Extracto
La duplicación del brazo cromosómico 20q se produce en la próstata, cuello uterino, colon, estómago, vejiga, melanoma, páncreas y mama cáncer, lo que sugiere que la amplificación 20q puede jugar un papel causal en la tumorigénesis. De acuerdo con una visión alternativa, el desequilibrio cromosómico es principalmente un efecto secundario común de la progresión del cáncer. Para probar si una aberración genómico específico podría servir como un suceso iniciador del cáncer, establecimos un sistema in vitro que los modelos del proceso evolutivo de las primeras etapas de la formación de tumores de próstata; las células normales de la próstata fueron inmortalizados por la sobre-expresión de la telomerasa humana catalítica hTERT subunidad, y se cultivaron durante 650 días hasta que se observaron varias características de transformación. patrones de expresión génica se midieron y aberraciones cromosómicas fueron monitorizados mediante análisis de cariotipo espectral en diferentes momentos. Varios aberraciones cromosómicas, en particular la duplicación de 20q brazo cromosómico, se produjeron al principio del proceso y se fijaron en las poblaciones de células, mientras que otras aberraciones se extinguieron poco después de su aparición. Una amplia gama de herramientas bioinformáticas, aplicado a nuestros datos y los datos de varias bases de datos de cáncer, reveló que espontánea 20q amplificación puede promover la iniciación del cáncer. Nuestro modelo computacional sugiere que la amplificación 20q desregulación de varias vías específicas relacionadas con el cáncer, incluyendo la vía MAPK, la ruta de p53 y los factores del grupo Polycomb inducido. Además, la activación de Myc, AML, B-catenina y los factores de transcripción de la familia ETS fue identificado como un paso importante en el desarrollo del cáncer impulsada por 20q amplificación. Finalmente se identificaron 13 "cáncer que inician genes", situado en 20q13, que eran significativamente sobreexpresado en muchos tumores, con los niveles de expresión se correlacionan con el grado del tumor y el resultado que sugiere que estos genes inducen el proceso maligno sobre 20q amplificación.
Visto: Tabach Y, Kogan-Sakin I, Buganim Y, Salomón H, N Goldfinger, Hovland R, et al. (2011) La amplificación del 20q brazo cromosómico ocurre al comienzo de la transformación Tumorígeno y podrá iniciar el cáncer. PLoS ONE 6 (1): e14632. doi: 10.1371 /journal.pone.0014632
Editor: Vladimir Brusic, Instituto de Cáncer Dana-Farber, Estados Unidos de América
Recibido: July 9, 2010; Aceptado: 3 de diciembre de 2010; Publicado: 31 Enero 2011
Derechos de Autor © 2011 Tabach et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por una beca de la Fundación Leir Caridad y en la financiación comunitaria 6PM. Parte de los fondos fue proporcionada por el Centro para la Investigación de la Salud de la Mujer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Deterioro de la estabilidad del genoma es una de las características del cáncer [1]. número de copias aberraciones local de ADN han demostrado ser predictivo de los resultados [2], [3], [4] o de la respuesta al tratamiento [5], [6], [7] en varios tipos de cáncer. Aunque la mayoría de las células cancerosas exhiben ganancia o pérdida de regiones cromosómicas [8], todavía hay un debate entre los científicos si las aberraciones genómicas son esenciales para la iniciación del cáncer [9], [10] o un resultado del proceso tumorigénico [11], [12 ], [13]. Mientras que algunos informes sugieren que la ganancia de un cromosoma extra ejerce efectos antiproliferativos [14], [15], otros afirman que las aberraciones aneuploidía se producen en una fase premaligna [10], [16], [17], [18] lo que resulta en variaciones cromosómicas y fenotipo neoplásico [9].
Varios duplicaciones cromosómicas se han observado frecuentemente en muchos tipos de cáncer. Entre ellas, la ganancia recurrente y la amplificación del brazo largo del cromosoma 20 (20q) se ha observado en el 90% de las líneas de células pancreáticas [19], 15-83% de adenocarcinoma de páncreas [20], en torno al 70% de los cánceres gástricos primarios [21] y de cáncer de colon [18], [22], 50% de los de ovario y de cuello uterino y 90% de cáncer de mama [23] cánceres. Ganancia del brazo 20q cromosómico también ha demostrado ser un evento muy frecuente en las primeras etapas de la carcinogénesis de próstata [24], [25]. Además, el aumento de la región cromosómica 20q se observó transitoriamente en las existencias de principios de paso de fibroblastos humanos mamarios, inmortalizado con hTERT y gran SV40-tumoral oncogénica [26]. Notablemente, en casi todos estos estudios es la amplificación 20q más frecuente, y la supresión de este brazo es muy raro. Por otra parte, varios estudios muestran que la amplificación de 20q se correlaciona con mal pronóstico [27], fenotipo agresivo tumor, la progresión [28] y la formación de metástasis [19], [29], [30].
Evaluar si cromosómica desequilibrios desempeñan un papel causal en la tumorigénesis, en lugar de ser los espectadores es una tarea difícil. Los estudios realizados en muestras clínicas, de las dos aberraciones cromosómicas y la expresión génica, se ven obstaculizados por una variedad de factores de confusión, que se derivan de diferentes orígenes genéticos de los pacientes, variables y las mutaciones no caracterizadas en los tumores, y las contaminaciones no controlados por inflamatoria, endoteliales, y del estroma Células. Para superar estos obstáculos, que previamente establecido un modelo in vitro de transformación basada en los fibroblastos humanos de pulmón, WI-38, que dio lugar a la identificación de los patrones de expresión de genes [31], [32], [33] asociado a aberraciones genéticas [ ,,,0],34]. Además, los tumores sólidos humanos se obtienen generalmente de resecciones realizadas en un momento cuando el tumor ya está totalmente desarrollada, que excluye el acceso a información crucial sobre la iniciación y progresión del tumor.
Con el fin de obtener nuevos conocimientos sobre la primeras etapas de transformación y las redes genéticas asociadas con anomalías cromosómicas, se utilizó un modelo in vitro de transformación celular de próstata. En este modelo las células epiteliales de la próstata primarios que anteriormente se inmortalizaron mediante la introducción de la subunidad catalítica de la telomerasa, hTERT (EP156T) [35] se hicieron crecer en cultivo en condiciones controladas. El objetivo específico de este estudio fue examinar la hipótesis de que una aberración genómica particular, se produce en las primeras etapas de la carcinogénesis se acompaña de cambios en la expresión de genes que podrían servir como una fuerza impulsora para la tumorigénesis. Después de 650 días de cultivo las células derivadas EP156T compartían varias fenotípica, cromosómico y los atributos de la transcripción con muestras de cáncer de próstata. Se presenta en este documento en dos constataciones principales. El primero es el destacado y principios de papel de 20q amplificación en el desarrollo de nuestro cultivo celular in vitro hacia un fenotipo pre-malignas, con una tasa mayor proliferación. En segundo lugar, explicamos el potencial maligno de la duplicación 20q mediante la identificación de 13 genes que inician "cáncer", ubicado en 20q13, que se expresan en off en varios tipos de cáncer, y cuya expresión se correlaciona con el grado del tumor y el resultado.
Materiales y Métodos
Preparación de líneas celulares
células prostáticas humanas normales inmortalizadas por la introducción de la telomerasa [35] se hicieron crecer en cultivo durante 650 días, durante los cuales fueron analizadas para la tasa de crecimiento celular, los cromosomas alteraciones y perfiles de expresión. hTERT alarga cromosómica termina la prevención de la senescencia replicativa de varios tipos de células humanas normales [36]. se designa aquí las células EP156T hTERT inmortalizado como línea de N (Figura 1). las líneas C, G y M se derivaron de la N línea (Figura 1) después de 25 pasos (equivalente a alrededor de 150 días). para este fin, un mutante de la p53 supresor de tumores (p53R175H) clonado en un vector pLXSN retroviral se introdujo en la línea N. las nuevas células, que expresan establemente el mutante p53R175H, se designó a la línea M. En las células paralelas N también fueron infectadas con el vector pLXSN que contiene la secuencia de codificación GSE56 para un péptido corto que inactiva el gen supresor de tumor p53 en una forma dominante negativa [37], lo que dio lugar a la línea G. El plásmido pLXSN vacío se utilizó como un control de la generación de la línea C. Oncogénico H-RasV12 clonado en el plásmido retroviral pBabe-hygro se utilizó para la infección de las líneas C, G y M justo antes de pasaje 80 que genera la C8R, la G8R y las células M8R, respectivamente. Las líneas adicionales fueron creados por la infección de finales de paso N células con el plásmido pLXSN codificación o bien el mutante p53R175H (N8M), el GSE56 (N8G) o con el plásmido vacío (N8C) (Figura 1). La infección fue seguido por el mantenimiento de las células durante dos semanas en presencia de 400 mg /ml de neomicina (para células infectadas con el vector pLXSN) o con 50 mg /ml de higromicina (para las células infectadas con el vector pBabe-hygro) con el fin de seleccionar para la expresión estable de los plásmidos introducidos. El procedimiento de la infección retroviral se detalla en [32]. Las condiciones de crecimiento y los componentes de los medios de comunicación se detallan en [35].
Representación esquemática de los principales cultivos derivados de las células epiteliales de la próstata EP156T. Cada línea representa la subcultura generados in vitro por la introducción de modificaciones genéticas específicas. El eje x representa el número de pases en cultivo (aproximadamente una semana por paso). Los símbolos de chips representan puntos en los que se recogieron las células y su ARN hibridan con micromatrices; el código de la muestra resultante, por ejemplo, G5, representa la línea (G) y el número aproximado (50) de pases en cultivo dividido por diez. El símbolo indica una medición cromosoma SKY.
perfiles de expresión génica a lo largo del proceso de evolución de las culturas EP156T derivada
Para los perfiles de expresión génica, se tomaron muestras en 32 puntos a lo largo del proceso de cultivo y hibridado con el 2,0 array GeneChip Human Genome U133A (Figura 1). Los microarrays se preprocesados utilizando RMA [38] y normalizado. Toda la información es compatible con MIAME; los datos en bruto ha sido depositado en una base de datos GEO. El número de registro GEO es- GSE23038. Los genes que varían de 5000 la mayoría fueron ordenados por el algoritmo SPIN [39] y agruparon utilizando SPC [40] para identificar los 2 principales grupos estables de genes con un patrón de expresión correlacionada.
Análisis del cariotipo espectral (SKY)
células de crecimiento exponencial se incubaron con Colcemid (0,1 g /ml) durante la noche, se trataron con tripsina, se lisaron con tampón hipotónico, y se fijaron en ácido glacial acético /metanol (01:03). Los cromosomas se hibridaron simultáneamente con 24 combinatoria sondas marcadas cromosoma pintura y se analizaron utilizando el sistema SD200 espectral bioimagen (Applied Imaging Ltd. espectral, Migdal Haemek, Israel).
Análisis de la fase S
Subconfluent cultivos se marcaron durante una hora con 10 M de BrdU (Sigma). Las células fueron separadas con tripsina, se fijaron en 70% de etanol, y se trataron de la siguiente manera (lavados con PBS entre cada etapa): 2 M de HCl y 0,5% de Triton X-100 durante 30 minutos a temperatura ambiente; Na 0,1 M
2br
4O
7 a pH 8,5; Conjugado con FITC anti-BrdUrd (Becton Dickinson) diluido 1:03 en PBS /1% BSA /0,5% de Tween 20 durante 1 hora a temperatura ambiente; y, finalmente, 5 mg /ml de yoduro de propidio y 0,1 mg /ml de RNasa A. Las muestras se analizaron por el flujo de dos dimensiones citometría para detectar tanto fluoresceína y de propidio fluorescencia yoduro utilizando un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) (Becton Dickinson). Se analizaron al menos 10.000 células por muestra.
El aislamiento de ARN total
El ARN total para el experimento de microarrays y cuantitativa de PCR en tiempo real (QRT-PCR) se aisló utilizando el kit NucleoSpin® extracto de ARN (Macherey -Nagel), de acuerdo con el protocolo del fabricante.
cuantitativo PCR en tiempo real (QRT-PCR)
Una alícuota de 2 g de ARN total fue transcrito invertir utilizando MMLV RT (Promega) y al azar cebadores hexámeros. QRT-PCR se realizó utilizando el reactivo SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) en un instrumento ABI 7300 (Applied Biosystems). El nivel de expresión de cada gen se normalizó a la del gen GAPDH de limpieza en la misma muestra. Los cebadores fueron diseñados utilizando el software Primer Express. Primer secuencias están disponibles bajo petición.
La expresión Cariotipo
Los datos de expresión se utilizó anteriormente para inferir aberraciones cromosómicas [41], [42]. Nuestra hipótesis de trabajo es que los cambios en el número de copias del ADN de un cromosoma completo o parte de él se reflejan en la expresión génica. La deleción de un cromosoma provoca, en el promedio, en la regulación de la expresión de los genes de ese cromosoma, mientras que la duplicación debe reflejarse por un nivel de expresión más alto. Con el fin de identificar desequilibrios cromosómicos, se compararon los niveles de expresión de los genes que residen en cada brazo cromosómico, en cada muestra, a una muestra de referencia de las células normales (N0), y búsquedas de diferencias significativas en los niveles de expresión. Hemos introducido aquí un método para cromosómico Desequilibrio Análisis, basado en un ensayo t por parejas, para obtener copia cromosómica información del número de datos de expresión. Se describe el método de análisis de desequilibrios cromosómicos, probado y comparado con una técnica derivada previamente [42] en el texto complementario S1, ver las figuras S1 y S2.
La comparación de los dos métodos de cálculo con el cielo
Dos métodos se han utilizado para identificar "cariotipo expresión" en las muestras. Utilizando el análisis de desequilibrios cromosómicos se calculó, para cada muestra
s
, un valor de p para cada cromosoma para probar si la diferencia media entre los genes en N0, en comparación con la muestra
s
, es diferente de cero. El enfoque binomial [42] determina si una fracción significativa de los genes en el cromosoma es-expresado en más de
s
frente N0 (o sub-expresado). Para más detalles sobre las diferencias entre los dos enfoques complementarios S1 ver texto.
Los resultados obtenidos por el cielo, los cuales fueron utilizados para estimar la capacidad de predicción de los dos métodos de cálculo, se analizaron de la siguiente manera. Si se observó una aberración cromosómica en más de 50% de las células cariotipo, se consideró como una verdadera aberración; de lo contrario, se interpretó como ruido y se retira del análisis. Usando esta definición de los resultados de SKY como la "verdad terreno", se compararon los resultados de los dos métodos de cálculo, utilizando las características de funcionamiento del receptor análisis (ROC) (ver figura S2). Las actuaciones de los dos métodos fueron similares, y que adoptaron el análisis de desequilibrios cromosómicos aquí.
cromosómico correlación Análisis Desequilibrio
Denotemos por
E
gs
el nivel de expresión (después del registro y de umbral) de probeset
g Hoteles en muestra de
s
. Para cada probeset g en la muestra
s
calculamos Δ
E
gs
=
E
gs CD -
E
g,
N0. Calcular para cada muestra
s
la mediana de la Δ
E
gs Opiniones de la probeset cambiar significativamente de 20q (tal como se define en el texto complementario S1 sobre Análisis desequilibrios cromosómicos), para obtener
H
s
. Para cada probeset
g En venta 20q calculamos la correlación de Pearson entre los dos conjuntos de números:
E
gs
y
H
s
, y la llamada esto como el análisis de desequilibrios cromosómicos correlación de probeset
g gratis (con el cariotipo expresión de 20q).
construir el cariotipo evolutiva árbol
construyó un "cariotipo árbol evolutivo" combinar los datos de los resultados cielo y el cariotipo expresión. El cariotipo "especie" normales (46, XY) fue la raíz /antepasado de todos los cariotipos evolucionados. El árbol se construyó utilizando manualmente la información obtenida mediante el cariotipo de expresión y el cielo. Si los datos de cariotipo expresión no fueron consistentes con los datos de cielo en un punto específico, que interpolamos el comportamiento de dos puntos adyacentes, en el supuesto de que se trataba de un proceso continuo.
Copia análisis del número de
ultra-alta resolución de Affymetrix todo el genoma SNP arrays humanos 6.0 se utilizaron para examinar los cambios adquiridos genómica número de copias y la pérdida de heterocigosidad de las células EP156T. El ADN genómico fue purificado utilizando el DNAkit tisular (Cat.#D3396-02, EZNA, OMEGA Biotek). prehandling ADN y la gama de hibridación se realizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante (P /N 702504, Rev3, Affymetrix, Santa Clara, CA), y escaneado en un control de calidad de Affymetrix GeneChip 3000. escáner, llamada genotipo, la normalización de la sonda de nivel y el número de copias de normalización para producir log
2 proporciones se hicieron en v3.0.1 Affymetrix GeneChip ® Genotipado consola. Se utilizó un archivo de referencia interna generada a partir de 59 donantes de sangre sanos. análisis y visualización de datos se llevó a cabo en la suite El análisis cromosómico con un umbral del mínimo de 100 kb y 20 marcadores. Las aberraciones son reportados de acuerdo con la nomenclatura ICSN y NCBI construir 36.
Redes y gráficas Representaciones
Los datos fueron analizados mediante el uso de Ingenuity Pathways Analysis (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com). La red es una representación gráfica de las relaciones moleculares entre los productos de genes /genes. Los genes o productos génicos se representan como nodos, y la relación biológica entre dos nodos se representa como un borde (línea). Todos los bordes son apoyados por al menos una referencia de la literatura, a partir de un libro de texto, ni de información canónica almacenada en la base de conocimientos Ingenuity Pathways. Humanos, de ratón, rata y ortólogos de un gen se almacenan como objetos separados en el ingenio Pathways Knowledge Base, pero están representados como un único nodo en la red. Los nodos se muestran con diferentes formas que representan la clase funcional del producto génico.
Resultados
Un modelo in vitro para la carcinogénesis de próstata temprano
Con el fin de seguir la progresión inicial etapas hacia la malignidad en la carcinogénesis de próstata, hemos establecido un sistema basado en epitelial-hTERT inmortalizado benigna de próstata (EP156T) células [35]. Estas células inmortalizadas se designan aquí como línea de N. En el paso 25, N células fueron manipuladas para sobreexpresar reactivos que inactivan el gen supresor tumoral p53. A tal fin, p53R175H mutante de la p53 supresor de tumores clonado en un vector pLXSN retroviral se introdujo en la línea N en paralelo con el GSE56, un péptido p53-inactivación, se clonó en el vector pLXSN, y con un plásmido pLXSN vacío como control . Las cuatro líneas celulares inmortalizadas incluyendo Normal (N), transducidas con GSE56 (G), con p53R175H mutante- (M) y con un vector vacío de control (C) se cultivaron durante 500 días adicionales en vitro. La figura 1 representa esquemáticamente este modelo. A lo largo de este manuscrito, las muestras se indican mediante LX, donde L = N, G, H o C y los X número indica el número de pasajes (± 3) en la que se tomó la muestra específica, dividido por diez (por ejemplo, G4 representan la muestra tomada desde la línea de IGE en el paso ~ 40). Justo antes de pasaje 80, oncogénica Ras (H-RasV12) se introdujo en las líneas C, M y G rendimiento C8R, M8R y líneas G8R, respectivamente como se muestra en la Figura 1. Para este fin, el oncogén H-RasV12 clonó en pBabe- se utilizó Hygro vector retroviral. Además, los reactivos retrovirales descritas anteriormente se utilizaron para sobre-expresar la GSE56 y p53R175H mutante en las células de la línea N en un pasaje tarde, la generación de la N8G, N8M y líneas N8C (Figura 1). Una infección retroviral fue seguido por dos semanas de la selección de medicamentos para inducir la expresión estable (ver Materiales y Métodos). Para obtener una imagen completa de los cambios evolutivos durante el cultivo prolongado de los cultivos celulares, hemos querido combinar el análisis de la tasa de crecimiento celular, alteraciones cromosómicas y de perfiles de expresión a lo largo de 650 días en la cultura de las líneas N, C, G y M. Para alcanzar este objetivo, las células fueron muestreados a lo largo de este período y se realizaron los análisis de la proliferación celular, la expresión génica y cariotipo (Figura 1).
Tras el establecimiento de nuestro modelo in vitro de transformación en, era importante evaluar si este sistema puede representar el cáncer humano in vivo de una manera fiable. A tal fin, se examinó si a lo largo de los 650 días de cultivo, las células adquirieron EP156T características moleculares y fenotípicas típicas de los tumores reales. Como la proliferación celular es la característica básica de la transformación cancerosa, la tasa de crecimiento de las células y el porcentaje de células en proliferación (i. E., Las células en la fase S del ciclo celular), fueron evaluados. De hecho, un aumento en la tasa de crecimiento de las células fue evidente a medida que el cultivo progresaba células (Figura 2A). De acuerdo con esto, se detectó una mayor proporción de células en proliferación en pasajes posteriores, como se juzga por el etiquetado BrdU y el análisis FACS (Figura 2B). Además, la expresión del gen supresor de tumor p16INK4a disminuyó con el tiempo en cultivo en las cuatro líneas celulares (Figura 2C). Los niveles reducidos de p16INK4a son comúnmente observados en los tumores de próstata avanzado [43] y se encontró que eran uno de los eventos centrales en un proceso de transformación in vitro de humanos WI-38 fibroblastos [31], [32], [33]. A continuación, hemos querido examinar si el patrón de expresión génica de las culturas EP156T derivados asemeja a la de los tumores in vivo. Para lograr este objetivo, se realizó el siguiente análisis. Al perfiles de expresión génica de las células EP156T, se realizó un análisis de agrupamiento para identificar los genes con patrones de expresión correlacionada. Los patrones de expresión de los dos grupos más importantes se presentan en las figuras 2D y 2E. El primer grupo (Figura 2D) contenía 177 transcripciones que fueron regulados hasta el paso del tiempo en la cultura. Al examinar el enriquecimiento de ontología de genes (GO) usando el software David [44], se encontró que estos genes estaban asociados con la proliferación celular. Por lo tanto, este grupo se denomina la "proliferación grupo" a lo largo del manuscrito. Esta tendencia de expresión fue validado por QRT-PCR en tres genes representativos (Figura S3). El segundo grupo (Figura 2E) contenía 296 transcripciones adhesión celular glicoproteína y moléculas y su expresión correlaciona negativamente con la proliferación grupo. Para evaluar si estos cambios en la expresión génica pueden estar relacionados con el proceso de transformación de las células EP156T, se analizó la expresión de los genes de ambas agrupaciones en un conjunto de datos de 99 muestras, obtenida a partir de la próstata normal, tumor y la metástasis de los pacientes de cáncer de próstata [45 ]. Sorprendentemente, la expresión de genes de ambos grupos significativamente correlacionado con su expresión en este conjunto de muestras clínicas de progresión del cáncer (Figura 2D y 2E, abajo). El hallazgo de que, el patrón de expresión de genes de nuestro modelo in vitro parece a la de cáncer de próstata avanzado, sugiere que este modelo recapitula los acontecimientos moleculares que se producen durante la transformación maligna in vivo de la glándula prostática. El análisis detallado de estos grupos y de la comparación con los datos in vivo se proporciona en el texto S1. En conjunto, estas observaciones sugieren que durante el prolongado en el cultivo in vitro de células inmortalizadas EP156T de próstata, un proceso de selección se llevó a cabo a favor de la supervivencia de las células con capacidades proliferativas más altas que podrían dar lugar a un fenotipo transformado.
A. Número de duplicaciones de la población de las culturas EP156T derivados (C, G y M) calculados en intervalos de 50 días durante el período de cultivo de 650 días después de la infección hTERT, junto con el número de duplicaciones de población realizadas por las células no infectadas EP156 en el primer 50 días en las células del EP156T (N) y la cultura durante los próximos 100 días en cultivo. B. Porcentaje de células en proliferación (fase S) se midió por medio del etiquetado BrdU de pasaje temprano (C4) y las células pasaje tarde (C8). C. tiempo real QRT-PCR para la expresión p16INK4a en las diferentes muestras de sistema EP156T. D. Top: matriz de la expresión de un grupo de genes cuya expresión aumentó durante el proceso de transformación. Dentro de cada línea de muestras se ordenan a partir de principios de la década de los pasajes. Panel inferior: el patrón de media la expresión de estos genes en muestras de pacientes con cáncer de próstata [45]. El valor de p para la diferencia en la expresión entre normal y el cáncer es p = 0,00024 y de normal y el cáncer de metástasis es p = 0,00013. E. Arriba: grupo de genes que contienen más representadas glicoproteína y genes de la región extracelular, las muestras para cada línea están ordenados desde principios de la década de los pasajes. El clúster es el regulado durante el proceso de transformación. El gráfico inferior presenta la media de expresión de los genes de la agrupación en muestras de cáncer [45]. El valor de p para la diferencia en la expresión entre normal y el cáncer es p = 0,00013 y de normal y el cáncer de metástasis es p = 0,00023.
introducción exógena de la telomerasa inducida por la inmortalización de las células debido a la EP156T alargamiento de los telómeros, que era evidente después de mantener las células durante largo período in vitro [35]. Además, también se mantuvieron sobre-expresión de la forma mutante de la p53 supresora de tumores y del péptido p53 de inactivación GSE56 por un largo período después de su introducción a las células. Un análisis detallado de las funciones específicas de p53R175H mutante sobre-expresado en células EP156T se presenta en [46]. La retención de la telomerasa y formas alteradas de p53 en las células EP156T con el tiempo sugiere que estos genes pueden jugar un papel en el mantenimiento de la transformación.
20q amplificación surgió y dominó la población de células en las primeras etapas del proceso
las anomalías cromosómicas.
Nos volvieron a examinar las variaciones del número de copias cromosómicas en las células, ya que se han encontrado para ser relacionado con fenotipos de cáncer. Con este fin, se estimó el patrón de aberraciones cromosómicas en el nivel de la población que utiliza análisis computacional de los datos de expresión (ver Métodos), y en el nivel de células individuales mediante cariotipo espectral (SKY). Utilizamos nuestros datos para seguir la evolución temporal de la "cariotipo expresión" - es decir, las aberraciones cromosómicas, ya que se reflejan en el patrón de expresión génica. Nuestros datos constituyen una serie en tiempo real, lo que nos da ventajas significativas en la identificación de la progresión de las aberraciones cromosómicas dominantes.
El "cariotipo expresión" reveló variación temporal significativa de los niveles de expresión de los genes de varios brazos cromosómicos para las diferentes líneas (Figura 3). brazo cromosómico 20q mostró los cambios más pronunciados de expresión y se asoció con los valores de p más significativos en todas las líneas. Cuando se compara con N0, la expresión de 20q mostró aproximadamente 1,5 veces mayor en la línea de N y en los primeros pasajes de las líneas M, G y C. Curiosamente, a finales de los pasajes de las líneas M, G y C de este factor de cambio aumentó a ~1.8. Estos resultados sugieren que las células con una trisomía de 20q dominados la población de células en las primeras etapas del proceso, y en el C, G y M líneas de eventos secundarios siguieron y crearon más de 3 copias del brazo 20q. aberraciones adicionales que se observaron fueron amplificaciones de 9Q y 13q en la línea N; de 7p, 7q, 18q y, más tarde en el proceso, de 3p en la línea C; amplificación de 9p, 11P y, de manera menos significativa, de 13q en la línea G; en la línea M se identificaron, además de amplificaciones de 13q y 20p, también deleciones de 10p y el cromosoma 16 (después del paso 60).
nivel de expresión de cada gen anotado a un brazo cromosómico particular, se comparó con su nivel de expresión en la muestra N0 (células EP156 primarios en el paso 8) que representa la cultura parental de las cuatro líneas. Para cada una de las líneas N, C, G y M (véase el texto) el panel superior muestra los cambios coordinados en la mediana de la expresión de genes anotados a regiones cromosómicas específicas, dividido por su mediana de expresión en N0. El panel inferior es el -log
10 (valor de p) de la prueba t pareada entre los genes en N0 y las otras muestras (eje x) en un brazo cromosómico específico. La figura presenta los brazos cromosómicos estadísticamente significativas (p-value & lt; 0,001 y cambio pliegue mediana & gt; 1,5 o Y lt; 0,5, al menos, en un momento dado).
Hemos realizado 24 mediciones SKY en diferentes etapas de el proceso; en cada examinamos entre 4-10 células (los resultados se resumen en la Tabla 1). SKY, de acuerdo con el cariotipo expresión, identificado la duplicación de los cromosomas 20, 3, 7, 9, 18 y 16 a lo largo de la supresión de las diferentes líneas. Además, translocaciones que afectan a los cromosomas 10, 11 y 20 que fueron identificados por el cielo, fueron reconocidos como deleciones /duplicaciones por el cariotipo expresión (como se discutirá más adelante).
En varios puntos los resultados de SKY no se comportan de acuerdo con nuestras expectativas (Tabla 1). Para realizar el análisis de SKY, se descongelaron las células y volver a crecer a varios puntos en lugar de utilizar exactamente la misma población que se tomó para microarrays. Por lo tanto efectos fundadores pueden ser responsables de las incoherencias entre diferentes resultados SKY (por ejemplo, la duplicación del cromosoma 7 en el pasaje 41 es incompatible con pasajes 31 y 52) y entre el cielo y el cariotipo expresión observada en algunos puntos (por ejemplo, la duplicación del cromosoma 18 en el línea C o las deleciones de los cromosomas 13 y 5 en N8 muestra).
el árbol de la evolución cariotipo.
Para comprender mejor los procesos evolutivos que se produjeron en el curso de nuestro experimento, se construyó un "cariotipo árbol evolutivo" (Figura 4) combinación de datos de los resultados de SKY y expresión. De manera similar a otros árboles evolutivos, el "árbol de la evolución cariotipo" nos permite entender mejor qué cariotipo "especie" surgen, evolucionan o se extinguieron durante el proceso. El árbol evolutivo señala el rasgo (en nuestro caso la inserción, deleción o aberración específica) que le da la ventaja de crecimiento cariotipo seleccionado sobre otros cariotipos. Si los datos de la expresión cariotipo no fueron consistentes con los datos de análisis de SKY en un punto específico, que interpolamos el comportamiento de los dos puntos adyacentes (ver Métodos). Por ejemplo, los resultados de SKY en la línea C mostraron células con combinaciones de supresiones y amplificaciones adicionales. Aunque varias construcciones posibles de la línea de árboles de C eran posibles, la evidencia tanto de la cariotipo expresión y de SKY sugirió que el efecto más dominante en estas células fue la duplicación del cromosoma 7 (en el paso 40), seguido por la duplicación del cromosoma 18, que más tarde fue seguido por la duplicación del cromosoma 3. por otra parte el cariotipo expresión en las muestras C6 y C7 mostró disminución inesperada en la mediana de pliegue cambios en todos los cromosomas aberrantes (ver Figura 3). Creemos que SKY representa con mayor precisión la verdadera cariotipo en estos puntos de tiempo.
La figura fue generada sobre la base de los resultados 24 cielo a lo largo del proceso de transformación del cáncer de próstata y el cariotipo expresión. Se utilizaron células humanas normales de la próstata (lado izquierdo de la figura) para establecer 4 inmortalizado diferentes líneas: GSE, de control, normal, y p53 mutante (ver texto) que proliferan durante 80 pasajes (eje x).