), Bcl-2- proteína asociada a X (Bax) (B-9), eIF4E (P-2), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) -2 (147), antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA) (PC10), N-cadherina, y actina (I -19) (todos de Santa Cruz de Biotecnología); y deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato (LF-PA0212; AbFrontier, Seúl, Corea). Las bandas de proteínas se detectaron utilizando el analizador de imágenes luminiscentes LAS-3000 (Fujifilm, Tokio, Japón) y se cuantificaron utilizando el software versión 2.02 Multi Gauge (Fujifilm).

QRT-PCR análisis

QRT-PCR el análisis se llevó a cabo mediante el aislamiento de ARN usando ARN total fue aislado utilizando el kit de ARN QuickGene (Sistema de Ciencias de la vida de Fujifilm, Tokio, Japón). El ADN complementario fue producido con la SuPrimeScript RT Premezcla (Bio Genet, Cheonan, Corea). Las reacciones se establecieron por triplicado con el Primer Q-Mastermix (Bio Genet) y se ejecutan en CFX96T sistema en tiempo real (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). Las expresiones de genes se presentan como la expresión relativa a la actina. Las secuencias de los cebadores que se utilizaron para la qPCR fueron los siguientes ratón E-cadherina, hacia adelante (5'-TCGAGGAAATCTGCATTCATACTC-3 '), inversa (5'-TCTCCGCTGCCATTTCTAAC-3'), de ratón β-actina, hacia delante (5 ' - TTTCCAGCCTTCCTTCTTGGGTATG-3 '), y marcha atrás (5'-CACTGTGTTGGCATAGAGGTCTTTAC-3')

La detección de elementos traza en los tejidos

La ablación por láser acoplado inductivamente espectrometría de masas con plasma (LA-ICP. EM) se realizó con un sistema de ablación por láser de la nueva ola de Investigación UP-213 (Kenelec Technologies, Nueva Gales del Sur, Australia) equipado con un láser de granate de itrio y aluminio dopado con neodimio que emite un pulso láser de nanosegundos en el quinto armónico con una longitud de onda de 213 nm . El láser se conecta a un 7500ce ICP-MS (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EE.UU.) por el tubo de Tygon. Los detalles de los métodos de análisis han sido publicados anteriormente [10]. En pocas palabras, el haz de láser fue con trama a lo largo de la superficie de la muestra en una línea recta. Los datos fueron adquiridos con un tamaño de punto de láser de 65 micras, láser velocidad de escaneo de 20 micras s
-1, y el tiempo de integración total de ICP-MS de 0.325 s. Para el análisis elemental ICP-óptica espectrometría de emisión (ICP-OES), muestras de tejidos fueron digeridos en ácido sulfúrico y peróxido de hidrógeno. Todos los reactivos químicos fueron de grado analítico. Agua (resistividad de 18,2 mO) fue desionizada con un sistema Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.). El ácido nítrico (65% v /v) y ácido sulfúrico (95% -97% v /v) (ambos de Samchun Chemical Co., Seúl, Corea) se utilizaron para la preparación de la muestra. digestión ácida de muestras de tejidos diluidas con agua Milli-Q utilizando una concentración de ácido de 0,2% se realizó a 70 ° C durante 24 h seguido de peróxido de hidrógeno (70 ° C) la digestión durante la noche. Las concentraciones de elemental Mn, Fe, Cu, Zn y se cuantificaron por ICP-MS y las concentraciones de Na elemental, Ca, S, y P se midieron mediante ICP-OES. Condiciones de operación para ambos procedimientos se muestran en la Tabla 2.

El análisis estadístico

El Student
t-test
se utilizó para evaluar las diferencias entre los dos grupos (GraphPad Software , San Diego, CA, EE.UU.). Asteriscos (*) indican diferencias estadísticamente significativas a la ND.

Resultados

El alto consumo de Pi acelera la tumorigénesis en las primeras etapas en un modelo de cáncer de pulmón

Para investigar el efecto de la alta ingesta de Pi en el crecimiento de células de cáncer de pulmón, tumores en la superficie pulmonar se midió en HPD- y ratones alimentados-ND (Fig 1A). Todos los ratones alimentados con HPD mostraron adenocarcinoma progresiva y adenoma, como se observa por H & amp; E tinción (Figura 1C). Un alto consumo de Pi induce el desarrollo de cáncer de pulmón en períodos de 1, 2 y 4 meses (Tablas 3 y 4). El número y tamaño de los nódulos tumorales fueron mayores en el HPD que en el grupo ND a 1 y 2 meses (P & lt; 0,05), aunque la diferencia entre los grupos no fue estadísticamente significativa a los 4 meses (Fig 1B). El volumen del tumor también fue mayor en ratones que consumen una HPD que en los ratones ND, pero sólo en los grupos de 2 y 4 meses (Fig 1B). Un examen histopatológico reveló una de aproximadamente 2 veces más alta incidencia de adenocarcinoma y adenoma en los grupos de HPD de 1 y 2 meses que en sus homólogos de ND. Sin embargo, en el grupo de HPD 4-meses, la incidencia de adenocarcinoma y adenoma eran comparables a la del grupo ND a los 4 meses (Tabla 4), lo que sugiere que la tasa de formación de tumor se había reducido en este punto de tiempo.

Los ratones (n = 6 por grupo) fueron alimentadas con una ND (0,3% Pi) o HPD (1% Pi) para 1, 2, o 4 meses. (A) Adenocarcinoma y adenoma en el tejido pulmonar. (B) Número total de tumores, el número de tumores con un diámetro & gt; 1,5 mm, y el volumen del tumor en los ratones alimentados y ND--HPD. Los resultados son la media ± desviación estándar (DE) de seis mediciones independientes. barras de error representan SD. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt; 0.001. (C) Los tumores en los pulmones de los ratones y ND- HPD-alimentado, tal como puede verse por H & amp; E tinción. Barra de escala:. 100 micras

Los cambios en los niveles de iones de pulmón son inducidos por un HPD

Los cambios en los niveles de diversos iones se determinó por ICP-MS , ICP-OES, y LA-ICP-MS. En contraste con los ratones en el grupo ND, se detectaron los niveles de iones marcadamente mayor en los ratones alimentados con HPD: P, S, Fe, Mn y Zn fueron elevados en el hígado y los pulmones, y el nivel de Ca también fue mayor en los pulmones al 4 meses (Tabla 5 y figura 2). También se detectaron diferencias en los niveles de iones de pulmón entre los grupos ND y HPD a 1 y 2 meses, sin embargo, la diferencia más viva existía entre el grupo ND y HPD a 4 meses. Estos resultados implican que un alto consumo alimenticio de Pi durante un período prolongado no sólo altera la homeostasis del P sino también los niveles de otros iones.

LA-ICP-MS análisis representan los valores medios de tres ensayos de solución de ICP-MS /datos de ICP-OES (n = 6 por grupo). La barra vertical en color degradado de azul a rojo representa el nivel de iones de baja a alta, respectivamente.

Pi induce la producción de energía a través del ciclo de Krebs en el hígado

para investigar los efectos de un HPD sobre el metabolismo celular, los niveles de CoA total y p-acetil, y complejos II, III, y IV se evaluaron por transferencia de Western. Una regulación a la baja en la expresión de p-acetil CoA en el hígado se observó en el grupo de HPD en relación con los ratones de control a los 4 meses, mientras que la expresión acetil CoA estaba casi ausente (Fig 3). Por el contrario, los niveles de complejos II, III, y IV se upregulated en 1, 2, y 4 meses en el grupo de HPD, en comparación con aquellos en el grupo ND en el hígado. Además, el nivel del complejo de Fe-S Rieske se aumentó en el grupo de HPD en relación con el grupo ND. Estos resultados indican que el alto consumo de Pi causa una disregulación del metabolismo celular, conduciendo a una mayor producción de ATP.

expresión de la proteína de p-acetil CoA, acetil CoA, SDHA (complejo II), el citocromo c (complejo III), la COX IV (complejo IV), y Rieske (Fe-S complejo) con relación a la deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH) en homogeneizados de tejido de hígado de K-ras
ratones LA1 alimentados con una ND o HPD para 1, 2, o 4 meses (n = 6 por grupo), como se determina por transferencia de Western y se cuantificaron por densitometría. Los resultados son la media ± SD. barras de error representan SD. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0.01.

Una HPD aumenta la autofagia y la transición epitelio-mesenquimal en los pulmones

Los resultados anteriores indicaron que el alto consumo de Pi promueve inicialmente pero más tarde inhibe la tumorigénesis. Para evaluar si los cambios consistentes con la supresión de tumores se producen como resultado del consumo prolongado de alta Pi, se examinaron los marcadores de autofagia y epitelial a mesenquimal transición (EMT). La expresión de la LC3 marcadores autophagosomal y ATG5 se incrementó en los pulmones de los ratones alimentados-HPD, en comparación con los ratones alimentados con ND a los 4 meses, como se detecta por transferencia de western (Fig 4A). En muestras de tejido pulmonar, se observaron señales de LC3 ocasionales en los grupos de HPD de 1 y 2 meses por inmunocitoquímica (datos no mostrados), mientras que a los 4 meses, la señal fluorescente fue significativamente mayor en el HPD que en el grupo ND (Fig 4B ). Además, la expresión del marcador de EMT N-cadherina fue mayor en el HPD que en los grupos ND, aunque la diferencia entre las dos condiciones de la dieta fue mayor a los 4 meses (Fig 4C). En QRT-PCR análisis, la expresión del marcador epitelial E-cadherina fue menor en el HPD que en los grupos ND (Figura 4D). Estos resultados sugieren que la progresión tumoral es suprimida por el alto consumo de Pi en etapas posteriores debido a la activación de la autofagia y EMT.

(A) expresión de la proteína de la LC3 marcadores autofagia y ATG5 en homogeneizado de tejido pulmonar como se determinó por Western secante, utilizando actina como control de carga. (B) la expresión LC3 (verde) en las secciones de tejido pulmonar se evaluó por inmunocitoquímica. Se observó que la mayor inmunoreactividad en el 4-meses HPD grupo en relación con el grupo de control correspondiente (ND). Barra de escala: 10 micras. (C) Expresión de la proteína del marcador de EMT N-cadherina en los homogeneizados de tejido pulmonar de K-ras
ratones LA1 alimentados con una ND o HPD para 1, 2, o 4 meses (n = 6 por grupo), como se determinó por Western secante, utilizando actina como control de carga. Los resultados son la media ± desviación estándar SD. barras de error representan SD. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt; 0.001. (D) QRT-PCR análisis de marcadores epiteliales, E-cadherina. Los resultados son la media ± desviación estándar SD. barras de error representan SD. * P & lt; 0,05; *** P & lt; 0.001.

HPD consumo aumenta la traducción de proteínas en las primeras etapas del desarrollo del tumor

La vía mTOR regula la traducción de proteínas a través de la inhibición del factor eucariótico 4E proteína de unión 1 fosforilación (eIF4E-BP1) y la 70-kDa proteína ribosomal S6 quinasa (p70S6K), lo que afecta la proliferación de células tumorales. Se observó un aumento significativo en la expresión eIF4E y p70S6K en las muestras de los grupos de HPD de 1 y 2 meses en relación con el grupo de control (Fig 5). En contraste, los niveles de ambas proteínas se redujeron a los 4 meses en el grupo de HPD, en comparación con el grupo ND. Estos datos sugieren que la traducción de proteínas fue transitoriamente estimulada por Pi durante las primeras etapas del desarrollo del tumor
.
La expresión de las proteínas relacionadas con la traducción p70S6K, eIF4E, p-4E-BP-1/2, y 4e- BP-1/2 en los homogeneizados de tejido pulmonar de K-ras
ratones LA1 alimenta una ND o HPD para 1, 2, o 4 meses se determinó por transferencia de Western y se cuantificó por densitometría (n = 6 por grupo) con relación a la nivel de expresión de actina. Los resultados son la media ± desviación estándar SD. barras de error representan SD. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt; 0.001.

Un HPD estimula la proliferación celular y la angiogénesis en las etapas tempranas del desarrollo del tumor

El efecto de Pi en la progresión del tumor se investigó también mediante la evaluación de la proliferación celular y la angiogénesis en K-ras
ratones LA1. Los niveles de expresión de PCNA y FGF-2-marcadores de proliferación y angiogénesis, respectivamente en los pulmones de ratones en los grupos de HPD de 1 y 2 meses fueron aumentado en comparación con los de los grupos ND correspondientes, como se determinó por Western Blot (Fig 6A). En contraste, se observó una disminución significativa de estas proteínas en el grupo de HPD 4-meses. Estos resultados también se confirmaron mediante técnicas de inmunohistoquímica, que reveló una mayor inmunorreactividad de PCNA en las muestras de los grupos de HPD de 1 y 2 meses que en los de la 4-meses grupo HPD (Fig 6B). Estos resultados demuestran que la proliferación de células tumorales y la angiogénesis se aceleraron de Pi en las primeras etapas, pero que estos efectos fueron abolidos con el consumo prolongado Pi.

La proliferación y la angiogénesis se evaluaron en los pulmones de K-ras
LA1 ratones alimentados con una ND o HPD para 1, 2, o 4 meses (n = 6 por grupo). (A) La expresión de proteínas asociadas con la proliferación (PCNA) y angiogénesis (FGF-2) en homogeneizados de tejido pulmonar se evaluó por transferencia Western, utilizando actina como control de carga. (B) células PCNA-expresión en la región del tumor (en la esquina superior derecha de cada panel) se visualizaron por inmunohistoquímica. Barra de escala: 20 micras. Los resultados son la media ± desviación estándar SD. barras de error representan SD. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0.01.

Pi reduce la apoptosis mediada por mitocondrias en los pulmones

evasión de la apoptosis es un factor que contribuye en la carcinogénesis, la progresión del cáncer, y la adquisición de resistencia a la terapia. Para investigar si el consumo de Pi afecta a la apoptosis mediada por mitocondrias, los niveles de expresión de Bad, Bax, y las proteínas del citocromo c en el pulmón se evaluó por transferencia Western. Las tres proteínas se downregulated en los ratones alimentados con HPD en todos los puntos de tiempo (figura 7A). Por otra parte, la actividad de caspasa-3 en la región del tumor también se redujo a 1, 2, y 4 meses en el grupo de HPD, en comparación con el grupo ND (Fig 7B). Estos resultados indican que un HPD puede reducir la apoptosis mediada por mitocondrias en los pulmones de K-ras
ratones LA1.

La apoptosis en los pulmones se analizó en K-ras
ratones alimentados con una LA1 o ND HPD para 1, 2, o 4 meses (n = 6 por grupo). (A) La expresión de las proteínas relacionadas con la apoptosis mitocondrial Bad, Bax, y el citocromo c se evaluó mediante transferencia de Western de homogeneizados de tejido pulmonar, con la actina utilizado como control de carga. (B) El análisis inmunohistoquímico de la caspasa-3 en la región del tumor. Barra de escala: 20 micras. Los resultados son la media ± desviación estándar SD. barras de error representan SD. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0.01.

Discusión y Conclusiones

La progresión neoplásica implica una alteración del control homeostático de la proliferación celular, la muerte celular y la reparación del ADN como resultado de factores endógenos o la exposición a productos químicos carcinógenos exógenos [ ,,,0],11]. Pi actúa como una molécula mundial de señalización que regula la expresión génica en los hongos, bacterias y plantas, así como diversos tipos de células en los animales [12] en procesos tales como mineral o el metabolismo intermediario y transferencia de energía. Además, Pi es un componente esencial de los fosfolípidos y nucleótidos, y es necesario para la fosforilación de proteínas [13]

La inhibición de Na dependientes de fosfato co-transportador 2b suprimió el crecimiento del cáncer de pulmón.; También se encontró la proteína a ser altamente expresado en las etapas I y III humanos muestras de tejido de cáncer de pulmón [14]. En un modelo de ratón de cáncer de pulmón, el alto consumo de Pi se ha relacionado con una mayor traducción tapa que dependen, así como la tumorigénesis a través de la vía de señalización Akt en el cerebro, pulmón, hígado y [6,15-17]. Sin embargo, no se ha informado anteriormente los efectos del consumo prolongado de alta pi en la progresión del cáncer pulmonar; esto fue investigado en el presente estudio en K-ras
ratones alimentados con una LA1 HPD durante un período de 1, 2, ó 4 meses.

Los ratones consumieron una versión modificada de la dieta AIN-93, que carece de Ca y P. la composición de los gránulos fue modificada basada en la dieta AIN-93G mediante la sustitución de los elementos que faltan (por ejemplo, mediante la adición de fosfato de sodio para P) para satisfacer ND (0,5% de Ca, 0,3% de P) y HPD (0,5% de Ca, 1% P) condiciones. El consumo diario de Pi se incrementó mientras que la ingesta diaria de alimentos se mantuvo sin cambios (Tabla 3). Por otra parte, no hubo diferencia en el peso corporal entre los grupos ND y HPD (S1 FIG). No obstante, marcados cambios en los niveles de varios iones, incluyendo P, se observaron en el grupo de HPD 4-meses, en relación con el grupo ND (Tabla 5).

El hígado es un órgano importante para la digestión, así como el metabolismo de xenobióticos. La sangre que sale del estómago y los intestinos pasa a través del hígado, que descompone los componentes de nutrientes [18]. Dado que este proceso implica alteraciones en los niveles de iones, se realizó un análisis cuantitativo para evaluar los cambios en las concentraciones de diversos iones en ratones alimentados con una HPD. Un análisis del complejo de Fe-S Rieske por LA-ICP-MS reveló niveles más altos de Fe y S en los hígados de ratones alimentados con HPD que los ratones de control que se debe probablemente a un aumento del metabolismo celular. El nivel de P también se incrementó en todos los grupos de HPD. Un mayor consumo de ion metálico aumenta el riesgo de cáncer mediante la estimulación de la proliferación celular o la inhibición de los supresores de tumores tales como p53. Por ejemplo, citoplásmicos Ca
2 + actúa como un mitógeno [19]. ocurrencia de cáncer también se ha relacionado con aumento de la captación y la disminución de flujo de salida de Fe [20]. Por otra parte, un alto Fe
3+ nivel activa Fe
3 + dependientes de las proteínas que aumentan la proliferación celular [21]. Los macrófagos en el microambiente tumoral pueden acelerar el crecimiento del tumor en parte por proporcionar células tumorales con Fe [22], mientras elevada Fe
3+ niveles pueden aumentar el riesgo de cáncer. Alta Zn
2 + niveles pueden inducir la pérdida de potencial mitocondrial y dar lugar a la degradación de Bcl-2 [23]; Zn
2 + juega un papel clave en la regulación negativa de los genes relacionados con la apoptosis, tales como
Bax
,
Bcl-2
, y
survivina
, lo que conduce a la tumorigénesis [ ,,,0],24]. El daño a Bcl-2 es un factor causal en varios tipos de cáncer, incluyendo melanoma, mama, pulmón y próstata, y leucemia linfocítica crónica [25]. Estos hallazgos, junto con los resultados del presente estudio sugieren que el alto consumo de Pi durante un largo plazo altera los niveles de iones metálicos específicos y puede inducir la tumorigénesis. El trabajo adicional se encuentra actualmente en curso para determinar el papel exacto de estos iones en el desarrollo y progresión del cáncer.

El ciclo de Krebs es una ruta metabólica de generación de energía que comienza con la transferencia de un grupo acetil de dos carbonos de acetil- CoA en oxaloacetato [26]. Los complejos I-IV juegan un papel importante en la respiración celular y la producción de ATP [27]. Se encontró que la tasa metabólica basal fue mayor en el HPD que en el grupo ND, lo que sugiere que Pi activa el ciclo TCA en el hígado a través de un rápido consumo de la acetil-CoA. De hecho, un HPD indujo la regulación por incremento de proteínas de la cadena de transporte de electrones asociada como SDHA, el citocromo c, la COX-IV, y Rieske (Fig 3). La mayoría de los cánceres primarios y metastásicos se caracterizan por un aumento de la glucólisis, lo que conduce a un aumento de consumo de glucosa [28]. intermedios glucólisis se utilizan para la biosíntesis de células cancerosas, que por lo tanto requieren más ATP que las células que no se dividen [29]; Las células cancerosas también pueden usar la glucólisis aeróbica para metabolizar la glucosa, un fenómeno conocido como el efecto Warburg [28]. Un estudio reciente informó que el retículo endoplásmico ectonucleoside enzima trifosfato diphosphohydrolase 5 estimula el consumo de ATP y favorece la glucólisis aeróbica, promoviendo así la supervivencia de las células del cáncer [30]. Los resultados del presente estudio indican que la alta Pi activa el metabolismo celular y conduce a una mayor producción de ATP.

activación de la autofagia se observa tanto bajo condiciones de hipoxia y el hambre en el microambiente del tumor [31]. La autofagia promueve la supervivencia celular bajo el hambre de nutrientes transitoria y factor de crecimiento retirada [32] en respuesta a la captación de glucosa baja y la glucólisis, lo que conduce a una disminución en la tasa de traducción de la proteína [33]. Bajo condiciones de hipoxia, las células cancerosas exhiben características metabólicas alteradas tales como una regulación al alza de la glucólisis y de oxidación respuesta al estrés. biosíntesis continua de lactato a partir de la glucosa en condiciones aeróbicas representa una adaptación a condiciones de hipoxia esporádicos en lesiones premalignas y promueve la latencia de células de cáncer [34], en el que las células en el interior del tumor entran en un estado de quiescencia provocada por la baja disponibilidad de nutrientes y la hipoxia. actividad autofagia, como se evidencia por la expresión LC3-II, se induce como una respuesta adaptativa [35], mientras que la expresión de proteínas específicas de EMT se correlaciona con la agresividad del tumor [36]. En el presente estudio, se supuso que los tumores adaptados a los altos niveles de Pi que prolongaron el estado metabólico de baja energía, resultando así en la quiescencia de las células tumorales en los ratones en el grupo de HPD 4-meses. Durante la adaptación metabólica a la alta concentración de Pi, las células cancerosas también pueden desarrollar resistencia a los medicamentos y ser más agresivo [37]. Aquí, se observó que la expresión de los marcadores de autofagia LC3-II y ATG5, así como la de el marcador de EMT N-cadherina fue elevado en los pulmones de los ratones en el 4-meses grupo HPD (Fig 4C); Este hallazgo es consistente con los de estudios recientes que han demostrado que la activación de la autofagia se correlaciona con la adaptación del tumor y el consiguiente aumento de la agresividad del cáncer [38].

Otro estudio reciente encontró que la vía mTOR-Akt activado en aproximadamente 90% de no pequeñas células de cáncer de pulmón de células, que confieren supervivencia y resistencia a la terapia [39]. La proteína ribosomal p70S6K regula la traducción de proteínas a través de la vía de mTOR, y su inactivación suprime el crecimiento celular [40]. Además, la traducción y la fosforilación de 4E-BP1, que se expresa en una variedad de tumores malignos, está estrechamente ligada a la progresión del tumor. iniciación de la traducción es inhibida por la unión de 4E-BP1 y eIF4E, que conduce al reclutamiento del complejo de traducción para ARNm [41]. El ensamblaje del complejo eIF4F se completa por la liberación de hiperfosforilada 4E-BP1 de eIF4E, que permite la traducción de proceder [42]. iniciación de la traducción es el paso limitante de la velocidad de la síntesis de proteínas, y las tasas de traducción están determinados por los niveles de proteína eIF4E [43]. En el presente estudio, pP70S6K y eIF4E fueron altamente expresado en los pulmones de los ratones en los grupos de HPD de 1 y 2 meses, lo que sugiere que la rotación de la proteína y la progresión del tumor en estos ratones eran más altos que en los ratones que consumen alta Pi durante un período más largo

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