Extracto
La línea celular FET, derivada de un carcinoma de colon en estadio temprano, es no tumorigénicos en ratones desnudos atímicos. FET células de ingeniería (FETα) pantalla constitutivamente activa la señalización del EGFR /ErbB que expresan TGF-α. Estas células forman fácilmente tumores de xenoinjerto en ratones desnudos atímicos. Es importante destacar que, las células FETα conservaron su respuesta a la inhibición del crecimiento TGF-beta mediada, y, como las células de FET de los padres, la expresión de un receptor dominante negativo de tipo TGF-beta II (DNRII) en células FETα (FETα /DNRII) abrogó capacidad de respuesta a TGF beta inducida por la inhibición del crecimiento y la apoptosis en condiciones de estrés
in vitro
y el aumento de potencial metastásico en un modelo ortotópico
in vivo
, lo que indica actividad supresora de la metástasis de la señalización de TGF-beta en este modelo. angiogénesis del cáncer es ampliamente considerado como un atributo clave para la formación y progresión tumoral. Aquí nos muestran que la señalización de TGF-beta inhibe la expresión de factor de crecimiento vascular endotelial A (VEGFA) y que la pérdida de autocrina TGF-beta en células /DNRII FETα dado lugar a una mayor expresión de VEGFA. Regulación de la expresión VEGFA por TGF-beta no está al nivel de la transcripción, pero a nivel post-transcripcional. Nuestros resultados indican que el TGF-beta disminuye la estabilidad de proteínas VEGFA a través de la ubiquitinación y la degradación en una vía PKA- y Smad3-dependiente y Smad2-independiente. Inmunohistoquímica (IHC) el análisis de los tumores ortotópico mostraron una reducción significativamente la señalización de TGF-beta, el aumento de CD31 y tinción VEGFA en los tumores de células FETα /DNRII en comparación con los de las células de control de vector. Estos resultados indican que la inhibición de la señalización de TGF-beta aumenta la expresión de VEGFA y la angiogénesis, lo que podría contribuir potencialmente a la metástasis mejorada de esas células
in vivo
. IHC estudios realizados sobre muestras de adenocarcinoma de colon humano demostraron que la señalización de TGF-beta se correlaciona inversamente con la expresión VEGFA, lo que indica que la supresión mediada por TGF-beta de expresión VEGFA existe en pacientes con cáncer de colon
Visto:. Geng L, Chaudhuri a, G Talmon, Wisecarver JL, Wang J (2013) La angiogénesis mediada-VEGFA TGF-beta suprime la metástasis del cáncer de colon en. PLoS ONE 8 (3): e59918. doi: 10.1371 /journal.pone.0059918
Editor: Lu-Zhe Sun, Universidad de Texas Health Science Center, Estados Unidos de América
Recibido: 14 Diciembre, 2012; Aceptado: 20 Febrero 2013; Publicado: 25 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Geng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud subvenciones P20RR018759 y R01CA140988-01 (http://projectreporter.nih.gov/project_info_description.cfm?aid=8215881&icde=14708223&ddparam=&ddvalue=&ddsub=&cr=1&csb=default&cs=ASC) JW. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta) comprende un grupo de polipéptidos multifuncionales que regulan diversos procesos celulares, incluyendo la proliferación celular, la apoptosis, la diferenciación, la migración, tumorigenecity y metástasis, mediante la unión a los receptores de TGF-beta. Muchos estudios indican que el TGF-beta actúa como o bien un promotor de tumores o un supresor de tumor de señalización. La función del promotor tumoral de TGF-beta se ha asociado con su capacidad para inducir una transición epitelial a mesenquimal (EMT), que confiere resistencia a los efectos apoptóticos de TGF-beta [1] - [3]. Sin embargo, nosotros y otros han demostrado experimentalmente que el TGF-beta media la actividad supresora de tumores en una variedad de cánceres incluyendo el cáncer de colon, y que la pérdida de la señalización de TGF-beta conduce a la adquisición y la progresión de la malignidad [4] - [11]. Nuestros estudios recientes demuestran que la señalización de TGF-beta suprime la metástasis en un subconjunto de células de cáncer de colon en un modelo ortotópico
in vivo
[12]. Por lo tanto la identificación del mecanismo (s) por el cual el TGF-beta provoca su función de supresor de la metástasis es crucial para nuestra comprensión de la progresión del tumor y para el desarrollo de estrategias terapéuticas eficaces.
La angiogénesis es un determinante importante de la progresión del tumor. Los tumores sólidos no pueden crecer más allá de cierto tamaño sin suministro vascular suficiente para proporcionar suficiente oxígeno y nutrientes. La vía de VEGF /VEGFR es un mediador clave de la angiogénesis [13] y VEGFA actúa como un potente factor angiogénico tumor [14]. VEGFA estimula el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos, que proporcionan los tumores con oxígeno necesario y nutrientes [14], [15]. La expresión de VEGFA ha demostrado ser regulada en los niveles de transcripción y traducción [16] - [19]. Regulación de la expresión VEGFA por la señalización de TGF-beta no ha sido muy bien estudiada. Se ha informado de que el TGF-beta induce la secreción de VEGF en las células citotrofoblastos humanos [20]. Por el contrario, otro grupo mostró que los oligonucleótidos antisentido TGF-beta aumenta la expresión de VEGFA en los queratinocitos humanos y fibroblastos de piel
in vitro
[21]. Por lo tanto, el TGF-beta puede regular diferencialmente expresión VEGFA depende de contexto celular.
La línea celular de carcinoma de colon FET, que se aisló a partir de un cáncer en etapa temprana bien diferenciado, retiene la actividad del TGF-beta autocrino. Estas células forman un pequeño nódulo tumoral en el sitio de la inoculación en ratones desnudos atímicos que no crece progresivamente y luego retrocede durante 3-5 semanas [5], [22]. La incapacidad de estas células de carcinoma de colon derivada para generar el crecimiento progresivo del tumor
in vivo
sugiere que, en relación a las líneas celulares modelo más avanzaba, células FET conservan muchos controles normales de crecimiento, incluida la respuesta inhibitoria a TGF-beta. Por lo tanto, las células fueron diseñados FET para expresar TGF-α (FETα), que activa constitutivamente EGFR señalización /ErbB. Estas células (FETα) forman fácilmente tumores de xenoinjertos en ratones desnudos [22]. Sin embargo, las células FETα conservaron su respuesta a la inhibición del crecimiento mediada por TGF-beta y rara vez metástasis
in vivo
. La expresión de un receptor dominante negativo de tipo TGF-beta II (DNRII) en células FETα, designado FETα /DNRII, abrogó la capacidad de respuesta a la inhibición de crecimiento TGF-beta inducida por apoptosis y en condiciones de estrés
in vitro
y aumentó significativamente metastásico potencial en un modelo ortotópico
in vivo
[12]. Así pues, parece que la pérdida de TGF-beta respuesta supresor de tumor es permisivo para el desarrollo de la metástasis por células FETα, que proporciona pruebas en apoyo de la función de la metástasis supresor de la señalización de TGF-beta en este modelo celular. El estudio actual utiliza la FETα /vector y el sistema de modelo celular FETα /DNRII para poner a prueba la hipótesis de que la señalización de TGF-beta media la angiogénesis a través de la regulación de la expresión de VEGFA, lo que podría contribuir a la función supresora de la metástasis del TGF-beta. En este estudio, mostramos que, en las células de cáncer de colon, el TGF-beta inhibe la expresión VEGFA a nivel post-transcripcional, probablemente por la disminución de la estabilidad de proteínas VEGFA través de ubiquitinación y degradación. Esta regulación es Smad3-dependiente y Smad2-independiente. Nuestros datos también indican que el TGF-beta mediada por la regulación por disminución de la expresión de VEGFA es a través de una vía mediada por PKA. Además, se demuestra que la pérdida de autocrina TGF-beta en FETα células /DNRII resultado en una mayor expresión de VEGFA en comparación con las células control tanto
in vitro
y
en viv sobre O, lo que sugiere que un aspecto de la actividad del TGF-beta autocrino en su contexto metástasis supresor reprime la angiogénesis. Finalmente, los estudios de IHC de las secciones de adenocarcinomas de colon humano revelan que la señalización de TGF-beta se correlaciona inversamente con la expresión de VEGFA, lo que indica que la relación entre la pérdida de la actividad de TGF-beta y un aumento de la expresión de VEGFA también existe en pacientes con cáncer de colon.
Materiales y Métodos
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por la Universidad de Nebraska Medical Center cuidado de animales institucional y el empleo Comisión (IACUC #: 07-043-08-FC).
Líneas celulares reactivos y
Las células FETα /DNRII se obtuvieron por transfección de un receptor dominante negativo de tipo II de TGF-a células FETα, mientras que las células de control FETα /vector fueron generados por transfección de un plásmido de control. FETα /vector, FETα /DNRII, HCT116, RKO, C, CBS, GEO y células de carcinoma de FET de colon parentales [9] se cultivaron a 37 ° C en un incubador humidificado con un 5% de CO
2 en McCoy 5A libre de suero medio (Sigma) suplementado con 5 ng /ml factor de crecimiento epidérmico, 20 mg /ml de insulina, y 4 mg /ml de transferrina, como se describe anteriormente [23]. Recombinante TGF-beta 1 humano fue adquirido de R & amp; D Systems. La cicloheximida, MG132 y PYR41 se adquirieron de AMRESCO, Sigma y CALBIOCHEM respectivamente.
análisis de transferencia Western
Las células se lisaron en tampón de lisis NP40 (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 150 mM , 0,5% NP-40, mM NaF 50 mM, Navo 1
3, 1 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo, ditiotreitol 1 mM, 25 mg /ml de aprotinina, 25 mg /ml de inhibidor de tripsina y 25 mg /ml de leupeptina) a 4 ° C y se utiliza para análisis de Western blot como se describió previamente [24], [25]. En breve, la proteína total de los lisados celulares (30 a 60 g) se separó por SDS-PAGE y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa. Las proteínas se detectaron usando un sistema de quimioluminiscencia potenciada (Amersham Biosciences). Los anticuerpos para análisis de transferencias de Western de VEGFA, Smad2 /3, pSmad2 /3, PKA y la actina se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology Inc, Abcam, Chemicon, Cell Signaling Technology y Sigma, respectivamente.
Aislamiento de ARN y RT PCR
ARN celular total a partir de células de FET se aislaron usando el reactivo de aislamiento de ARN total de Trizol (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para RT-PCR, 2 g de ARN fue transcrito de forma inversa con M-MLV transcriptasa inversa (Promega), utilizando un cebador aleatorio. Dos microlitros del producto de cDNA se utilizó para amplificar VEGFA humano. primer secuencias de VEGFA fueron 5'-CGGATCAAACCTCACCAAGGCC-3 '(hacia delante) y 5'-CTTTCTCCGCTCTGAGCAAGGC-3' (hacia atrás). Condiciones para la amplificación fueron: un ciclo a 94 ° C durante 2 minutos, seguido de 30 ciclos a 94 ° C durante 30 segundos, 60 ° C durante 30 segundos y 72 ° C durante 30 segundos. El gen de la actina se utilizó como control interno.
Inmunofluorescencia La tinción
El FETα /vector y células /DNRII FETα fueron cultivadas a 70-80% de confluencia en cubreobjetos de vidrio. Se lavaron con PBS y se fijaron en metanol enfriado en hielo durante 5 minutos. Las células fijadas se permeabilizaron con 0,1% de Tween 20 en PBS y se bloquearon para la unión no específica con 10% de suero normal de cabra en PBS durante 30 minutos a 4 ° C. Las células fueron incubadas con el anticuerpo anti-VEGFA primario (dilución 1:50, Santa Cruz Biotechnology) durante la noche a 4 ° C, seguido de incubación en la hora for1 oscuridad a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario conjugado con Dylight488-anti-IgG de conejo (dilución 1:400, Jackson ImmunoResearch Laboratories). Las células teñidas se montaron en medio con DAPI (Vector Labs) de montaje Vectashield y Hardset imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia.
Muestras de Tejido
parafina fijo embebidos (FFPE) los bloques de tejido
formalina de los tumores primarios de ratones portadores de células FETα /DNRII FETα /vector y se han descrito anteriormente [2]. FFPE bloques de colon humano normal extirpado por razones distintas de malignidad y los adenocarcinomas de colon que contiene invasoras se obtuvieron de los archivos del Departamento de Patología y Microbiología de la Universidad de Nebraska Medical Center (UNMC). Las edades de todos los pacientes estaban entre los 55 y 85 años, con material procedente de los hombres y las mujeres. Los pacientes con cáncer no recibieron la terapia contra el cáncer antes de la extirpación quirúrgica del tumor
.
El estudio se realizó con la aprobación del comité de ética (Institutional Review Board) de UNMC. El tejido utilizado para el estudio se obtuvo de exceso de material que queda en el bloque de parafina después de la emisión del diagnóstico patológico. El formulario de consentimiento utilizado en la cirugía UNMC incluye una disposición que permite el uso de exceso de material con fines de investigación. Cada formulario se encuentra en los archivos del Departamento de Patología y Microbiología y fue revisado antes de la experimentación. Por lo tanto, el comité de ética renunciado a la necesidad de consentimiento adicional por escrito de los participantes.
La inmunohistoquímica (IHC) tinción
Cuatro secciones de tejido micrómetros de espesor fueron cortadas y dewaxed en Histoclear durante 15 minutos y después se rehidratan utilizando 100%, 95% y 70% de alcohol graduado durante 5 minutos, respectivamente. Antígeno para la recuperación pSmad2 se realizó utilizando Novocastra, recuperación del epítopo soluciones a pH 6.0 (Leica). La incubación con el anticuerpo primario anti-pSmad2 (dilución 1:200, Millipore) seguido de NovoLink Polymer (Leica) se utilizó para detectar la fosforilación de Smad2. Antígeno para la recuperación VEGFA y CD31 se realizó con tampón Tris-EDTA a pH 9,0. Para detectar VEGFA y expresión CD31, anticuerpo anti-VEGFA (dilución 1:50, Santa Cruz) y anti-CD31 de anticuerpos (1:100 dilución, Abcam) se incubaron durante la noche a 4 ° C, seguido de incubación con una cabra HRP conjugado anti-anticuerpo secundario de conejo (dilución 1:300, Jackson Laboratories) para VEGFA y con un polímero marcado con HRP anti-conejo (DAKO) para CD31. Para neutralizar la peroxidasa endógena, Dako Dual endógena Enzyme Block (DAKO) se utilizó para VEGFA y CD31 mientras Novocastra peroxidasa Block (Leica) se utilizó para pSmad2. Las láminas fueron desarrolladas utilizando el kit de cromógeno DAB (Dako) seguido de contra-tinción con hematoxilina. Las láminas fueron montados con Permount (Fisher Scientific) y se sometió a exámenes microscópicos. densidad de tinción se midió y cuantificó con ImagePro más 7,0 software utilizando 20 × 40 × o imágenes.
Resultados
señalización de TGF-beta inhibe la expresión VEGFA en células de cáncer de colon
Examen de expresión VEGFA en un panel de células de cáncer de colon se indica que las líneas celulares con el tipo silvestre TGF-beta RII (CBS, GEO y el FET [7]) expresaron niveles más bajos de VEGFA que aquellos con mutante TGF-beta RII (RKO, C, HCT116 [7]) (Fig. 1A, panel izquierdo), lo que sugiere una relación inversa entre la señalización de TGF-beta y la expresión VEGFA. Re-expresión del tipo salvaje RII TGF-beta en HCT116, una de las líneas de células con mutante TGF-beta RII, condujo a la reducción de expresión VEGFA (Fig. 1A, panel derecho). Para determinar directamente si la señalización negativamente TGF-beta regula la expresión de VEGFA, las células FET se trataron con 4 ng /ml de TGF-beta. Como se muestra en la Figura 1B, exógeno TGF-beta redujo la expresión de VEGFA en una manera dependiente del tiempo, con una reducción significativa después de 24 horas de tratamiento TGF-beta. SB525334, un potente inhibidor de receptor de tipo I (RI) de quinasa de TGF-beta, se utilizó para confirmar el efecto de la TGF-beta. El tratamiento de células con SB525334 FET revirtió el efecto inhibidor de TGF-beta en la expresión de VEGFA (Fig. 1C). Para confirmar aún más el efecto supresor de TGF-beta en la expresión de VEGFA, un negativo TGF-beta dominante RII (DNRII) se introdujo en células FETα abrogar endógeno señalización de TGF-beta, que se muestra por la reducción de Smad2 y la fosforilación Smad3 (pSmad2 & amp; pSmad3; Fig. 1D, panel izquierdo). En consecuencia, la expresión de VEGFA fue significativamente mayor en las células DNRII en comparación con las células de control de vector (Fig. 1D, panel izquierdo). La tinción de inmunofluorescencia de VEGFA confirmó higer expresión de VEGFA en células FETα /DNRII que en las células /vector FETα (Fig. 1D, panel derecho).
(A) análisis de transferencia de Western de la expresión de VEGFA en diferentes líneas celulares de cáncer de colon y las células HCT116 re-expresión de TGF-beta RII. (B y C) células FET se cultivaron hasta 50% de confluencia y se trataron con 4 ng /ml de TGF-beta1 para los períodos de tiempo indicados (B) o con 4 ng /ml de TGF-beta1 en presencia o ausencia de 200 nM SB525334 para 48 horas (C). Western blot análisis se realizaron con un anticuerpo anti-VEGFA para detectar la expresión VEGFA. β-actina se utilizó como control de carga. (D) Western blot (panel izquierdo) y inmuno-tinción (panel derecho) el análisis de la expresión de VEGFA en FETα /vector y las células /DNRII FETα. La fosforilación de Smad2 y Smad3 (pSmad2 & amp; pSmad3) se muestra para indicar la activación de Smad (panel izquierdo) guía empresas
TGF-beta inhibe la expresión VEGFA a nivel post-transcripcional
A. determinar cómo TGF-beta suprime la expresión VEGFA, la expresión de ARNm de VEGFA se determinó en células FET tratados con TGF-beta para diferentes períodos de tiempo. RT-PCR resultados mostraron que los niveles de mRNA VEGFA se mantuvo sin cambios después del tratamiento de TGF-beta para un máximo de 48 horas (Fig. 2A, panel superior). La cuantificación de los experimentos repetidos confirmó la observación (Fig. 2A, panel inferior). Estos resultados indican que el TGF-beta regula la expresión de VEGFA en el nivel post-transcripcional. Uno de los posibles mecanismos de regulación post-transcripcional es el de la estabilidad de la proteína. Para determinar si la señalización de TGF-beta regula la estabilidad de la proteína de VEGFA, cicloheximida (CHX) se añadió a las células FET para inhibir la síntesis de proteínas, mientras que se trataron con TGF-beta. En estas condiciones, los niveles de VEGFA disminuyeron más rápidamente en TGF-beta-muestras tratadas que en las muestras de control (Fig. 2B, panel superior). La cuantificación y la normalización de la intensidad de las bandas VEGFa con la de las bandas de actina correspondientes claramente mostraron que el tratamiento de TGF-beta reduce la vida media de la proteína VEGFA (Fig. 2B, panel inferior), lo que indica que el TGF-beta regula la estabilidad de proteínas VEGFA . Para diseccionar el mecanismo subyacente, un inhibidor del proteasoma, MG132, o inhibidor de E1 ubiquitina, PYR41, fue utilizado para tratar las células FET junto con TGF-beta. Como se muestra en la Figura 2C, ya sea MG132 o PYR41 prevenir la supresión mediada por TGF-beta de expresión VEGFA. Estos resultados sugieren que la señalización de TGF-beta disminuye VEGFA estabilidad de la proteína a través de la ubiquitinación y la degradación. Células FET
(A) se cultivaron hasta 50% de confluencia y se trataron con 4 ng /ml de TGF-beta1 para los períodos de tiempo indicados. RT-PCR se realizó como se describe en
Materiales y Métodos
(panel superior). La intensidad de cada banda de VEGFA mRNA se cuantificó y se normalizó con la de la banda de actina correspondiente. Los valores son medias ± S. E. a partir de experimentos por triplicado (panel inferior). (B) Análisis de transferencia Western de la expresión de VEGFA se realizó en los puntos de tiempo indicados en las células tratadas con FET 100 mg /ml de cicloheximida (CHX), solos o CHX y TGF-beta juntos (panel superior). La intensidad de cada banda de VEGFA se cuantificó y se normalizó con la de la banda de actina correspondiente (panel inferior). (C) Análisis de transferencia Western de la expresión de VEGFA en células FET tratados con TGF-beta solo, TGF-beta con MG132 (10 M) o TGF-beta con PYR41 (15 M). (D) Expresión de Smad2 y Smad3 en las células FET con control de vector vacío (CTR), Smad2 shRNA (Sh-S2) o Smad3 shRNA (Sh-S3) se muestra en el panel izquierdo. La fosforilación de Smad2 y Smad3 y la expresión de VEGFA en células anteriores tratados con 4 ng /ml de TGF-beta se muestran en el panel derecho. (E) La expresión de PKACatα en las células FET con control de vector vacío (CTR) o PKACatα shRNA (Sh-PKA) se muestra en el panel izquierdo. VEGFA expresión en células anteriores tratados con 4 ng /ml de TGF-beta durante 48 horas se muestra en el panel derecho.
señalización de TGF-beta está mediado predominantemente a través de la activación de Smad. Sin embargo, la señalización de TGF-beta-Smad independiente también se ha informado en diferentes tipos de células [23], [24]. Para determinar si la inhibición mediada por TGF-beta de expresión VEGFA es Smad dependiente o -independiente, Smad2 y Smad3 se derribaron individualmente en células FET por shRNAs específico para Smad2 o Smad3. Expresión de Smad2 o Smad3 se redujo de manera eficiente y específicamente en Smad2 o Smad3 desmontables células (Fig. 2D, panel izquierdo). Como resultado, los aumentos en pSmad2 o pSmad3 por tratamiento de TGF-beta fueron abolidos en Smad2 o Smad3 desmontables células, respectivamente (Fig. 2D, panel derecho). El análisis de transferencia Western indicó que la inhibición de la expresión de la proteína VEGFA por TGF-beta fue revertido parcialmente en las células Smad3 desmontables mientras que desmontables de Smad2 tenían poco efecto (Fig. 2D, panel derecho). Estos resultados indican que el TGF-beta suprime la expresión de VEGFA de una manera dependiente de Smad3 y Smad2-independiente. La inversión parcial de la supresión mediada por TGF-beta de expresión VEGFA en desmontables células Smad3 se puede atribuir a silenciamiento incompleta de expresión Smad3 en aquellas células o la existencia de un mecanismo de Smad3-independiente.
Como se muestra anteriormente, TGF -beta regula XIAP regulación a la baja a través de una vía mediada por PKA [25]. A continuación se determinó si PKA está involucrada en la regulación de la expresión VEGFA por TGF-beta. La expresión de la PKA subunidad catalítica α (PKACatα) fue derribado por un shRNA específica en células FET (Fig. 2E, panel izquierdo). Como resultado, la inhibición mediada por TGF-beta de expresión VEGFA fue casi completamente abrogada en esas células (Fig. 2E, panel derecho). Tomado junto con la observación de que la activación de PKA es Smad3 dependiente de [25], estos resultados indican que el TGF-beta /señalización Smad3 /PKA regula regulación a la baja de la expresión de VEGFA en células de cáncer de colon.
señalización de TGF-beta inhibe VEGFA expresión y suprime la angiogénesis tumoral in vivo
VEGFA es un regulador clave de la formación de vasos sanguíneos y juega un papel importante en la angiogénesis, lo que contribuye al desarrollo y progresión tumoral. Hemos demostrado anteriormente que la señalización de TGF-beta inhibe la expresión de VEGFA (Fig. 1B). Desde TGF-beta actúa como un supresor de la metástasis en células de cáncer de colon [12], se examinó si la supresión de la expresión de VEGFA por TGF-beta contribuye a la función de supresión de metástasis de TGF-beta. Utilizamos FETα /vector y el modelo de células FETα /DNRII se describe anteriormente [12] para abordar esta cuestión. expresión VEGFA era mucho mayor en las células /DNRII FETα que la de las células /vector FETα
in vitro
debido a la derogación de la señalización de TGF-beta (Fig. 1D). Como se indica anteriormente, las células FETα /DNRII observó una elevación significativa potencial metastásico en comparación con células /vector FETα en un modelo ortotópico
in vivo
[12]. secciones de tumores primarios preparados a partir de cada ratón ortotópicamente transplantado con FETα /vector o células /DNRII FETα se examinaron para la señalización de TGF-beta. Desde FETα células expresan tanto Smad2 y Smad3 (datos no mostrados), Smad2 fosforilación fue utilizado como un indicador para activa TGF-beta /Smad2 /3 de señalización. IHC analiza usando un anticuerpo anti-fosfo-Smad2 (anti-pSmad2) de anticuerpos mostró que la fosforilación Smad2 nuclear se redujo significativamente en los tumores primarios de células FETα /DNRII en comparación con los de las células /vector FETα (Fig. 3A, panel izquierdo). La cuantificación de la densidad de tinción de pSmad2 nuclear en múltiples muestras indicó que la señalización de TGF-beta se inhibió en los tumores de células /DNRII FETα en alrededor de 40% (Fig 3A, panel derecho, *
P
. & Lt; 0,001) . Para determinar si la señalización de TGF-beta suprime la expresión VEGFA
in vivo
, se analizó la expresión de VEGFA en los tumores primarios que utilizan análisis IHC. Los resultados mostraron que la expresión de VEGFA fue mucho mayor en los tumores de células /DNRII FETα que las de las células de control (Fig. 3B, panel izquierdo). La cuantificación de la densidad de tinción de VEGFA en múltiples muestras indicó que la expresión de VEGFA se incrementó en más de dos veces en estos tumores (Fig 3B, panel derecho, *
P
. & Lt; 0,001), lo que confirma el papel de supresión de TGF-beta en la expresión VEGFA
in vivo
. Para determinar si la expresión VEGFA tiene consecuencias biológicas
in vivo
, A continuación analizaron la formación de microvasos dentro de los tumores utilizando un anticuerpo anti-CD31. CD31 es un marcador de las células endoteliales de los vasos sanguíneos. En los tumores de células FETα /DNRII, la densidad de microvasos fue de más de 3 veces mayor que la observada en las muestras de control (Fig 3C, *
P
. & Lt; 0,001). Estos resultados indican que la inhibición de la señalización de TGF-beta conduce a la expresión elevada VEGFA, que contribuye al aumento de la angiogénesis. Tomados en conjunto con los resultados de aumento del potencial metastásico de las células /DNRII FETα en el modelo ortotópico, nuestros estudios sugieren que la señalización de TGF-beta suprime mediada por VEGFA la angiogénesis y la progresión tumoral.
Imágenes representativas de IHC tinción de fosfo Smad2 (a), VEGFA (B) y CD31 (C) en los tumores primarios de FETα /vector y las células FETα /DNRII (paneles de la izquierda). densidad de tinción se midió y cuantificó con ImagePro más 7,0 software utilizando 20 × 40 × o imágenes (paneles de la derecha). Cuatro animales fueron analizados para cada tipo de células. Quince a veinte campos histológicamente similares fueron seleccionados al azar de cada diapositiva para el análisis de la densidad de tinción. Los datos se presentan como la media ± SE.
Los valores P se calcularon utilizando
Estudiante de
t-test
. *
P
. & Lt; 0,001
La expresión de VEGFA se correlaciona inversamente con la señalización de TGF-beta en el adenocarcinoma de cáncer de colon humano
Lo anterior
in vitro
y
in vivo
resultados demuestran que el TGF-beta regula negativamente la expresión VEGFA en líneas celulares de cáncer de colon humano. A continuación examinó si existía alguna correlación entre la señalización de TGF-beta y la expresión VEGFA en los adenocarcinomas de colon humano. Secciones preparadas a partir de 10 colon normal y 24 pacientes de cáncer de colon individuales se examinaron para activa la señalización de TGF-beta y la expresión de VEGFA. Desde Smad2 y Smad3 rara vez son mutados en el cáncer de colon [26], la fosforilación Smad2 se utilizó en este estudio para indicar activa TGF-beta /Smad2 señalización /3. de colon humano normal mostraron tinción nuclear fuerte y distinta de la fosforilación Smad2 y tinción débil de VEGFA en las células epiteliales de las criptas mientras que las células epiteliales malignas en los casos de adenocarcinoma muestran en más débil y difusa tinción para la fosforilación de Smad2 y fuerte tinción para VEGFA por análisis de IHC ( Fig. 4A). La Figura 4B muestra la cuantificación de la densidad de tinción de la fosforilación de Smad2 nuclear y la expresión de VEGFA de muestras de pacientes individuales. En general, las células epiteliales del colon normales muestran mayor fosforilación nuclear de Smad2 y una menor expresión VEGFA que los adenocarcinomas, apoya la opinión de que la expresión de VEGFA se correlaciona inversamente con la señalización de TGF-beta en el adenocarcinoma de colon humano.
Las secciones preparadas a partir de 10 de colon normal y 24 muestras de pacientes con cáncer de colon individuales se tiñeron utilizando anticuerpos anti-fosfato Smad2 y anti-VEGFa. (A) Imágenes representativas de IHC tinción de fosfato Smad2 y VEGFA en muestras de cáncer de colon y de colon normales. se midió (B) la densidad de tinción y se cuantificó con ImagePro más 7,0 Software utilizando 40 × imágenes en cada muestra. muestras de colon normales están representados por las plazas y las muestras de cáncer de colon por triángulos. Las barras representan valores medios de cada grupo de muestras.
Los valores P se calcularon utilizando
Estudiante de
t-test
. *
P
. & Lt; 0,001
Discusión
señalización de TGF-beta se ha demostrado que suprime la formación de tumores y metástasis en un subconjunto de células de cáncer de colon a través de muchos diferentes mecanismos que incluyen la inhibición de la proliferación celular y la inducción de la apoptosis [4], [12], [25], [27]. La capacidad de las células malignas para resistir presiones ambientales, en particular los relacionados con la metástasis, se considera un factor clave en el desarrollo y progresión del tumor [28]. Desde restricción del medio ambiente en el crecimiento es muy común en tumores sólidos tales como carcinoma de colon, un mecanismo que permite el aumento de la angiogénesis para proporcionar suficientes nutrientes y oxígeno sería muy ventajoso para las células malignas y mejorar su capacidad de supervivencia aberrante. VEGFA es un potente factor angiogénico que juega un papel esencial en el cáncer. Las células tumorales secreto VEGFa para inducir la vasculatura para desarrollar, lo que permite un suministro suficiente de oxígeno y nutrientes [14]. Por lo tanto, VEGFA podría ser un objetivo potencial para la terapia del cáncer. Hemos demostrado previamente que el escape de la apoptosis mediada por TGF-beta en células de cáncer de colon contribuye a su mayor capacidad de supervivencia y el aumento de potencial metastásico
in vivo
[12]. Mostramos aquí que, además de inducir la apoptosis, la señalización de TGF-beta también puede inhibir la expresión de VEGFA y, como consecuencia, la angiogénesis en el cáncer de colon células
in vivo
y que la derogación de TGF-beta permite la expresión incrementada VEGFA y la angiogénesis, lo que podría facilitar el crecimiento del tumor y el desarrollo de metástasis. Por otra parte, una relación inversa entre la señalización de TGF-beta y la expresión de VEGFA también se observa en muestras de cáncer de colon humano, lo que indica la importancia de los estudios de cáncer humano. Por lo tanto, el efecto inhibidor de TGF-beta en la expresión de VEGFA y la angiogénesis proporciona otra base mecánica importante y novedoso para el tumor de TGF-beta y la función metástasis supresor.
Aunque la expresión de VEGFA puede ser regulada a nivel transcripcional por HIF1α [19], su regulación por el TGF-beta es a nivel post-transcripcional (Fig. 2A). Nuestros resultados indican que el tratamiento de TGF-beta redujo la estabilidad de la proteína a través de VEGFA ubiquitinación y la degradación (Fig 2B & amp;. 2C). Por otra parte, la disminución mediada por TGF-beta en la expresión VEGFA se produce a través de un PKA- y Smad3-dependiente y Smad2-independiente vía (figura 2D & amp;. 2E). Se ha demostrado que la activación de PKA por TGF-beta implica Smad3 pero no Smad2 y que la activación de PKA promueve la degradación de proteínas a través de la ubiquitinación [25]. Por lo tanto, es posible que el TGF-beta media la degradación VEGFA través de la vía Smad3 /PKA. Este es un nuevo mecanismo por el que la expresión de VEGFA está regulada por la señalización de TGF-beta. Más estudios serán necesarios para determinar el mecanismo subyacente
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de alta frecuencia de mutación y Smad4 inactivación está estrechamente asociado con el aumento de metástasis y mal pronóstico en el cáncer de colon [29], [30]. A pesar de que el TGF-beta señalización actúa como un supresor de tumores en un subconjunto de las células del cáncer de colon (es decir, FET, GEO y CBS, etc.) que expresan de tipo salvaje Smad4 [4], [10], [11], Smad4 independiente de TGF-beta de señalización se ha demostrado que la promoción de la metástasis del cáncer de colon [31]. Se ha informado de que el TGF-beta induce la expresión de VEGF en células de cáncer de colon Smad4 nulos [32], lo que sugiere que la activación de Smad4-independiente vías (es decir, MEK-Erk y p38-MAPK, etc.) está implicado en TGF-beta mediada la sobre regulación de la expresión de VEGF, que puede cooperar con otras vías pro-oncogénicos para promover la metástasis. Por lo tanto, el efecto contrario del TGF-beta en la expresión VEGFA podría contribuir a su papel diferencial como supresor de tumores o promotor de tumores en el contexto de células diferentes.
En resumen, hemos identificado un nuevo mecanismo por el cual suprime TGF-beta expresión VEGFA, la angiogénesis y la metástasis en un subconjunto de células de cáncer de colon.