Extracto
Objetivos
Este estudio tuvo como objetivo observar los cambios en la angiogénesis tumoral después lipiodol climatizada (60 ° C) a través de la infusión de la arteria hepática en un modelo de conejo de cáncer de hígado VX2.
Materiales y Métodos
Veinte conejos con tumores hepáticos VX2 fueron divididos aleatoriamente en 2 grupos (10 conejos en cada grupo). Bajo anestesia, se realizó una infusión arterial hepática trans-catéter, y lipiodol (37 ° C; grupo control) o lipiodol calentada (60 ° C; grupo tratado) se inyectó en las arterias hepáticas de los animales. A continuación, los cambios en la angiogénesis tumoral se evaluaron utilizando los siguientes marcadores y métodos. 1. vascular de crecimiento endotelial del receptor del factor (VEGFR) y la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) niveles en el tumor se evaluaron mediante transferencia Western y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (PCR). antígeno nuclear (PCNA) 2. expresión de células que proliferan en el tumor se evaluó mediante tinción inmunohistoquímica. 3. Se observaron los cambios morfológicos en las células endoteliales vasculares del tumor mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM).
Resultados
VEGFR y el ARNm de VEGF y los niveles de expresión de proteínas se redujeron en el grupo tratado en comparación con el grupo de control. proteína PCNA demostraron una reducción de los niveles de expresión en el grupo tratado comparado con el grupo control. La MET indicó que el retículo endoplásmico de las células endoteliales se expandió, la chondriosome estaba hinchado y las microvellosidades de las células endoteliales se redujeron después de la infusión lipiodol climatizada.
Conclusiones
La angiogénesis tumoral de conejos con cáncer VX2 se inhibió después de la infusión arterial lipiodol climatizada en comparación con la infusión lipiodol
Visto:. Cao W, X Xu, Zhang J, Duan Y (2013) la angiogénesis tumoral después climatizada lipiodol infusión a través de la arteria hepática en un modelo de conejo de VX2 cáncer de hígado . PLoS ONE 8 (4): e61583. doi: 10.1371 /journal.pone.0061583
Editor: Gayle E. Woloschak, Universidad de Northwestern Feinberg School of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 6 de diciembre de 2012; Aceptado: 11 de marzo de 2013; Publicado: 24 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Cao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (N ° 81170400; http://www.nsfc.gov.cn) y Proyección provincia de Shaanxi Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (No.2011K13-01-16; http: //www.sninfo.gov.cn). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
transcatéter quimioembolización (TACE) ha sido aceptada como una de las formas más eficaces para el tratamiento paliativo de pacientes en el medio y las últimas etapas de carcinoma hepatocelular (HCC), así como para aquellos que no son buenos candidatos para la cirugía en los países asiáticos, incluyendo china [1], [2], [3]. Sin embargo, la supervivencia a largo plazo después de un procedimiento de TACE no es satisfactorio; la tasa de supervivencia de cinco años en la actualidad oscila entre el 9% y el 32% [4], [5]. TACE puede reducir el tamaño del tumor [6], [7]. Sin embargo, otros estudios han encontrado TACE a ser insatisfactorio porque la angiogénesis tumoral puede aumentar después de TACE, y sólo una pequeña proporción de los HCC se sometió completa necrosis [8]. Por lo tanto, la inhibición de la angiogénesis del tumor después de la terapia TACE puede ser una estrategia prometedora para mejorar la eficacia del tratamiento
.
Recientemente, algunos estudios han utilizado termoterapia para suprimir el crecimiento tumoral en el [9] hígado y han comprobado que el tratamiento con lipiodol en 60 ° C prolonga la supervivencia de los conejos con cáncer VX2 mediante la inhibición de crecimiento del tumor. Además, este tratamiento afecta a los niveles de AST en suero similares a Lipiodol a 37 ° C [10]. Los estudios in vivo también han demostrado que la infusión de solución salina se calienta a través de la arteria hepática puede alterar la permeabilidad vascular tumor al afectar los niveles de expresión de VEGF o VEGFR [11], [12] debido a que estas dos proteínas son dos factores importantes relacionados con la angiogénesis del tumor [13 ], [14]. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue observar los cambios en la angiogénesis tumoral y analizar las causas subyacentes después de trans-hepática, arterial, se calentó (60 ° C) embolización lipiodol través de la arteria hepática en un modelo de conejo de cáncer de hígado VX2.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el protocolo aprobado por nuestro cuidado de los animales y el uso comité institucional (2.010.038) y de conformidad con las directrices institucionales.
Modelos animales
Veinte conejos blancos de Nueva Zelanda machos fueron seleccionados (con un peso promedio de 3,0-3,5 kg, 3,2 ± 0,2 kg) al azar desde el centro animal de experimentación de nuestra universidad. células de carcinoma VX2 se mantuvieron como una línea de tumor en nuestro laboratorio.
Los conejos fueron anestesiados con pentobarbital sódico por vía intravenosa (25 mg /kg). A continuación, los pelos más de la región abdominal de los conejos fueron removidos con sulfuro de sodio 8%, y la región se limpió con solución salina. Una suspensión de tejido tumoral de VX2 (aproximadamente 1,5-2 × 10
6 células) se inyectó a través de una aguja de calibre 18 en el lóbulo izquierdo del hígado por vía percutánea guiada por ecografía. La herida se mantiene estéril, y los signos vitales de conejo (especialmente la tasa de respiración) estaban estrechamente monitoreado durante la implantación. A continuación, se inyectaron antibióticos (gentamicina 2,5 mg /kg) por vía intramuscular después de la implantación. Los animales fueron observados por la ecografía (Acuson Corp., EE.UU.) hasta que los tumores alcanzaron 2 cm de diámetro y luego se utilizaron para la experimentación. La ecografía se realizó por el mismo operador con una sonda 7v3c a una frecuencia de 7,0 MHz.
Experimental Agrupación
Veinte conejos portadores de tumores se dividieron al azar en 2 grupos (n = 10 por grupo) ; se le dio a cada grupo una de las dos preparaciones.
El grupo de control recibió una preparación de lipiodol (Aulnay Sous-Bios, Francia) a temperatura fisiológica (37 ° C).
El grupo de tratamiento recibió una preparación obtenida por lipiodol calentamiento a 60 ° C con una incubadora de temperatura constante.
arterial Cateterización
se realizó una incisión en los conejos anestesiados para exponer su arteria femoral derecha. Entonces, un micro-catéter (2,7 /2,9 Fr reposicionable Tipo, Terumo, Japón) se insertó en la arteria femoral y se coloca en la arteria hepática bajo fluoroscopia.
A continuación, bajo fluoroscopia, la preparación de perfusión (1 ml /cuerpo) para cada grupo fue gradualmente a mano a inyectar en la arteria hepática, con gran cuidado para mantener la punta del catéter en la arteria hepática y evitar el flujo de salida de la preparación. Después de la inyección intra-arterial, se retiró el catéter, la arteria femoral se ligó, y la herida se cerró operativa. Los signos vitales del conejo, especialmente su tasa de respiración, estaban estrechamente vigilados durante el procedimiento de angio-. DSA imágenes de la tinción de tumor en el hígado VX2 fueron adquiridos antes y después de la infusión.
Animales
Sacrificio A las 24 horas después de la infusión de preparación, los animales fueron sacrificados con una sobredosis de hidrato de cloral.
La inmunohistoquímica
muestras de tejido tumoral de cada conejo se fijaron en formalina al 10% tamponada neutra e incluidos en parafina. A continuación, se cortaron rodajas de 3 a 5 micras de espesor y se procesaron para la tinción inmunohistoquímica.
Para detectar la expresión y localización de la proteína PCNA en los tejidos tumorales, las secciones de la muestra se incubaron durante la noche a 4 ° C con una anticuerpo monoclonal de ratón anti-PCNA (Abcam, Cambridge, Reino Unido) y luego con un anticuerpo secundario anti-ratón (Dako) durante 30 min a temperatura ambiente, después de lo cual las reacciones de unión se visualizaron con sustrato 3-30-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB) . Los núcleos fueron ligeramente contraste con hematoxilina. La tinción inmunohistoquímica se evaluó por 2 patólogos en una forma ciega. La sección completa de cada diapositiva se examina bajo el microscopio óptico. Los niveles de proteína PCNA se clasificaron en cuatro grupos: 0, sin manchas; 1+, tinción citoplásmica en menos de 10% de las células; 2 +, tinción citoplásmica en 10-50% de las células; y 3+, tinción citoplásmica en más de 50% de las células
cuantitativa en tiempo real de la polimerasa reacción en cadena de
El tumor se recogieron muestras y se almacenan en RNAwait (Applygen, Beijin, China) a. - 70 ° C después de que los conejos fueron sacrificados. ARN total fue aislado de las muestras con el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), y el ADNc se sintetizó a partir 1 g de ARN total con el primer Strand-Kit de Síntesis de ADNc (Toyobo, Osaka, Japón). Los cebadores de oligonucleótidos para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fueron diseñados como sigue: VEGF, 5'-GCAGAAGAAGGAGACAATAAACC-3 'y 5'-GCACGCAGGAAGGCTTGAATA-3'; VEGFR 5'-CCAGGGAGAAGCAGAGCCAC-3 'y 5'-TGCCAATACCAGCGGATGTG-3'; y β-actina, 5'-CGAGATCGTGCGGGACAT-3 'y 5'-CAGGAAGGAGGGCTGGAAC-3'. Las reacciones de PCR se realizaron por triplicado utilizando SYBR Green PCR en tiempo real mezcla maestra (Toyobo). Los niveles relativos de expresión de ARNm de VEGF se cuantificaron utilizando el 2
-ΔΔCt método [15].
Western Blot
Las muestras se lisaron en tampón de lisis enfriado con hielo (EDTA 2 mM , mM EGTA 10, 0,4% NaF, 20 mM Tris-HCl, 1% NP-40, 1% de Triton X-100, inhibidores de la proteasa, pH 7,5) usando un homogeneizador de vidrio. Las concentraciones de proteína se midieron usando el ensayo de proteínas de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce, Rockford, IL). Las proteínas se separaron por electroforesis en dodecilsulfato de sodio en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa Hybond ECL (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Western blot análisis se realizaron con un anti-VEGFR anticuerpo (Abcam, Cambridge, Reino Unido) y un anticuerpo anti-VEGF (Santa Cruz, CA, EE.UU.), y se utilizó un anticuerpo anti-β-actina como control interno. A continuación, las muestras se incubaron con una peroxidasa de rábano picante especies de concordancia (HRP) conjugado con anticuerpo secundario. Las transferencias se desarrollaron con una solución de sustrato de quimioluminiscencia (Pierce, Rockford, IL) y se expusieron a película de rayos X. Los IDVs se calcularon usando un sistema de análisis de imágenes computarizado (Fluor Chen 2,0) y se normalizó a la expresión de β-actina.
Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM)
Después se obtuvieron los tejidos tumorales , se seleccionaron las fracciones de microvasos crudo aislados del tejido tumoral y dividido en 1 mm
3 pedazos y se fijaron con 2,5% de glutaraldehído-4% de paraformaldehído durante varios días a 4 ° C. Luego, utilizando procedimientos estándar, semi-delgadas secciones y ultra-delgadas se prepararon y tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo, y se observaron cambios en las células endoteliales vasculares del tumor mediante TEM (JEM-1200EX, Jeol, Tokio, Japón).
análisis estadísticos
Todos los resultados se indican como la media ± desviación estándar para cada grupo. Se realizó la prueba t de Student para comparar los dos grupos, y se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para comparar los niveles de proteína PCNA entre los grupos. Un valor de p menor de 0,05 fue considerado significativo. Los análisis estadísticos se realizaron con SPSS 16.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.).
Resultados
Imagen DSA
Después de la embolización, el hígado imágenes de DSA los conejos en el lipiodol (60 ° C) grupo mostró opacidad contorneada en la región del tumor, una señal de oclusión completa de la vasculatura del tumor, y los vasos normales proximales de los conejos todavía permanecen patente (Fig. 1).
los tumores mostraron hipervascularidad en el hígado tal como se determina con imágenes DSA (a, flecha negro). Después de la inyección lipiodol (60 ° C), los tumores son totalmente o en gran parte de vascularizado y muestran el DSA como un defecto lipiodol de llenado (B, flecha negro).
Los hallazgos inmunohistoquímicos
inmunohistoquímico análisis revelaron que la expresión de proteínas PCNA se detectó principalmente en las células tumorales viables VX2 (Fig. 2). Se encontró que los niveles de expresión de PCNA en el grupo tratado fueron más bajos que en el grupo control (Tabla 1)
Como detectado a través de inmunohistoquímica, se detectó expresión de la proteína PCNA principalmente en las células tumorales viables (VX2 marrón;. A, control de 400 ×;.. B, tratados × 400)
cuantitativa en tiempo real PCR y Western Blot resultados
Como detectado por cuantitativa en tiempo real PCR (figura 3) , los niveles de VEGF y de ARNm de VEGFR en el grupo tratado fue significativamente menor que en el grupo control. Los análisis de transferencia de Western mostró que los niveles de expresión de la proteína VEGF y VEGFR en el grupo tratado también fueron significativamente más bajos que en el grupo control (Fig. 3).
Los cambios relativos en VEGFR o proteína VEGF y los niveles de mRNA en el tejido tumoral se detectaron después del tratamiento en cada grupo (n = 10). A y B. VEGFR mRNA y los niveles de expresión de VEGF se evaluó mediante PCR en tiempo real cuantitativa como se describe en la sección Materiales y Métodos. C y D. VEGFR y los niveles de proteína VEGF se detectaron usando análisis de transferencia de Western (panel superior). β-actina se detectó como control de carga. los niveles de expresión de VEGF y VEGFR se cuantificaron mediante densitometría y se representan en el pliegue del cambio (panel inferior). Los valores se presentan como la media ± DE de 3 experimentos independientes (*
P
. & Lt; 0,05
vs grupo control
).
resultados TEM revelaron que la perfusión lipiodol climatizada indujo el retículo endoplásmico de las células endoteliales vasculares para ampliar y la chondriosome a hincharse, y se redujeron las microvellosidades de las células endoteliales (Fig. 4).
Estimulado por climatizada ( 60 ° C) de perfusión lipiodol, TEM resultados revelaron que las microvellosidades de las células endoteliales del tumor disminuyó (A, 5000 ×), la célula endotelial vascular retículo endoplásmico se expandió, y la chondriosome estaba hinchado (B, 10000 ×).
Discusión
TACE para los tumores de-vascularización fue desarrollado en la década de 1970 [16]. En la actualidad, la TACE es el tratamiento primario más utilizado para los HCC no resecable y es también el tratamiento más ampliamente utilizado para los pacientes en lista de espera para un trasplante de hígado. TACE retrasa significativamente la progresión del tumor [17], pero algunos estudios han informado de un aumento en los niveles de VEGF en suero después de TACE [18]. Los altos niveles de VEGF 1-2 días después de TACE en los pacientes con HCC se asocian con metástasis a distancia y resultados desfavorables [19].
Lipiodol se ha utilizado como un portador de agentes anti-tumorales en quimioterapia dirigida para el carcinoma hepatocelular, y lipiodol no sólo se utiliza para emulsionar fármacos para TACE, pero también se utiliza como un agente de embolización para la embolización arterial trans-hepática y para el tumor de-vascularización [17]. Debido a que la expresión de la proteína VEGF en tumores puede responder al calor [11] y las células endoteliales vasculares del tumor viable son sensibles al calor lesiones [20], y el análisis de espectrometría de masas de fármaco mostró que el cisplatino no se ve afectada por el calor [21], y la doxorrubicina y mitomicina-C son también no degrada a temperaturas de 60 grados C [21], lipiodol climatizada como un nuevo agente embólico a través de la administración de la arteria hepática puede distribuir el calor y emulsionar drogas TACE convencionales (doxorrubicina, mitomicina-C, cisplatino) para todo el tumor y puede afectar los niveles de expresión de proteínas VEGF en el tumor o la vasculatura tumoral.
la prevención de la angiogénesis tumoral Después climatizada lipiodol inyección
Después de la inyección lipiodol climatizada, TEM reveló que la célula endotelial del tumor retículo endoplásmico se expandió, la chondriosome estaba hinchado, y se redujeron las microvellosidades de las células endoteliales, que son signos de daño de las células endoteliales. Estos signos, aunque indirecta, apoyan el efecto del calor sobre las células endoteliales en los tumores VX2; el lipiodol intra-arterial (60 ° C) inyecciones parecían resultar en la destrucción lecho capilar del tumor.
De hecho, aunque el calor es tóxico para las células endoteliales vasculares del tumor, el efecto preciso de calor en las células varía con el medida del calor y la duración. El calor intenso o prolongado puede alterar las proteínas intracelulares (tales como la desnaturalización del colágeno y lípidos bicapa descongelación) e inducir la muerte celular; si el calor es leve o de corta duración, puede causar una serie de cambios genéticos de adaptación en las células [22].
climatizada perfusión lipiodol puede no ser suficiente para inducir la muerte celular del tumor endotelial vascular, pero puede causar una serie de adaptación cambios genéticos proteínas o intracelulares tales como el cambio de la expresión de VEGFR en las células endoteliales vasculares del tumor. Debido a que el cambio de expresión VEGFR está estrechamente relacionado con los cambios de la morfología de las células endoteliales [23], se observó que los cambios morfológicos en las células endoteliales del tumor vascular por TEM después de la infusión lipiodol climatizada. Hemos observado la disminución de VEGF y VEGFR mRNA y los niveles de expresión de proteínas fue resultado de las respuestas tumorales y las células endoteliales en el procedimiento de perfusión lipiodol climatizada, respectivamente. El VEGF disminuido y los niveles de proteína VEGFR pueden ser atribuibles a la inhibición de la angiogénesis tumoral.
La prevención de crecimiento tumoral Después climatizada Lipiodol perfusión
Las temperaturas superiores a 42,5 ° C son eficaces en la supresión del crecimiento de células tumorales [24], pero si la temperatura se eleva más alto que 45 ° C, daño a las células normales del hígado se convierte en irreversible [24]. Mediante el conocimiento de la distribución no homogénea de los vasos sanguíneos, el enfriamiento del flujo sanguíneo del tumor y las diferencias de tamaño de tumor, se concluye que la temperatura de la lipiodol calienta el interior de los tumores debe ser al menos 43 ° C. En este estudio, en primer lugar, que poco a poco manuales en las siguientes inyecta bajo fluoroscopia para evitar el reflujo durante la perfusión, en segundo lugar, hemos utilizado el registrador de temperatura matemática percutánea para el control de la temperatura de la perfusión, por lo que la temperatura de la lipiodol caliente dentro de los tejidos del hígado no éramos más de 45 ° C durante la perfusión con calefacción, y en nuestro estudio de los vasos normales proximales de los conejos siguen siendo patentes observado por DSA después de la perfusión climatizada.
el uso de inmunohistoquímica, se observó una baja expresión de proteína PCNA en células tumorales después de la perfusión lipiodol climatizada. De acuerdo con nuestros datos, el tratamiento con PCNA 60 ° C lipiodol el crecimiento del tumor marcadamente inhibida en los conejos con carcinomas VX2 en comparación con los tratados con 37 ° C lipiodol.
Se ha informado de que la inhibición de la angiogénesis tumoral mejora anti-tumor eficacia [25]. Debido anoxémica células tumorales han demostrado ser más sensibles al calor que las células normales [26], [27] y el lipiodol calentado puede destruir el lecho capilar del tumor, el lipiodol calentado puede ser detenido en el tumor, y el calor puede ser distribuido a los capilares neogenetic de todo el tumor. Teóricamente, más calor puede penetrar en el espacio extracelular de las células tumorales para lograr un mayor efecto terapéutico. Los capilares tumorales más largos se mantuvieron en el rango de 43 ° C a 45 ° C, el efecto curativo más el calor tenía en tejidos tumorales, y luego resultan en la inhibición del crecimiento de la angiogénesis del tumor y células tumorales.
Limitaciones
a pesar de que se intentó aplicar un registrador de temperatura matemática percutánea para el monitoreo, no fuimos capaces de medir con precisión la temperatura del lipiodol calienta en todo el tumor. El cambio de viscosidad de lipiodol con el aumento de la temperatura y el impacto del cambio de viscosidad en el tumor como la modificación de biodistribución no fueron evaluados en nuestro estudio, pero se tratará en futuros estudios.
tumor VX2 es bien conocido para el desarrollo de necrosis cuales pueden alterar la tasa de neovascularización, así que en este estudio hemos seleccionado tumores VX2 (14 días después de la implantación) para el tratamiento experimental, porque los tumores VX2 en esta fase tienen un volumen de tumor relativamente grande, pero de necrosis tumoral pequeño y por lo tanto tienen menos efecto sobre la tasa de neovascularización [10], [28].
Conclusiones
inhibir eficazmente la angiogénesis tumoral después de TACE ha sido un tema de investigación durante algún tiempo. En este estudio, hemos encontrado que la disminución de VEGF y los niveles de proteína VEGFR pueden ser atribuibles a la inhibición de la angiogénesis tumoral en conejos con cáncer VX2 después arterial calentado infusión lipiodol, pero los beneficios clínicos de este enfoque es necesario una evaluación adicional, como el cambio de viscosidad lipiodol y la alteración biodistribución con el aumento de la temperatura, etc., deben ser considerados. Por lo tanto, este estudio podría en última instancia, facilitar la investigación preclínica, y creemos que la inyección lipiodol calentado puede tratar con eficacia los HCC avanzados o recurrentes.